La hemodiálisis aumenta el estrés oxidativo a través de radicales centrados en el carbono a pesar de la mejora de la biocompatibilidad

Activación de leucocitos y la resultanteestrés oxidativoInducido pormateriales bioincompatiblesduranteimpacto de la hemodiálisisel pronóstico de los pacientes. A pesar de los múltiples avances endializadores de hemodiálisis, elpronóstico de la hemodiálisispacientes con complicaciones profundamente relacionadas conestrés oxidativo, comoDiabetes mellitus sigue siendo pobre. Por lo tanto, reevaluamos los efectos dehemodiálisisde múltiples especies reactivas de oxígeno utilizando métodos basados ​​en resonancia de espín electrónico para mejorar aún másbiocompatibilidadenhemodiálisis. Se inscribieron 31 pacientes en condición estable sometidos a hemodiálisis utilizando dializadores de polisulfona de alto flujo. Los efectos de la hemodiálisis sobre las especies reactivas de oxígeno se evaluaron mediante dos métodos: MULTiS, que evalúa las actividades de eliminación del suero contra múltiples especies reactivas de oxígeno hidrófilas, e i-Strap, que detecta radicales lipófilos con centros de carbono. Al igual que en estudios anteriores, encontramos que la actividad eliminadora de radicales hidroxilo en suero mejoró significativamente después de la hemodiálisis. A diferencia de estudios anteriores, descubrimos que la actividad eliminadora de radicales alcoxilo se redujo significativamente despuéshemodiálisis. Además, los pacientes con diabetes mellitus mostraron una disminución en la actividad eliminadora del suero contra los radicales alquil peroxilo y un aumento en los radicales de centros de carbono lipófilos después de la hemodiálisis. Estos resultados sugieren que a pesar de las grandes mejoras en las membranas de los dializadores, las formas deespecies de oxígeno reactivasque pueden eliminarse durante la diálisis son limitados y múltiples especies reactivas de oxígeno permanecen en niveles elevados durante la hemodiálisis.

Palabras clave:hemodiálisis, biocompatibilidad, resonancia de espín electrónico del radical alquil peroxilo, MULTiS, i-STrap

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Enfermedad renal crónica(ERC) se asocia conalto estrés oxidativo. (-4)Acumulación de toxina urémica.s con propiedades prooxidantes que conducen amicroinflamacióncausado por elelevación de citoquinas proinflamatoriasses la característica clave deFisiopatología de la ERC. (s-, La hemodiálisis (HD), una terapia de reemplazo renal ampliamente realizada, actúa como un arma de doble filo para reducir el estrés oxidativo en pacientes con ERC. Activación de leucocitos polimorfonucleares, debido al contacto con la membrana u otras superficies artificiales en los circuitos de HD. , es la principal causa del estrés oxidativo inducido por la HD.s-) Por el contrario, la eliminación de toxinas urémicas prooxidativas, especialmente compuestos hidrófilos de bajo peso molecular como el óxido de trimetilamina o los compuestos de guanidino, puede mejorar la naturaleza antioxidante de la HD. lo que conduce a una mejora a largo plazo de la tasa de supervivencia y la calidad de vida enpacientes con ERC. (2,13) ​​Además, la corrección de la acidosis conduce a la reactivación de las enzimas antioxidantes y la reducción de la sobrecarga de volumen, lo que conduce a la prevención del cardio. Las complicaciones vasculares son mecanismos antioxidantes. (4 Por lo tanto, es necesario que los materiales de HD minimicen la activación de los leucocitos y maximicen los efectos antioxidantes. Para superar este problema, se han desarrollado materiales de HD antioxidantes y biocompatibles, ejemplificados por el dializador recubierto de vitamina E. (si7) Sin embargo, a pesar de los numerosos avances en los dializadores de HD, El pronóstico de los pacientes con EH sigue siendo insatisfactorio, especialmente aquellos con diabetes mellitus (DM), una enfermedad que promueve un estado altamente oxidativo. (8) Estas preocupaciones se deben en parte a que los detalles de las experiencias in vivo ampliamente variadas y complejasreacciones relacionadas con el estrés oxidativono han sido suficientemente analizados. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo aclarar el efecto de la HD en la dinámica de las especies reactivas de oxígeno (ROS), como los eventos anteriores a las reacciones de estrés oxidativo, basándose en el concepto de que cada sitio objetivo de las reacciones oxidativas y antioxidantes en el cuerpo debe describirse bioquímicamente. en un tiempo y espacio determinado. Una explicación para esto es unafalta de análisis detalladodel lado aguas arriba de las reacciones relacionadas con el estrés oxidativo que estimulan estas reacciones celulares. La identificación de ROS que actúan como estimuladores de reacciones de estrés oxidativo o interacciones entre ROS para generar estimuladores oxidativos es difícil debido a las altas velocidades de reacción y las complejas cadenas de reacción. Dado que las ROS no son uniformes y las ROS individuales tienen características específicas durante las reacciones in vivo, se requiere un análisis de múltiples ROS. (9-2n Por lo tanto, para mejorar la biocompatibilidad basada en el uso de materiales antioxidantes y biocompatibles, se deben comprender los cambios en la dinámica de ROS causados ​​por la EH.

