Síntesis verde y caracterización de nanopartículas de hierro sintetizadas a partir de extracto acuoso de hojas de Vitex Leucoxylon y sus aplicaciones biomédicas

Abstracto:Se utilizó el método de extracción en frío para obtener el extracto acuoso deVitex leucoxylonhojas en una proporción de 1:10. Se sintetizaron nanopartículas de hierro (FeNPs) utilizando extracto acuoso de hojas deV leucoxyloncomo agente reductor. Se utilizó el enfoque de la fitomedicina para hacer FeNP mezclando 1 ml de extracto de planta con 1 mM de sulfato férrico. Se utilizaron microscopía electrónica de barrido (SEM), espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) y espectroscopia de rayos X de dispersión de energía para examinar los FeNP sintetizados. La reacción de reducción se mostró por un cambio en el color de la solución, y la formación de color negro confirma que se han formado FeNP. El mayor pico de absorción (máx.) se encontró a 395 nm en el análisis espectral UV-Vis. Los espectros FTIR deV leucoxylonextracto acuoso de hoja mostró cambios en algunos picos, a saber, 923,96 cm−1 y 1709,89cm−1, con grupos funcionales ácidos carboxílicos, aldehídos insaturados y cetonas, que faltaban en los espectros FTIR de FeNP y son responsables de la formación de FeNP. Se observaron FeNP con diámetros entre 45 y 100 nm en imágenes SEM. La creación de FeNP fue confirmada por EDX, que muestra una fuerte señal en la región del hierro metálico a 6–8 Kev. XRD reveló una naturaleza cristalina y un diámetro promedio de 136,43 nm.antioxidante,antiinflamatorio, citotóxico ycicatrización de la heridalas pruebas in vitro informaron una actividad significativa de los FeNP. Los hallazgos acumulativos del presente estudio indican que la síntesis verde de FeNPspotencia su actividad biológicay puede servir comoun posible agente de curación de heridas dérmicasyagente citotóxico contra el cáncer. Se necesitan estudios futuros sobre la identificación de los mecanismos involucrados en la síntesis de FeNPs porV leucoxylony sus aplicaciones biomédicas.

Palabras clave:Vitex leucoxylon; nanopartículas de hierro; MEB; cicatrización de la herida; citotóxico

BENEFICIOS DE LA CITANCHE PARAANTIOXIDANTE,ANTIINFLAMATORIO, CITOTÓXICO YCICATRIZACIÓN DE LA HERIDA

1. Introducción

La aplicación de la nanotecnología en la ciencia y la tecnología para fabricar nuevos materiales a escala nanométrica es un campo en rápido crecimiento [1]. La nanotecnología se ocupa de la fabricación de materiales a nivel atómico para obtener propiedades distintivas, que pueden manipularse para aplicaciones preferidas. Este campo está creciendo rápidamente con sus aplicaciones en ciencia y tecnología para fabricar nuevos materiales a nivel de nanoescala [2]. Varios sectores industriales han adoptado la nanotecnología en los últimos años debido a sus aplicaciones en los campos de sistemas de almacenamiento electrónico [3], biotecnología [4], separación magnética y preconcentración de analitos objetivo, administración dirigida de fármacos [5] y vehículos para genes y fármacos. entrega [3,5,6]. En consecuencia, estas partículas tienen el potencial de tener un impacto sustancial en la sociedad como resultado de la amplia gama de aplicaciones para las que se pueden utilizar. Las nanopartículas (NP) son masas de partículas que tienen un tamaño de menos de cien nanómetros y se consideran masas estructurales clave en el campo de la nanotecnología. La mayor actividad de las NP es tanto su característica definitoria como la cualidad por la que son más notables [7]. Las NP orgánicas e inorgánicas son las dos clasificaciones principales que se pueden aplicar a las nanopartículas. Las nanopartículas inorgánicas pueden incluir NP magnéticas, NP de metales nobles (como el oro y la plata) y NP de semiconductores (como el dióxido de titanio y el óxido de zinc). Las nanopartículas orgánicas pueden incluir NP de carbono. Las nanopartículas inorgánicas están atrayendo una gran atención porque ofrecen propiedades materiales superiores junto con versatilidad funcional. Se han investigado como posibles herramientas para la imagen médica así como para el tratamiento de enfermedades debido a las características de tamaño que poseen [8]. Las diversas propiedades químicas, físicas y biológicas de las NP están fuertemente influenciadas por una variedad de parámetros, incluidos el tamaño y la morfología de las nanopartículas, así como el recubrimiento de la superficie, que normalmente se determinan durante la síntesis de las nanopartículas. La pérdida de la actividad biológica prevista se debe a una disminución de la estabilidad coloidal. El pH, la fuerza iónica y una gran cantidad de proteínas que interactúan con las AgNP en circunstancias relevantes tienen un impacto en la estabilidad coloidal. Como resultado, la selección adecuada de la técnica de síntesis es fundamental para obtener las características deseadas de las partículas para aplicaciones específicas [9].

