La gosipitrina, un flavonoide natural, atenúa el daño neuronal y mitocondrial inducido por el hierro: parte 2

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2.5. Detección de complejos Gos-Fe(I)

Una hipótesis plausible para explicar los resultados anteriores es que el Gos forma un complejo transitorio con el Fe(ll) que facilita su oxidación por el oxígeno. Este complejo de transición podría entregar sus electrones más fácilmente que el citrato de Fe(), generando un complejo más estable con Fe(Ill). La Figura 6A muestra un espectro típico de Gos con absorción máxima a 276, 332 y 380 nm (línea negra). La adición de Fe() indujo una disminución dependiente de la concentración en los picos máximos de absorción y la aparición de uno nuevo cerca de 500 nm (Figura 6A). La aparición de una serie de espectros que se originaron en el espectro de Gos fue confirmada por la presencia de un punto isosbéstico en λiso=405 nm (ver puntos negros), lo que indica un equilibrio químico (complejización) entre Gos libre y complejado. El recuadro (Figura 6A) muestra la formación de un complejo con estequiometría 2:1 (Gos-hierro). La estequiometría de tales complejos de Gos-hierro se determinó mediante el método de Job que muestra un punto de ruptura en una relación molar de 0,5.

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Se obtuvo evidencia adicional sobre la correlación entre el hierro y el Gos mediante espectroscopia IR (Figura 6B). Para el Gos libre y su complejo de hierro, la banda ancha ubicada en el rango de 3000-4000 cm- se consideró como el estiramiento del hidrógeno- grupos hidroxilo enlazados debido a la presencia de moléculas de agua. El modo de estiramiento v(C=O) del Gos libre se produce en 1654 cm-I, que se ha desplazado hacia 1636 cm-I tras la formación del complejo. Este resultado sugiere que el Fe(Ⅱ) está correlacionado con el oxígeno del carbonilo [31]. Además, la presencia de la vibración de estiramiento v(Fe-O) a 630 cm-I corrobora la formación del complejo hierro-Gos, ya que el Gos libre no presenta tal banda.

Figura 6.(A) Efectos del Fe(II) en el espectro UV-VIS de Gos (200-600 nm). Mezcla de incubación que contiene sacarosa 125 mM, KCl 65 mM, tampón HEPES 10 mM (pH 7,2), citrato 2 mM y Gos 1,6 μM. Las concentraciones de Fe (I) de las trazas de arriba a abajo fueron {{12 }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64, 0.8, 0.96 y 1.12 μM.Recuadro∶ Gráfico de Job para el complejo Gos-Fe（II） a una concentración total constante 【Fe（D）】 más 【Gos】=1.6 μM. El punto negro indica el punto isosbéstico. Las flechas hacia abajo y hacia arriba indican una disminución y un aumento en los valores de absorbancia a 380 y 500 nm, respectivamente. Los experimentos se realizaron a 28 grados. La velocidad de exploración fue de 2 nm/s. Se estableció una línea de base con la mezcla de incubación más Fe (I) 1,6 μM. (B) Espectros infrarrojos de Gos y Gos-Fe (I). Se muestran ejemplos típicos.

2.6. Gos evitó la reducción de Fe (III) por ascorbato

El estado férrico del hierro promovido por Gos representa un mecanismo antioxidante plausible ya que dificulta la actividad catalítica de Fe(II). Sin embargo, el Fe(III) todavía podría reducirse de nuevo a su forma ferrosa mediante agentes reductores naturales como el ascorbato. Este último podría recargar los sistemas biológicos con Fe(II), que participa en las reacciones de Fenton-Haber-Weiss, generando el radical ·OH extremadamente reactivo. Para examinar estas posibilidades, usamos 1,10-fenantrolina para medir los niveles de formación de Fe (II) a partir de una solución de Gos (100 μM) tratada con ascorbato 2 mM y diferentes concentraciones de Fe (II) ({{6} } µM）. La figura 7 muestra que la ausencia de Gos permitió una tasa de reducción máxima de Fe(II) a Fe(II) (línea negra con una pendiente de 5,85 × 10-3); sin embargo, este proceso fue ralentizado por la presencia de Gos (1-min de incubación, línea verde), y después de 5 min de incubación con Gos, la tasa de reducción de Fe(I) por ascorbato disminuyó casi 3 veces (línea roja con una pendiente de 2.04× 10-3). Este resultado muestra la capacidad de Gos para inhibir la reducción de Fe() mediada por ascorbato a Fe(I)

