La gosipitrina, un flavonoide natural, atenúa el daño neuronal y mitocondrial inducido por el hierro Parte 3

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4. Materiales y Métodos 4.1.Reactivos

Todos los reactivos se obtuvieron de Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, EE. UU.). Se prepararon soluciones madre de Gos en DMSO y se agregaron a los cultivos celulares o preparaciones mitocondriales en diluciones 1/1000 (o/o).

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4.2.Material vegetal

Se recolectaron materiales vegetales (flores) de Talipariti elatum (Sw.)(Syn. Hisbiscus elatus Sw.)(Malvaceae) durante marzo de 2020 de los alrededores del Centro de Investigación y Evaluación Biológica, Instituto de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias, La Lisa , La Habana, Cuba. Fueron autenticados por especialistas del herbario de la Universidad de Camagüey “Ignacio Agramonte Loynaz”, donde se depositaron ejemplares comprobantes: G. Pardo., HPC-12 520 (HIPC).

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4.3. Preparación de extractos y muestras

losetanólicolos extractos se prepararon a partir de las flores rojas de Telatum como se informó anteriormente [29]. Después de la rotoevaporación, los sólidos se purificaron mediante procedimientos de recristalización [29]. Los compuestos aislados se caracterizaron mediante RMN 1D 'H (400 MHz) y 13C (100 MHz). El procesamiento de datos de RMN se realizó con el software MestReNova versión 6.1.0-6224 para Windows (Materiales complementarios, Figuras S1-S3). Los datos de RMN recopilados de Gos se compararon con resultados anteriores [56].

4.4. Estudios Espectroscópicos UV/Vis e IR

Los espectros UV/Vis se realizaron en cubetas de cuarzo de 10 mm de longitud de camino óptico y la absorbancia se registró en un UV-VisespectrofotómetroUltrospec 2100 Pro de Amersham BioSci (Little Chalfont, Reino Unido) acoplado a una computadora con Wave Scan Software (SWIFT I, 1.2) a temperatura ambiente. La interacción entre Gos y los iones ferrosos se midió controlando los cambios en el espectro UV/Vis. Se utilizó el método de Job para determinar la relación estequiométrica entre Gos y el ion Fe(II). Las soluciones madre de Gos y Fe(lI) se prepararon diariamente en tampón metanol y fosfato, respectivamente. Los espectros IR se registraron en un espectrómetro JASCO FI/IR-440 en el rango de 4000-400 cm-I, utilizando gránulos de bromuro de potasio para preparar las muestras.

4.5. Culturas celulares

RatónhipocampoSe cultivaron células HT-22 (ATCC) en un medio DMEM suplementado con FCS al 10 por ciento, L-glutamina (1 mM) y penicilina/estreptomicina (1 por ciento) y se mantuvieron a 37 grados en un 5 por ciento de CO2 humidificado. incubadora. Las células (2x104 células/pocillo) se sembraron en 96-placas de pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca), en 200 μl de medio de cultivo durante 24 ha 37 °C.

4.6.Inducción del daño oxidativo celular y tratamiento con Gos

La acción neuroprotectora de Gos （0.001-100 μM） se probó en HT-22 mediante co-incubación durante 24 h con Gos o Trolox（500 μM）, FeCl2 （100μM） y citrato (1 mM). Después de 24 h, se eliminó el sobrenadante celular y se midió la viabilidad celular mediante el [3-(4,5-dimetiltiazolEnsayo colorimétrico de -2-il)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio] (MTT).

4.7. Ensayo de viabilidad celular

Después de los tratamientos, las células (2x 104) se incubaron con MTT 10 uM durante 3 horas a 37ºC. A continuación, el derivado de MTT coloreado se disolvió en 50 μl de DMSO y se contó la absorbancia a 570 nm en un lector de microplacas (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Alemania). La viabilidad celular se expresa como porcentaje frente al control de células no tratadas.

4.8.Ensayo de potencial de membrana mitocondrial (△Y) en células HT-22

mitocondrialEl potencial de membrana se evaluó sobre la base de la retención celular de la sonda catiónica fluorescente rodamina 123 [57,58]. Después de 2 h de daño por hierro/ascorbato en ausencia (control) o presencia de Gos (0.001-100 μM) o Trolox (500 μM), las células neuronales (2 ×10*）se incubaron 10 min con rodamina 123 1 μM. Después de la centrifugación y la resuspensión en 1 ml de Triton X al 0,1 %-100, se determinó la concentración de la sonda en el sobrenadante utilizando un lector de microplacas (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Alemania) en el par de longitud de onda de excitación/emisión de 505/535 nm. Los datos se expresan como porcentajes frente al Control de células no tratadas.

4.9.Análisis de ATP

El ATP celular se determinó mediante el sistema de ensayo de luciferina/luciferasa de luciérnaga [59] en las mismas condiciones que AY. La bioluminiscencia se midió con un kit de ensayo Sigma-Aldrich según las instrucciones del fabricante, utilizando la opción de luminiscencia del lector de microplacas (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Alemania).

4.10.Animales

Se obtuvieron ratas Wistar macho (200 g) del Centro de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, La Habana, Cuba) y se alojaron en el cuidado de animales durante 1 semana antes de los experimentos en un ambiente de temperatura. ambiente controlado (22-24 grados), con un ciclo de luz/oscuridad de 12-h y con acceso a comida y agua ad libitum.

4.11.Aislamiento mitocondrial

Las mitocondrias del prosencéfalo de rata se aislaron mediante centrifugación diferencial como se describió anteriormente [60]. Se usó digitonina al 10 por ciento para interrumpir los sinaptosomas y producir una mezcla de mitocondrias no sinaptosómicas y sinaptosómicas. Todo el procedimiento se llevó a cabo a 4 grados. La relación de control respiratorio (frecuencia respiratoria de estado 3/estado 4) estuvo siempre en el intervalo de 4,5 a 6,0, medido usando succinato 5 mM como sustrato.