Para investigar la dinámica de ROS durante la HD, empleamos dos métodos recientemente desarrollados basados ​​en resonancia de espín electrónico (ESR). el ensayo de eliminación de radicales libres hidrófilos múltiples (MULTIS) y el ensayo de detección de radicales lipófilos en sangre total (i-STrap). Aunque la investigación sobre la actividad de eliminación de ROS mediante ESR no es extensa, sigue siendo el único método disponible para identificar el tipo y examinar la dinámica. de ROS. El método combina un sistema de flujo de tipo cromatografía líquida de alto rendimiento con un sistema ESR y emplea 5-(2,2-dimetil-1.3-propoxiciclofosforilo)-5- metil-1-pirrolinaNóxido (CYPMPO) como trampa de espín. MULTIS proporciona mayor sensibilidad y estabilidad para la medición de eliminación de ROS que los ensayos de VSG convencionales.22-24) Uno de nuestros coautores informó anteriormente las actividades de eliminación de ROS medidas por MULTIS en pacientes con ERC en etapa 5. Sin embargo, no evaluaron el efecto de la HD.e2) Además, el método i-STrap es un método basado en ESR que detecta ROS en sangre total utilizando 2-difenilfosfinoil-2-metil-3,{ {20}}dihidro-2H-pirrol N-óxidoDPhPMPO) como su trampa de espín y mide la ESR después de una extracción orgánica, lo que refleja las ROS lipófilas.2s.26 En este estudio, encontramos que los niveles de varias ROS eran aumentan y no se eliminan con la HD, lo que indica que las reacciones en cadena radicales aún no se controlan adecuadamente después de la HD. Esto puede afectar lapronóstico de los pacientes con ERC.

Materiales y métodos

Sujetos y consentimiento informado. Todos los procedimientos realizados en seres humanos se realizaron después de obtener el consentimiento individual por escrito. El protocolo utilizado fue aprobado por el Comité de la Universidad de Tecnología de Tsukuba (Autorización No. 201809). Este es un estudio observacional; por lo tanto, se realizaron intervenciones a los pacientes. Se incluyeron en el estudio un total de 31 pacientes estables en HD. Obtuvimos y registramos información clínica y demográfica de cada paciente. Todos los pacientes fueron tratados con dializadores de membrana de polisulfona de alto flujo (Toray Medical Co., Ltd., Tokio, Japón) con diversas superficies de membrana, adaptadas a la constitución corporal de cada individuo. Los pacientes se dividieron en dos grupos según la causa de su enfermedad renal terminal: el grupo no diabético (grupo no DM, n=17) y el grupo diabético, n=14).