Figura 7. Gos inhibe la reducción de Fe(ⅢI) por ascorbato en ausencia de mitocondrias de hígado de rata. Condiciones experimentales: sacarosa 125 mM, KCl 65 mM, tampón HEPES 10 mM (pH 7,2), citrato 1 mM, Gos 100 μM. Los experimentos se realizaron a 28 grados. Se añadieron ascorbato (4 mM) y 1,10-fenantrolina 5 mM después de 1 min o 5 min de incubación con Gos-Fe(I). Las líneas son representativas de tres ensayos.

2.7. Gos protege contra la 2-degradación oxidativa de la desoxirribosa

Para documentar la capacidad de Gos para actuar preferentemente sobre el hierro en lugar de los radicales libres, se realizaron estudios de competencia para evaluar la eficacia de Gos y dos eliminadores de OH (DMSO y salicilato) en la protección de 2-desoxirribosa 2,8 o 28 mM del hierro. - daño oxidativo mediado (Figura 8). Los secuestrantes de OH a 20 mM protegieron la 2-desoxirribosa 28 mM significativamente menos que la 2-desoxirribosa 2,8 mM (p<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">

Figura 8. Efecto de los eliminadores de Gos y·OH dimetilsulfóxido (DMSO) y salicilato sobre el daño oxidativo a 2-desoxirribosa 2,8 o 28 mM inducido por Fe(II)-EDTA más ascorbato. Las soluciones se incubaron durante 30 min a 37 grados y contenían tampón de fosfato 10 mM (pH 7,2), 2-desoxirribosa (2,8 o 28 mM), EDTA 150 μM y Fe 50 μM (ⅢI) Las reacciones se iniciaron mediante la adición de ascorbato a una concentración final de 2 mM. Las barras muestran la media ± SD (n=3). Los controles contienen solo DMSO (0,001 por ciento), que es la concentración de disolvente en las muestras de Gos. Se utilizó la prueba t de una cola para *p<0.05, n.s.,="">

3. Discusión

El hierro liberado en varias condiciones neurodegenerativas, incluidos los accidentes cerebrovasculares isquémicos y hemorrágicos, provoca la desregulación de la homeostasis del hierro en el cerebro, lo que conduce a la fisiopatología de la lesión neurológica [4,32-34]. A niveles subcelulares, el deterioro mitocondrial parece estar involucrado en la muerte neuronal mediada por hierro [10,15,35-38]. La evidencia preclínica respalda la ventaja de usar quelantes de hierro, principalmente mesilato de deferoxamina, contra la neurodegeneración, incluidos todos los tipos de accidentes cerebrovasculares [7,16]. Sin embargo, su alto costo y falta de disponibilidad, y la amplia gama de efectos adversos de los quelantes de hierro clásicos, han llevado al uso de quelantes naturales para el manejo del hierro en dishomeostasis [39,40].

