Si bien no parece que el porcentaje de TEX aumente con la gravedad de la enfermedad (Figura 6C complementaria) o con la edad de los animales propensos al lupus (6), el número total de células T infiltrantes aumenta con la gravedad de la enfermedad en estos modelos y pacientes humanos. Por lo tanto, puede haber un punto más allá del cual el agotamiento puedeya no controla la enfermedad. Trabajos previos sugirieron que aquellos pacientes con una firma de CD8 más TEX en sangre periférica tenían menos probabilidades de brote en comparación con aquellos que carecían de esta firma (52). Sin embargo, lo que ocurre a nivel del órgano diana sigue siendo una cuestión pendiente, y será interesante, en trabajos futuros, determinar si la proporción de células agotadas en una biopsia se puede correlacionar con los resultados de la enfermedad.

Según estudios relevantes, la cistanche es una hierba tradicional china que se ha utilizado durante siglos para tratar diversas enfermedades. Se ha demostrado científicamente que posee propiedades antiinflamatorias, antienvejecimiento y antioxidantes. Los estudios han demostrado que la cistanche es beneficiosa para los pacientes que padecen enfermedades renales. Se sabe que los ingredientes activos de la cistanche reducen la inflamación, mejoran la función renal y restauran las células renales dañadas. Por lo tanto, la integración de la cistanche dentro de un plan de tratamiento de la enfermedad renal puede ofrecer grandes beneficios a los pacientes en el manejo de su condición. Cistanche ayuda a reducir la proteinuria, reduce los niveles de BUN y creatinina, y disminuye el riesgo de daño renal adicional. Además, la cistanche también ayuda a reducir los niveles de colesterol y triglicéridos, que pueden ser peligrosos para los pacientes que padecen enfermedades renales.

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Será importante identificar los mecanismos por los cuales cada uno de estos tipos de células y eventos potencialmente dañinos son inhibidos por el riñón y cómo las terapias nuevas y existentes pueden afectarlos. Se espera que este trabajo nos permita a nosotros y a otros dirigirnos a estas poblaciones variables de células T de manera más específica, abriendo así nuevas vías terapéuticas.

Métodos

animales Se adquirieron ratones C57BL/6 de Jackson Laboratory. Los ratones MRL/lpr se obtuvieron inicialmente de Jackson Laboratory y se mantuvieron en nuestro laboratorio. Los ratones Fc R2B–/–.Yaa se obtuvieron de Silvia Bolland (Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, NIH, Rockville, Maryland, EE. UU.) y se mantuvieron en nuestro laboratorio. Los ratones se envejecieron y se midió la proteinuria antes del sacrificio, como se documenta en la Tabla complementaria 2.

Aislamiento de células T de riñón y bazo. Las células T se aislaron como se describió previamente (6). En resumen, después del sacrificio, se extirparon los bazos y se perfundió a los animales con 40 ml de HBSS hasta que se produjo el blanqueo completo del hígado y el riñón. Los KIT se aislaron usando el Octodisociador (Miltenyi Biotec) en presencia de 1600 unidades Kunitz/ml de colagenasa D (Roche Diagnostics) y 0,2 mg/ml de ADNasa IV (MilliporeSigma) durante 30 minutos a 37 grados. Se realizó la lisis de glóbulos rojos y las células se filtraron a través de un colador de células (nylon 100 μM; Falcon, Corning). Los esplenocitos se aislaron mediante disociación mecánica entre 2 portaobjetos de vidrio esmerilado y se filtraron a través de un filtro de malla de 70 μm después de la lisis de RBC.

Las células se tiñeron como se describió previamente (6) con el siguiente panel: anti-CD8 (Lyt-2/TIB-105, Pac-Blue, producido internamente), anti-CD4 (GK{{9 }}.5, en PE, adquirido de BioLegend) y anti-CD90.2 (Thy1.2/30H12, Al488, producido internamente) para ratones MRL/lpr o anti-CD90.2 (Thy1.2/30H12 , Al647, de producción propia) para Fc R2B–/–. Se utilizó Yaa Ghost BV510 (Tonbo) para excluir las células muertas. Para todos los anticuerpos "internos", los clones de hibridomas están disponibles comercialmente y los anticuerpos se purificaron como se describe (6).