Actualmente, existe una amplia variedad de NP que se pueden sintetizar mediante una variedad de procesos físicos, químicos, biológicos e híbridos. Según los hallazgos de un gran número de estudios de investigación, los procesos físicos y químicos para producir nanopartículas incluyen el uso de solventes orgánicos, compuestos peligrosos, cantidades significativas de energía y agentes estabilizadores que no son biodegradables [10]. Por lo tanto, en el campo de la nanotecnología verde, la síntesis de NP utilizando materiales disponibles naturalmente como extractos de plantas, varios microorganismos, sus metabolitos y algunas sustancias húmicas naturales [11,12] como agentes reductores y protectores se está volviendo cada vez más popular. Se han utilizado métodos de síntesis que son amigables con el medio ambiente para producir una amplia variedad de nanopartículas metálicas, que incluyen plata, oro, hierro, cobre y zinc. El desarrollo de métodos fáciles y ambientalmente aceptables para la síntesis de NP es uno de los enfoques clave de la nanotecnología. Los biomateriales, como microorganismos y extractos de plantas, se pueden utilizar en el proceso de preparación de una amplia variedad de NP [13, 14]. Sin embargo, debido a que algunos organismos son patógenos, es peligroso manipularlos. Para prosperar, los microorganismos deben mantenerse en cultivo y someterse a condiciones cuidadosamente controladas, que incluyen temperatura, pH y otros parámetros. Debido a que elimina el laborioso proceso de mantener el cultivo microbiano, la síntesis de NP utilizando partes de plantas a veces puede resultar más ventajosa que otros procesos biológicos [15]. Como resultado, ha llamado mucho la atención debido a sus características inherentes, que incluyen la utilización de los recursos naturales, la rapidez, el respeto al medio ambiente y la benignidad. Estas atractivas características son absolutamente necesarias para su uso en aplicaciones médicas. Las nanopartículas producidas por síntesis verde tienen un tamaño bien definido y controlado, están libres de contaminantes y el método es fácil de escalar. Estos son algunos de los beneficios adicionales de la síntesis verde [16]. La actividad biológica de las nanopartículas sintetizadas está determinada y ajustada en gran medida por los materiales verdes utilizados para la estabilidad y reducción de iones metálicos. Una de las propiedades ideales de las NP debe ser que debe tener una capacidad sobresaliente para discriminar entre objetivos potenciales (patógenos) y células de mamíferos (huésped) [17].

Debido a esto, el extracto acuoso de hojas de V. leucoxylon fue investigado por su potencial para facilitar la formación de nanopartículas de hierro (FeNP) en la investigación actual. El hierro es uno de los elementos que se pueden encontrar en mayor abundancia en la Tierra. Recientemente, ha llegado a ser reconocido como una nueva clase de NP importantes debido al hecho de que posee una variedad de propiedades únicas, que incluyen alta coercitividad y superparamagnetismo. La catálisis, los dispositivos electrónicos, el almacenamiento de información, los sensores, la tecnología de administración de fármacos, la biomedicina, los dispositivos de registro magnético y la limpieza ambiental son solo algunas de las muchas aplicaciones intrigantes que han hecho uso de las FeNP [18]. Además, según una serie de estudios, los FeNP pueden crearse a partir de varios extractos de plantas. Estos extractos de plantas incluyen hoja de Eucalyptus globulus [19], hoja de granada [20] y ceniza de cáscara de plátano [21]. La planta V. leucoxylon, que se utilizó en el presente estudio, es miembro de la familia Verbenaceae. También se le conoce como el árbol casto de cinco hojas (Kannada: Sengeni, Holenekki, Hollalakki) y se puede encontrar en la región a lo largo de las orillas de los ríos en bosques siempre verdes y semiperennes y bosques caducifolios húmedos a lo largo de los arroyos. Puede alcanzar una altura de hasta 20 m y se clasifica como un árbol caducifolio de modesto a grande. A lo largo de los bosques de los Ghats occidentales de la India, se puede encontrar en grandes cantidades. Se ha informado que la infusión de extracto de hoja de V. leucoxylon posee una amplia variedad de actividades farmacológicas, como actividades antiinflamatorias, antioxidantes, antipsicóticas, antidepresivas, antiparkinsonianas y antihiperlipidémicas [22]. Los productos naturales, a lo largo de la historia y particularmente en la medicina popular, se han utilizado para el tratamiento de una amplia variedad de dolencias y enfermedades. Esta práctica se remonta a la antigüedad. Los métodos de química de productos naturales que existen desde hace mucho tiempo han hecho posible encontrar una gran variedad de metabolitos secundarios bioactivos que provienen de fuentes terrestres y marinas. Un número significativo de estas sustancias naturales ahora se están considerando para su uso como productos farmacéuticos potenciales [23].