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La acción protectora de Gos se muestra en células HT-22 y mitocondrias de cerebro de rata incubadas con una mezcla de hierro/citrato, donde encontramos una fuerte protección contra el daño oxidativo inducido por hierro. Las células HT-22 del hipocampo de ratón expuestas a una sobrecarga de hierro (24 h) mostraron una menor viabilidad, que estaba estrechamente asociada con la disipación temprana del potencial de membrana mitocondrial y la reducción de ATP (Figura 2A-C, respectivamente). Esto sugiere que el deterioro mitocondrial contribuye a la letalidad neuronal. De hecho, en nuestras condiciones, se espera que al menos una parte del Fe(II) cargado en las neuronas llegue a los orgánulos, ya que la muerte neuronal inducida por el hierro estuvo precedida por la pérdida de la función mitocondrial. Por lo tanto, se ha demostrado que la sobrecarga de hierro induce la muerte de las células HT-22 del hipocampo de ratón y la fragmentación mitocondrial [41,42]. Del mismo modo, la exposición sostenida al hierro aumenta los niveles de ROS mitocondriales en las células SHSY5Y del neuroblastoma dopaminérgico [43]. Además, se verificó una gran entrada de hierro en las neuronas del hipocampo, así como daño mitocondrial, después de la exposición a 100 uM de hierro ferroso [36]. Aquí observamos que la preservación de la viabilidad de las neuronas del hipocampo afectadas por el hierro inducida por Gos está estrechamente relacionada con la conservación de su potencial de membrana mitocondrial y los niveles de ATP.

Al igual que en las células intactas, la exposición mitocondrial directa al hierro ferroso provocó la dilatación extensa del orgánulo, la disipación del potencial de membrana y la pérdida de ATP (Figura 3A-C, respectivamente). En este entorno experimental, Gos pudo proteger el mitocondrias sobrecargadas de hierro, lo que se expresó por la preservación de los parámetros antes mencionados. En este sentido, se ha observado que las mitocondrias cargadas con una concentración micromolar de hierro experimentaron una apertura de poros de transición de permeabilidad mitocondrial y disipación de △Y de una manera que es sensible a la quelación del hierro pero no dependiente de la acción antioxidante de la catalasa |44]. Curiosamente, se informó que el antioxidante Mito-Tempo protege contra el daño por sobrecarga de hierro en las neuronas del hipocampo al eliminar el radical anión superóxido mitocondrial y preservar la integridad morfológica mitocondrial y el potencial de membrana [36]. Recientemente describimos los efectos antioxidantes de este flavonoide y su capacidad para proteger a las células PC12 contra la muerte inducida por hipoxia química [29], donde se concluyó que la capacidad antioxidante y de eliminación de radicales libres de Gos está parcialmente involucrada en la protección contra la muerte mediada por hierro. HT-22 y daño mitocondrial. Sin embargo, la eficacia mejorada de Gos contra la lipoperoxidación mediada por hierro frente a la lipoperoxidación mediada por hidroperóxido de tercbutilo (Figura 4A,B, respectivamente) sugiere fuertemente que su capacidad de interacción con el hierro es el principal mecanismo contra el daño inducido por hierro.

Para caracterizar aún más la interacción Gos-Fe, se realizaron varios experimentos libres de células y mitocondrias. Observamos que cuando el polifenol se coincubaba con Fe (II), la concentración de iones metálicos disminuía, mientras que había un aumento correspondiente en la tasa de consumo de oxígeno (Figura 5A-C). Estos efectos sugieren que Gos elimina Fe(II) del complejo de citrato y lo oxida a una forma férrica en un proceso que requiere O2 como aceptor de electrones. En consecuencia, Gos promueve la disminución de la concentración de Fe (II) que puede obstaculizar los radicales hidroxilo a través de las reacciones de Fenton. Dado que el complejo Gos-Fe(II) permite la oxidación de agentes reductores relevantes como el ascorbato, lo que resulta en la formación/regeneración de Fe(II), pudimos demostrar que Gos inhibe la reducción de Fe(II) mediada por ascorbato. a Fe(II).

La hipótesis de que Gos interactúa fuertemente con el hierro también se confirmó aquí a través de técnicas espectroscópicas y corroboró resultados previos donde diferentes matrices de

La estequiometría del complejo gos-hierro se caracterizó mediante espectroscopía de masas de ionización de espín electrónico [45].