Las células T se clasificaron usando un FACSAria (BD Biosciences). Después de la clasificación, las células se lavaron dos veces con BSA al 2 por ciento en PBS. Luego se agregaron reactivos anti-CD45 HTO a una dilución de 1:50 a cada una de las muestras clasificadas. Se utilizó Anti-CD45 TotalSeq-A0096 30-F11 (BioLegend) para la cohorte Main-Seq y TotalSeq-C0096 30-F11 (BioLegend) para ambas cohortes TCR-Seq. Después de la tinción con HTO, las células se lavaron dos veces con BSA al 2 por ciento en PBS.

Preparación de bibliotecas y RNA-Seq de células T. Las células se contaron y cargaron en el sistema 10x Genomics Chromium según las instrucciones del fabricante. Se generaron bibliotecas de expresión génica, TCR y hashtag de anticuerpos/códigos de barras de características, su calidad se evaluó a través de la cinta de pantalla Agilent TapeStation High Sensitivity D5000 y sus cantidades se cuantificaron con el KAPA Library Quantification Kit for Illumina Platforms. Para la cohorte Main-Seq, se utilizó la biblioteca 3PrimeV2; la biblioteca de códigos de barras de características se generó de acuerdo con el protocolo del Centro del Genoma de Nueva York (56). Para las cohortes TCR-Seq, las bibliotecas 5PrimeV1 se obtuvieron de 10x Genomics. Para etiquetar, seguimos las instrucciones de "código de barras de características" del fabricante. Las bibliotecas se agruparon y secuenciaron en NovaSeq (Illumina Biosciences). Los archivos FASTQ se generaron y alinearon con el genoma de referencia de ratón mm10 con Cell Ranger 5.0.0 (10x Genomics) para producir la matriz de recuento de genes-células y células-anticuerpos.

Procesamiento de datos scRNA-Seq. Los datos sin procesar 10x de cada muestra se desmultiplexaron y los archivos FASTQ se generaron utilizando la canalización "rápida" Cell Ranger (v5.0.0, 10 x Genómica). Se usó el "recuento" de Cell Ranger para alinear las lecturas con el genoma de referencia mm10, y se generaron tablas de cuantificación del transcrito de ARNm y del identificador molecular único (UMI) de HTO. Los archivos de matriz de código de barras sin procesar generados a partir de la canalización de Cell Ranger se utilizaron más para el análisis posterior utilizando el paquete Seurat (v4.0.0) (12) en R (v3.4.3).

Control de calidad inicial y procesamiento. Se filtraron las células que expresaban menos de 200 genes, o con más del 10 por ciento de UMI mapeados en el ADN mitocondrial. Las tablas HTO se agregaron al conjunto de datos y se normalizaron mediante un método de relación logarítmica centrada mediante la función "NormalizeData". El recuento normalizado de HTO se usó para determinar si cada perla de gel en emulsión contenía una sola célula usando la función "MULTIseqDemux" de Seurat y la inspección manual de las células, donde una célula se consideraba un singlete si la expresión de un solo HTO representaba más del 70 por ciento de la expresión total de HTO en esa célula; de lo contrario, la celda se consideró un doblete y se eliminó. Los valores de expresión génica para cada celda se log2 -normalizaron usando la función "NormalizeData", donde la expresión de un gen se normalizó a la expresión total de todos los genes en esa celda y se escalaron por un factor de 10,{{8 }}. Las puntuaciones de UMI, contenido mitocondrial y gen de hemoglobulina y contenido de gen ribosómico se "regresaron" utilizando la función "ScaleData" de Seurat.