Hay una gran cantidad de sustancias químicas y nutrientes naturales que aún no se han descubierto y que son útiles para la humanidad. Como consecuencia de esto, existe una demanda inmediata de investigación y desarrollo de opciones terapéuticas innovadoras que puedan utilizarse con éxito en las intervenciones terapéuticas y crear una cantidad mínima de efectos adversos.

El proceso de síntesis verde sugerido actualmente para FeNP es distinto y rentable. En el estudio actual, se hizo un intento de crear nanopartículas a temperatura ambiente sin el uso de ninguna técnica química o física. Se eligió la planta Vitex leucoxylon en un esfuerzo por sintetizar nanopartículas de hierro, y se llevaron a cabo modelos in vitro sistemáticos integrales para evaluar la potencia de las nanopartículas de hierro. Solo se ha publicado un número limitado de estudios de investigación sobre el concepto de nanopartículas y sus aplicaciones biomédicas sobre esta planta. Como consecuencia, decidimos que sería beneficioso llevar a cabo esta investigación con los siguientes objetivos en mente: detección de fitoquímicos y medición del número de metabolitos secundarios en V. leucoxylon; síntesis verde y caracterización de FeNPs de V. leucoxylon; estudio comparativo de los efectos antioxidantes y antiinflamatorios de V. leucoxylon y sus FeNPs in vitro; actividad citotóxica in vitro del extracto acuoso de hoja de V. leucoxylon y sus FeNP contra el cáncer de piel, cáncer de pulmón y cáncer oral; Actividad de cicatrización de heridas in vitro del extracto acuoso de hoja de V. leucoxylon y sus FeNP sintéticos mediante ensayo de rascado.

2. Materiales y métodos

2.1. Recolección de Material Vegetal

En el mes de marzo de 2022, se recolectaron hojas frescas de V. leucoxylon del área forestal Anshi de los Ghats occidentales en el distrito Uttar Kannada del estado de Karnataka en India. Las hojas fueron identificadas y autenticadas por la Dra. Kotresha K., Taxonomista, Departamento de Botánica, Facultad de Ciencias de Karnataka, Dharwad; Karnataka, refiriéndose al espécimen de comprobante depositado en el Departamento de Botánica, Facultad de Ciencias de Karnataka, Dharwad, Karnataka. Después de ser recolectado, el material de la hoja de la planta fresca se lavó con agua corriente del grifo, se secó al sol y luego se molió hasta obtener un polvo grueso usando un molinillo mecánico. El polvo se mantuvo en recipientes que se sellaron a temperatura ambiente para que pudiera ser utilizado posteriormente en el proceso de extracción por solvente crudo.

2.2. Preparación de Extracto de Planta

Mediante un dispositivo Soxhlet se extrajeron 25 g de hojas pulverizadas durante 48 h con 250 mL de agua destilada. El extracto acuoso se concentró aún más utilizando un evaporador rotatorio y luego se secó en desecadores antes de conservarse en una botella cerrada a 4 ◦C hasta su uso. Para la síntesis de FeNPs se utilizó el extracto acuoso como agente reductor y estabilizante.

2.3. Disolventes y Reactivos

Todos los productos químicos y disolventes empleados eran de calidad analítica y se adquirieron de Hi-media (Hubli, India).

2.4. Análisis fitoquímico

Siguiendo el procedimiento descrito por Deepti et al. (2012), el extracto acuoso crudo de hojas de V. leucoxylon se analizó cualitativamente para determinar la presencia de varios componentes fitoquímicos como flavonoides, alcaloides, fenoles, glucósidos, esteroles, ligninas, saponinas, antraquinonas, taninos y azúcares reductores [24].