Estos resultados evidenciaron los efectos protectores de Gos contra el daño neuronal mediado por hierro, probablemente al interactuar con iones ferrosos, lo que dificulta su participación en la formación de especies reactivas catalíticas de oxígeno. Además, esto sugiere la formación de un complejo transitorio de transferencia de carga entre Fe(Ⅱ) y Gos, acelerando la oxidación de Fe(II) y la formación de un complejo Fe(III)-Gos más estable que no puede participar en la fase de propagación de los lípidos. peroxidación Además, un agente reductor biológicamente relevante como el ascorbato no pudo reducir el hierro férrico en presencia de Gos, lo que limitó una característica prooxidante de ciertos flavonoides involucrados en el reciclaje de iones ferrosos. [30]. Gos en concentraciones micromolares fue más eficaz que los secuestrantes clásicos para prevenir la oxidación de 2-desoxirribosa mediada por hierro. Esta alta eficacia puede atribuirse a la formación de un Gos-Fe(II)/() redox-activo como observamos previamente para otros polifenoles que mejoraron su desempeño como antioxidantes al interactuar con el hierro en diferentes paradigmas in vitro de daño oxidativo. 22,46-48].

Se ha establecido que los agentes quelantes que contienen oxígeno como ligando (ligando oxo, O2-) pueden quelar el hierro y promover la oxidación del Fe(I), la estabilización del Fe(II), y en consecuencia producir una disminución de la su potencial reductor49]. A pH fisiológico, los catecoles forman fácilmente complejos bis termodinámicamente estables con hierro férrico, favorecidos por bajas concentraciones de los ligandos. La presencia de un resto de catecol en la estructura de Gos sugiere un mecanismo de interacción similar con el hierro, lo que podría explicar la protección lograda contra el daño inducido por hierro de las células neuronales y las mitocondrias. En este sentido, también demostramos previamente que la mangiferina y la gutferona A estimulan la oxidación del hierro ferroso y dificultan la reducción del hierro férrico [23,24,26-28].

La capacidad de Gos para quelar el hierro también puede impulsar vías de señalización que contribuyen a la neuroprotección. Por ejemplo, las enzimas del dominio prolil hidroxilasa (PHD), las clásicas enzimas modificadoras de la hidroxilación del factor inducible por hipoxia-lalpha (HIF-1o) en condiciones de normoxia, se han identificado como los objetivos críticos de los quelantes de hierro que son clínicamente beneficiosos en muchos trastornos neurológicos [50,51]. Es comprensible ya que la PHD depende del hierro divalente como factor de acoplamiento [52]. Varios genes que han estado involucrados en la neuroprotección están regulados por HIF-la, como eNOS, VEGF y EPO[53]. Además, la activación de HIF resultante de la inhibición de PHD podría prevenir el deterioro mitocondrial y la apoptosis mediada por estrés oxidativo, independientemente de su papel como factor de transcripción [54].

La ferroptosis, la muerte celular regulada dependiente de hierro caracterizada recientemente, se ha propuesto como el mecanismo a través del cual mueren las neuronas expuestas al daño hemorrágico [8]. La disfunción mitocondrial se relacionó recientemente con la muerte celular por ferroptosis [55]. Por lo tanto, la inhibición de la ferroptosis, que salva la función mitocondrial del daño por hierro, también podría ser un mecanismo plausible para la neuroprotección contra los trastornos neurológicos mediados por hierro protegidos por Gos, lo que merecería más atención. Se deben realizar investigaciones adicionales sobre los supuestos efectos beneficiosos de Gos en modelos animales in vivo de neurodegeneración asociada con el hierro, a fin de proponer este flavonoide como una intervención terapéutica contra el daño del tejido cerebral inducido por la desregulación de la homeostasis del hierro.