Reducción de dimensionalidad y clustering. Los genes variables se detectaron mediante el método "mean.var.plot" en la función "FindVariableFeatures" con un corte predeterminado, que calcula la expresión media y la dispersión (log[varianza/media]) por gen, y luego agrupa los datos en 20 contenedores en función de su expresión media. Luego, se seleccionaron genes variables en función de la dispersión con puntuación z dentro de cada contenedor. Estos genes variables se usaron para la reducción de la dimensionalidad basada en el análisis de componentes principales (PCA) usando la función "RunPCA". Se utilizó "ElbowPlot" para evaluar los primeros 50 componentes principales, y los componentes principales que representaron la mayor variabilidad en los datos se seleccionaron para un mayor análisis de agrupamiento y reducción dimensional de UMAP.

Para identificar distintos grupos de células, se realizó un agrupamiento no supervisado utilizando la función "FindClusters", que calcula los k-vecinos más cercanos de acuerdo con la expresión génica variable en todas las células, construyendo así un gráfico de vecino más cercano compartido utilizando el algoritmo de Lovaina. Para evitar el agrupamiento excesivo, probamos diferentes parámetros de resolución ("res"), que iban desde 0.1 a 2 en incrementos de 0.1, y la progresión del agrupamiento se evaluó y visualizó usando "Cluster " (v 0.4.3) (57). La resolución óptima se determinó sobre la base de la separación continua antes de la "agrupación excesiva", como se observa por el cruce creciente entre grupos. El agrupamiento de baja resolución se definió entonces como el análisis de todas las células dentro de una cohorte completa, mientras que el agrupamiento de alta resolución se definió como el agrupamiento en una subpoblación preseleccionada, es decir, células CD4 plus, CD8 plus o Treg previamente definidas en nuestro análisis de baja resolución. análisis. Con base en estas observaciones, elegimos las resoluciones 0.9, 1.4, {{20}}.6 y 0.9, respectivamente, para Main-Seq, CD4 plus, CD4 más Treg sub y CD8 más de la cohorte 1 y resolución 0,7 para las células T CD8 más de la cohorte combinada. Los grupos de células se visualizaron usando gráficos de reducción dimensional UMAP.

La función "FindAllMarkers" con la configuración predeterminada se utilizó para buscar DEG en cada grupo, en comparación con todos los demás grupos, utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon con genes detectados en un mínimo del 10 por ciento de las células, un mínimo de 0.25 promedio de cambio de pliegue logarítmico, y un mínimo de 0.01 valor P ajustado por Bonferroni.

Análisis de armonía. Para el UMAP combinado en la Figura 8, las 3 cohortes ejecutadas de forma independiente se fusionaron utilizando Harmony (58) con configuraciones de parámetros predeterminadas.

Evaluación del ciclo celular. La función "CellCycleScoring" en Seurat se utilizó para calcular la puntuación de expresión de marcador de fase G1, G2/M y S en cada celda utilizando la estrategia de puntuación descrita anteriormente (59). El número de células que se determinó que estaban en la fase G1, G2/M o S se calculó por grupo y la desviación de la distribución general se evaluó mediante el análisis de χ2.

GSEA y mapeo de expresiones. Los valores de P para GSEA se determinaron mediante la prueba de Wilcoxon para las firmas de conjuntos de genes publicados, como se define en la Tabla complementaria 1. Usando "ggplot2" en Seurat, los valores de P -log10 se trazaron en los UMAP.

Análisis adicionales. Los gráficos de barras, los gráficos de puntos y los gráficos de PCA se construyeron utilizando ggplot2 en R. Los mapas de calor se generaron utilizando la función "mapa de calor" en R.

Análisis de datos TCR. Los datos de TCR se procesaron usando cell ranger vdj with–reference {{0}} refdata-cellranger-vdj-GRCm38-alts-ensembl-3.1.0 para ensamblar TCR y cadenas y determinar clonotipos . Las células con 1 TCR productivo ( y ) se mantuvieron para su posterior análisis, mientras que las cadenas de TCR no productivas se excluyeron. Las células T clonales se definieron como células que expresan receptores TCR- y - compartidos con secuencias CDR3 idénticas a nivel de nucleótidos.