2.5. Síntesis de Nanopartículas de Hierro

En primer lugar, se añadió 1 ml de extracto acuoso de hoja de V. leucoxylon a 10 ml de solución acuosa de FeSO4 0,05 mM y se agitó la mezcla. A temperatura ambiente y en ambiente oscuro se realizó el proceso completo de mezcla de reacción. La reacción de oxidación/reducción fue claramente visible después de que la mezcla de reacción incolora se incubara y reaccionara durante el tiempo requerido [25]. Para eliminar cualquier rastro de extracto acuoso de los FeNP recién sintetizados, que se dejaron secar en polvo después de la centrifugación a 10, 000 rpm durante diez minutos durante el período de reacción deseado, se centrifugó la mezcla acuosa que contenía FeNP. una segunda vez y se redispersó en agua bidestilada y se secó [26].

2.6. Caracterización de FeNP

Varios métodos, como la espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis), la espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FTIR), la microscopia electrónica de barrido y la espectroscopia de rayos X de energía dispersiva, la difracción de rayos X (XRD), el analizador de tamaño de partículas y la zeta potencial, se utilizaron para caracterizar las FeNP.

2.6.1. Análisis basado en espectroscopia UV-Visible

En primer lugar, se evaluó una alícuota de 1 mL de solución de FeNPs coloidal en cubetas de cuarzo mediante espectroscopía UV-visible (U-3310, Hitachi, Tokio, Japón), usando agua destilada como referencia y 0.05 mM FeSO4 como blanco, para validar la reducción de los iones férricos en la solución coloidal [27].

2.6.2. Análisis basado en FTIR

Los grupos funcionales (grupos) que se unieron a la superficie de hierro y participaron en la síntesis de FeNP se identificaron mediante espectroscopia FTIR (S700, Nicolet, MA, EE. UU.), [28]. Después de 72 h de incubación, las FeNP se aislaron mediante centrifugación repetida (3–4 veces) de las mezclas de reacción a 10,000 rpm durante 15 min. El sobrenadante se reemplazó por agua desionizada y el sedimento se almacenó como polvo. Después de secarse, las FeNP se sometieron a un análisis FTIR utilizando el proceso de granulación de bromuro de potasio en una proporción de 1:100.

2.6.3. Análisis basado en microscopía electrónica de barrido

Se utilizó microscopía electrónica de barrido (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, EE. UU.) para examinar las nanopartículas y establecer la forma de su superficie. Los sustratos se prepararon en un sustrato de Si limpio de 5 mm × 5 mm cortado de una oblea de 100 mm de diámetro. Se permitió que el sustrato reaccionara de 2 a 6 horas y la muestra se preparó centrifugando una solución coloidal a 10,000 rpm durante 5 minutos. El sedimento se secó después de volver a centrifugarlo muchas veces, después de lo cual se redispersó en agua desionizada y se repitió el procedimiento. Finalmente, se obtuvo el pellet seco, que luego se sometió a la caracterización estructural mediante análisis SEM según el procedimiento descrito por el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología, NIST-2007 [29].

2.6.4. Rayos X de dispersión de energía

Después del secado en una rejilla de cobre recubierta de carbono, los FeNP reducidos se analizaron utilizando EDX (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, EE. UU.), que también permitió determinar la composición elemental.

2.6.5. Potencial zeta

Observaciones de NP El potencial zeta es una herramienta útil para obtener información adicional sobre la estabilidad de las NP coloidales. La amplitud del potencial zeta proporciona una pista sobre la posible estabilidad del coloide. Según Meléndrez et al. (2010), las partículas se consideran estables si sus valores de potencial zeta son más positivos que más de 30 mV o más negativos que 30 mV [30]. Este hecho debe ser tomado en consideración. Se utilizó el medidor láser zeta para adquirir lecturas de los potenciales zeta superficiales (Malvern zeta seizer 2000, Malvern, Reino Unido). Las muestras líquidas de las nanopartículas, con un total de 5 mililitros, se diluyeron con 50 mililitros de agua bidestilada y se usaron 2 mm por metro cuadrado de cloruro de sodio como solución electrolítica de suspensión. Posteriormente se modificó el pH hasta alcanzar el nivel deseado. Las muestras se agitaron durante un total de 30 min. Después de agitar el recipiente, se anotó el pH en equilibrio y se determinó el potencial zeta de las partículas metálicas. Con el fin de determinar el potencial de superficie de las FeNP, se utilizó el potencial zeta. En cada caso, el valor indicado fue el promedio de los resultados de tres mediciones individuales. Cuando los valores del potencial zeta oscilaron entre más de más de 30 mV y menos de 30 mV, se determinaron los criterios para la estabilidad de las NP [31].