Coleccion de muestra. Las muestras de sangre se obtuvieron al inicio y al final del tratamiento de diálisis a partir del muestreo ubicado en el lado arterial del circuito de HD. Para las mediciones MULTIS, los sueros se separaron y almacenaron en un congelador a {{0}} grados (hasta que se realizó la medición; para las mediciones i-Strap, se recogieron muestras de sangre completa en tubos recubiertos con heparina que estaban permitidos). Dejar reposar durante una hora antes de las mediciones. Mediciones de múltiples actividades de eliminación de radicales libres en suero. Las actividades de eliminación de ROS hidrófilas se midieron con el método MULTIS utilizando protocolos descritos previamente con modificaciones menores. , superóxido (0,"), radical alcoxilo (RO"), radical alquil peroxilo (ROO") y oxígeno singlete ('0,). Se midieron un espectrómetro ESR de banda X ( RR-Xl ESR: Radical Research Inc., Tokio, Japón) que emplea modulación de campo de 100 kHz y software de operación WN-RAD (Radical Research Inc.). Los reactivos de captura de espín ESR utilizados fueron CYPMPO para " OH, O, RO' y ROO' y 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina (TEMP) para 'O. Los ajustes típicos del espectrómetro fueron los siguientes: ancho de modulación de campo: 0,1 mT; potencia de microondas, 10 mW; ancho y velocidad de escaneo de campo+7.5 mT/2 min; y constante de tiempo, 0,1 s. Cada ROS se generó mediante iluminación in situ con luz UV/visible de un iluminador RUVF-203SR UV, Radical Research Inc.) equipado con una lámpara de arco de mercurio/xenón de presión media de 200 W y Guía de luz de cuarzo, conectada a la cavidad del resonador. Las fuentes de luz, los tiempos de iluminación, los precursores y los fotosensibilizadores utilizados para producir ROS se resumen en la Tabla 1. Las actividades de eliminación de ROS se calcularon de acuerdo con un método descrito previamente22) y se convirtieron en la unidad equivalente a los eliminadores puros conocidos: glutatión (GSH) para OH. y 'O, superóxido dismutasa (SOD) para ácido O, 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico (Trolox) para RO', y un -Las mediciones de ácido lipoico para ROO'MULTIS para cada ROS se realizaron por triplicado.

Medición de lipófilos

Actividad de eliminación de Ros en sangre total utilizando i-Strap. La actividad de eliminación de RO lipófila se midió utilizando el sistema de medición de ESR i-Strap ki (Dojin-Glocal/Dojindo, Kumamoto, Japón) según el protocolo del fabricante y un informe anterior.2s Este método se basa en la reacción competitiva entre los antioxidantes en sangre completa y DPhPMPO con hidroperóxido de terc-butilo (BuOOHradical). Las muestras de sangre completa se incubaron con DPhPMPO (1{{10}} mM) y prueba-BuOOH (10 mM) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, el centrifugado Los aductos en la fase orgánica se extrajeron usando soluciones de cloroformo y metanol; las mediciones de ESR se realizaron usando estas muestras orgánicas. Las condiciones de medición fueron las mismas que para la medición MULTIS, excepto por el ancho y la velocidad de escaneo de campo, establecidos en +5 .0 mT/2 min. No hubo antioxidantes específicos para la medición de i-STrap; por lo tanto, la actividad de eliminación se expresó como un valor de 10/-1, donde "0" denota la intensidad de la señal sin una muestra y "' denota la señal. intensidad con una muestra (28)Reactivos. CYPMPO se obtuvo de RR INC. (Japón); riboflavina, diclorhidrato de 2,2'-azobis (2-amidinopropano) (AAPH), texto-BuOOH, dimetilsulfóxido (DMSO) y rosa de Bengala se compraron de Sigma-Aldrich Japan (Tokio, Japón) y se compró TEMP de Tokyo Chemical Industry (Tokio, Japón). El peróxido de hidrógeno y los tampones se obtuvieron de WakoChemical Co. (Osaka, Japón). Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó utilizando el software informático Prism 6 para Mac OS X (GraphPad SoftwareInc., La Jolla, CA). Los datos se probaron utilizando el Student's prueba t pareada. Los datos se expresaron como valores medios con un intervalo de confianza del 95% (IC del 95%).