Análisis de trayectorias pseudotemporales. El análisis de trayectoria utilizando los recuentos de genes procesados ​​por Seurat se realizó utilizando Monocle 3 (versión 0.1.3) para modelar la diferenciación de células T CD4 más. Se usó el método de incrustación de gráfico inverso DDRTree para reducir la dimensionalidad, las celdas se ordenaron a lo largo de una trayectoria usando la función "orderCells" y la trayectoria se visualizó en el espacio dimensional reducido.

Para modelar la diferenciación de células T CD8 más, usamos Slingshot con "start. clubs" configurado como grupo B6/ingenuo. Las celdas se ordenaron por pseudotiempo de Slingshot y se agruparon como cúmulos de Seurat para proyectar la trayectoria del cúmulo. El resultado del linaje de la trayectoria de Slingshot se trazó en la celda CD8 plus Seurat UMAP.

Análisis de red regulatoria de FT. El flujo de trabajo SCENIC v.1.1.2 se utilizó en R para identificar regulones utilizando el recuento y los grupos procesados ​​por Seurat según un estudio anterior (60). Luego se crearon mapas de calor como se describe anteriormente.

Puntuación histológica. La preparación y puntuación de la histología renal se realizaron como se definió previamente (61).

Disponibilidad de datos y materiales. Todos los análisis y visualizaciones se realizaron en R. La metodología y el análisis específicos utilizando los programas Seurat publicados se detallan en la sección Métodos. Los datos, los metadatos y los resultados del análisis, como la identificación de grupos, se depositan en el Gene Expression Omnibus del Centro Nacional de Información Biotecnológica (GSE197339).

Estadísticas. Las estadísticas se calcularon en R como se indica en las secciones específicas del análisis o GraphPad Prism mediante 1-way ANOVA con la prueba de Tukey para comparaciones múltiples, 2-way ANOVA con medidas repetidas o análisis χ2 como se define en las leyendas de las figuras, con valores de P representados como *P < 0.05, **P < 0.{{10}}1, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Aprobación del estudio. Todo el trabajo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh o de la Universidad de Yale.

Contribuciones de autor

JST y MJS concibieron el estudio. Metodología desarrollada por SS, MC, JST y MJS. JST y SS fueron investigados. Datos visualizados JST y SS. JST y MJS adquirieron financiación. JST y MJS proporcionaron la administración del proyecto. JST y MJS proporcionaron supervisión. JST y MJS escribieron el borrador original. JST, MJS, SS y MC revisaron y editaron el borrador.

Expresiones de gratitud

Nos gustaría agradecer a Minjung Kim por sus incansables esfuerzos en el laboratorio, lo que permitió realizar este trabajo, y reconocer la visión crítica del proyecto de Kevin Nickerson, Rachael Gordon y Peter Lipsky y la revisión crítica de este trabajo por parte de Fadi Lakkis y Warren. Shlomchik. Además, nos gustaría agradecer a University of Pittsburgh Single Cell Core y específicamente a Tracy Tabib, quien ayudó a completar la preparación de la biblioteca y la tecnología 10x Genomics.

La financiación fue proporcionada por Lupus Research Alliance, Novel Research Grant (a JST); NIH/Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel subvención K08AR075056 (para JST); y NIH/Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas subvención R01 AI137132 (a MJS).

Dirigir la correspondencia a:Jeremy S. Tilstra, 3500 Terrace Street, BST S705A, Pittsburgh, Pensilvania 15261, EE. UU. Teléfono: 412.383.8861; O a Mark J. Shlomchik, W1052 Biomedical Science Tower, 200 Lothrop Street, Pittsburgh, Pennsylvania 15261, EE. UU. Teléfono: 412.648.8771.

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