2.6.6. Analizador de tamaño de partículas

Para determinar el tamaño de partícula de la muestra, se realizó la prueba de PSA después de haber sido liofilizada y luego dispersada usando un ultrasonicador (SZ-100, Horiba, Kyoto, Japón).

2.6.7. Análisis de análisis de difracción de rayos X (XRD)

Las nanopartículas de hierro sintetizadas a partir del extracto acuoso de hoja de V. leucoxylon se sometieron a análisis XRD (Smart Lab SE, Rigaku, Tokio, Japón) para determinar la naturaleza y el tamaño promedio de las nanopartículas.

2.7. Determinación de la actividad antioxidante mediante el uso de métodos in vitro

2.7.1. Ensayo de poder antioxidante reductor de iones férricos (FRAP)

Según Oyaizu (1986), con una modificación menor, se evaluó el poder reductor de los iones férricos [32]. Durante 30 min a 50 ◦C, se añadieron 2,5 ml de tampón de fosfato 20 mM y 2,5 ml de ferricianuro de potasio al 1 % a 2,5 ml de extracto de hoja de V. leucoxylon y sus FeNP sintetizados se mezclaron con la combinación. Después del período de incubación, la mezcla se complementó con 2,5 ml de ácido tricloroacético al 10 % p/v y 0,5 ml de cloruro férrico al 0,1 % p/p antes de incubarla durante 10 min adicionales. Finalmente, se utilizó un espectrofotómetro UV-V para detectar la absorbancia a 700 nm. Como estándar, se utilizó ácido ascórbico. Cada muestra se ensayó tres veces.

2.7.2. Ensayo de eliminación de peróxido de hidrógeno

En función de la capacidad del extracto acuoso de hoja de V. leucoxylon y sus FeNP sintéticos para eliminar el peróxido de hidrógeno, se evaluó la actividad antioxidante de estos compuestos. Primero, se agregaron {{0}}.6 mL de tampón de fosfato (pH—7.4) que contenía H2O2 4 mM a 0.5 mL de ácido ascórbico estándar a una concentración conocida, así como a tubos que contenían extractos de plantas a varias concentraciones. variando de 100 µL a 500 µL (pH—7.4). Usando un tampón de fosfato y una solución de blanco libre de peróxido de hidrógeno, evaluamos la absorbancia de la solución a 230 nm después de 10 min. Se utilizó tampón de fosfato para crear el control en lugar de la muestra o el estándar [33]. Cada muestra se ensayó tres veces. Se usó el enfoque de fórmula para calcular el porcentaje de inhibición.

2.7.3. Eliminación de radicales libres DPPH

Ensayo El extracto de hoja de V. leucoxylon y los FeNP sintetizados se probaron para determinar su capacidad para eliminar los radicales libres utilizando el radical DPPH como reactivo [34]. Las muestras se combinaron con solución de radicales DPPH (60 M) en etanol (100 µL) a diferentes concentraciones (p/v). Se utilizó un espectrofotómetro UV-Vis para medir la absorbancia de la mezcla a 517 nm después de 30 min de incubación en la oscuridad a temperatura ambiente. Se empleó ácido ascórbico como estándar para el experimento. Se utilizó la siguiente ecuación para determinar la actividad de eliminación de DPPH de cada muestra:

donde Ac representa la absorbancia de la reacción de control, que se realiza mezclando 100 L de etanol con 100 L de la solución de DPPH, y At representa la absorbancia de la muestra de prueba. Los experimentos se llevaron a cabo en tripletes. Se calculó el valor IC50 para cada muestra. Se indicó un mayor nivel de actividad de radicales libres porque la mezcla de reacción tenía una menor absorbancia.

2.7.4. Ensayo de fosfomolibdeno (PM)

La actividad antioxidante total se determinó usando la técnica estándar de Prieto et al., 1999. Cada tubo de ensayo que contenía 3 ml de agua destilada y 1 ml de solución reactiva de molibdato recibió un extracto acuoso de hoja de V. leucoxylon y sus FeNP en concentraciones variadas que oscilaron entre 100 µl y 500 µl. Estos tubos se incubaron durante 90 min a 95 ◦C. La absorbancia de la mezcla de reacción se midió a 695 nm después de que estos tubos se ajustaron a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos después de la incubación. El estándar de referencia fue el ácido ascórbico [35].