4.12. Ensayos mitocondriales de monitoreo continuo

El potencial de membrana mitocondrial se determinó espectrofluorimétricamente utilizando 10 μM de safranina O como sonda 【58,61】 en un lector de microplacas （FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Alemania) a longitudes de onda de excitación/emisión de 495/586 nm; estos ensayos se realizaron en presencia de EGTA 0,1 mM y K, HPOA 2 mM. El hinchamiento mitocondrial se estimó espectrofotométricamente a partir de la disminución de la absorbancia aparente a 540 nm. Para los ensayos, las mitocondrias se energizaron con succinato de potasio 5 mM (más rotenona 2,5 uM) en un medio estándar que consistía en sacarosa 125 mM, KC 65 mM y HEPES-KOH 10 mM, pH 7,4, a 30 grados.

4.13. Ensayos de peroxidación lipídica

La peroxidación lipídica se estimó a partir de la generación de malondialdehído (MDA) [28,62]. Las mitocondrias (1 mg/ml) se expusieron a hidroperóxido de terc-butilo 4 mM o Fe(II) 50 uM más citrato de sodio 1 mM a 37 grados C. La concentración de MDA se calculó utilizando su coeficiente de extinción (c =1). 56×105 M-1.cm-1).

4.14. Determinación de la concentración de Fe(II)

La concentración de Fe(ⅡI) se determinó en tampón de fosfato 10 mM pH 6,5 (2 ml) mediante la formación de un complejo rojo con 1,10-fenantrolina (5 mM), como se describió previamente [24,28].

4.15.Monitoreo del Consumo de Oxígeno

El consumo de O, relacionado con la oxidación de Fe(ⅡI) se midió con un electrodo tipo Clark (Hansatech Instruments, Pentney, King's Lynn, UK) en una cámara de vidrio de 1.3-ml equipada con un agitador magnético, a 30 grados. La tasa de consumo de oxígeno (ROC) se expresó como nmol O2/mL por min.

4.16.2-Ensayo de oxidación de desoxirribosa

La formación de radicales hidroxilo("OH) se estimó siguiendo la degradación de 2-desoxirribosa a MDA, que se calculó a partir de su coeficiente de extinción (e=1.56×10 grado M-1· cm-) como se informó anteriormente [26, 27].

4.17. Detección de complejos Gos-Fe(II)

Se añadió Fe (ⅡI) (FeCl,0.4-1,6 μM) a 2 ml (10 mM) de tampón fosfato (pH 6,5) que contenía citrato 2 mM y Gos 1,6 μM. Se realizó una exploración de longitud de onda de 200-600 nm en un espectrofotómetro Hitachi 2001 (Hitachi, Tokio), a 28 grados.

4.18. Análisis estadístico

Se utilizó GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EE. UU.). El análisis estadístico se realizó utilizando un ANOVA unidireccional, seguido de una prueba posthoc de Student-Newman-Keuls para comparaciones por pares. Resultados con p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" half-effective="" or="" inhibitory="" concentrations="" were="" estimated="" following="" a="" non-linear="" regression="">

Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea. Figura S1: espectro 1H-NMR (400 MHz) de gosipitrina en DMSO-do, Figura S2: espectro 13C-NMR (101 MHz) de gosipitrina en DMSO-d, Figura S3: espectro HSQC de gosipitrina en DMSO-dg. Tabla S1: datos de 'H (400 MHz) y 13C (100 MHz) de gosipitrina frente al informe anterior.

Contribuciones de autor:Conceptualización, G.LP.-A.; metodología, MAB-V., RFD, YM-P. y GLP-A.; validación, MAB-V., JM-P., YM-P y RFD; análisis formal, YM-P, JM-P, RF-A. y GLP-A.; investigación, MAB-V, AA-L., DA-A., YM-P., RFD y GLP-A.; Curación de datos, MAB-V.YM.-PJM-P.y RF-A.; redacción—preparación del borrador original, MAB-V.; redacción—revisión y edición, IM.-P, RF-A., YM-P y GLP-A.; visualización, YM-P. y GLP-A.; supervisión, BPL-A.; adquisición de fondos, GLP-A. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Financiamiento: Esta investigación fue financiada por VLIR (Bélgica); concesión número CU2018TEA457A103, y del Ministerio de Ciencia Tecnología y Medio Ambiente (Cuba); concesión número PN223LH010-035. El APC fue financiado por VLIR (Bélgica); concesión número CU2018TEA457A103.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:El estudio se realizó de acuerdo con los lineamientos de la Declaración de Helsinki, y fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del Instituto de Ciencias Farmacéuticas y de Alimentos, Universidad de La Habana, Cuba (Código de protocolo IFAL-CEI 087-2019, octubre de 2019) .

Declaración de consentimiento informado: No aplicable. Declaración de disponibilidad de datos: No aplicable.

Expresiones de gratitud:Este trabajo fue parcialmente financiado por el Proyecto CU2018TEA457A103 de Vlaamse Interuniversitaire Raad (VLIR)-Belgium/Ministerio de Educacion Superior (MES)-Cuba, que también cubrió las tarifas de procesamiento de artículos, y por el proyecto PN223LH010-035 del"Ministerio de Ciencia Tecnología y Medio Ambiente (Cuba), Programa de Ciencias Básicas y Naturales". Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés.

Disponibilidad de muestras: Las muestras de los compuestos están disponibles del autor correspondiente.