2.8. Evaluación de la actividad antiinflamatoria in vitro

El efecto antiinflamatorio del extracto acuoso de hojas de V. leucoxylon y sus FeNP generados se evaluó utilizando el método de desnaturalización de proteínas descrito por Elias et al., 1988, con ligeras modificaciones [36]. Como fármaco estándar se utilizó diclofenaco sódico. Se mezcló una mezcla de reacción que comprendía 2 ml de concentración conocida de FeNP fabricados (100 g/ml) con diclofenaco sódico estándar (100 g/ml) y 2,8 ml de solución salina tamponada con fosfato (pH 6,4) con 2 ml de huevo de gallina fresco. albúmina (1 mM) y se incubaron a 27 ± 1 ◦C durante 15 min. La desnaturalización se indujo poniendo la mezcla de reacción en un baño de agua a 70 ◦C durante 10 min. Después de enfriar, se midió la absorbancia a 660 nm usando agua bidestilada como blanco. Cada ensayo se realizó tres veces. Se usó la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de inhibición de la desnaturalización de proteínas:

donde, A=absorbancia de la muestra de prueba; Ac=absorbancia del control.

2.9. Determinación de la actividad citotóxica y anticancerígena de las nanopartículas de hierro mediante el ensayo MTT

Se evaluó el efecto de V. leucoxylon y sus FeNP sintetizados en la viabilidad de las células de fibroblastos no cancerosas L292 y su actividad anticancerígena en el cáncer de piel (A375), cáncer de pulmón (A549) y cáncer oral (KB-3-1). utilizando el ensayo MTT estándar, según Carmichael et al., (1987) [37]. Todas las líneas celulares se obtuvieron del Centro Nacional de Ciencias Celulares (NCCS), Pune, India. Los valores de porcentaje de inhibición del crecimiento celular (IC50) se derivaron usando curvas de dosis-respuesta para cada línea celular, y se usó la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de inhibición del crecimiento. La conversión de MTT a un producto de formazán púrpura por la deshidrogenasa mitocondrial de células sanas es la base de este experimento [38].

2.10. Estudio de curación de heridas in vitro mediante el uso de la prueba de ensayo de raspado

Las capacidades migratorias y de propagación de las células de la línea celular L292 causadas por muestras con concentraciones conocidas de extracto de plantas y nanopartículas de hierro se examinaron en la presente investigación [39]. Se utilizaron placas de cultivo de células animales con medio DMEM suplementado con FBS al 10 por ciento y antibiótico Pen-Strep al 2 por ciento (Darmstadt, Alemania) para iniciar el proceso de cultivo celular. Se usó una punta de pipeta de plástico estéril para raspar la monocapa confluente de células después de que crecieran hasta aproximadamente 50000 células por ml. Se usó solución de PBS para eliminar cualquier residuo celular no deseado. Como control negativo, se usaron células no tratadas, mientras que ácido ascórbico estándar se usó como control positivo para muestras de polímero de concentración conocida. Durante las siguientes 24 h, las células se mantuvieron a 37 ◦C con 5 por ciento de CO2. Para el examen de la migración celular relativa y el cierre de la herida, las capas de células rayadas se incubaron y se tomaron imágenes a intervalos que oscilaban entre 0 h, 6 h, 12 h y 24 h. Se utilizó la calibración de medición de MagVision Software (X64, 2016, Magnus, Nueva Delhi, India) a una resolución de 4x para cuantificar la distancia de separación. Para determinar el cierre de la herida y la tasa de migración se utilizó la fórmula que se muestra a continuación:

con respecto a lo siguiente: A0h=área de la herida medida inmediatamente después de rascarse; ATh=área de la herida medida después de h horas; Rm=tasa de migración (µm/h); Wf=anchura inicial de la herida (µm); y T=tiempo de migración (hora).

2.11. Análisis estadístico

Los datos se presentan como la desviación estándar media y el error estándar, y cada experimento se realizó tres veces. Se utilizó el software SPSS versión 20 para realizar un análisis de varianza (ANOVA) de una vía sobre las diferencias en las puntuaciones medias que existían entre los grupos.

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