La deficiencia de Smad3 de la parte Ⅰ mejora la terapia basada en islotes para la diabetes y la lesión renal diabética al promover la proliferación celular a través del mecanismo dependiente de E2F3-

Abstracto

1. Justificación

La proliferación celular deficiente es uno de los factores perjudiciales que dificultan la terapia de reemplazo de células de los islotes para pacientes con diabetes. Smad3 es un factor transcripcional importante de la señalización de TGF y se ha demostrado que promueve la diabetes al inhibir la proliferación celular. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que los islotes deficientes en Smad3-pueden ser una nueva terapia de reemplazo celular para la diabetes.

2. Métodos

Examinamos esta hipótesis en ratones diabéticos tipo-1 inducidos por estreptozocina y ratones db/db diabéticos tipo-2 mediante el trasplante de islotes knockout (KO) y de tipo salvaje (WT) de Smad3 debajo de la cápsula renal, respectivamente. Se examinaron los efectos de Smad3KO frente a la terapia de reemplazo de islotes WT sobre la diabetes y la lesión renal diabética. Además, se aplicó RNA-seq para identificar el gen diana corriente abajo subyacente a la proliferación celular regulada por Smad3- en islotes de ratón Smad3KO-db/db frente a Smad3WT-db/db.

3. Resultados

En comparación con la terapia con islotes Smad3WT, el tratamiento con islotes Smad3KO produjo un efecto terapéutico mucho mejor en la diabetes tipo-1 y tipo-2 al reducir significativamente los niveles séricos de glucosa en sangre y HbA1c y proteger contra las lesiones renales diabéticas al prevenir un aumento de la creatinina sérica y el desarrollo de proteinuria, expansión de la matriz mesangial y fibrosis. Estos se asociaron con un aumento significativo en la proliferación de células injertadas y los niveles de insulina en sangre, lo que resultó en una mejor intolerancia a la glucosa. Mecánicamente, RNA-seq reveló que, en comparación con los islotes de ratón Smad3WT-db/db, la eliminación de Smad3 de los islotes de ratón db/db regulaba notablemente E2F3, un regulador fundamental de la entrada de G1/S en el ciclo celular. Otros estudios encontraron que Smad3 podría unirse al promotor de E2F3 y, por lo tanto, inhibir la proliferación celular a través de un mecanismo dependiente de E2F3-, ya que silenciar E2F3 anuló el efecto proliferativo en las células Smad3KO.

4. Conclusión

La terapia de reemplazo de islotes deficientes3-Smad puede mejorar significativamente la diabetes tipo-1 y tipo-2 y proteger contra la lesión renal diabética, que está mediada por un mecanismo novedoso de E2F3-dependiente proliferación celular.

Palabras clave

Smad3, trasplante de islotes, diabetes, E2F3, ciclo celular.

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Introducción

tipo-1 y diabetes mellitus tipo 2 (T1DM y T2DM). el trasplante de células o islotes es una terapia atractiva y se ha aplicado con éxito en pacientes con DM1. Los islotes o células que se utilizan para el trasplante suelen ser del donante cadavérico o de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) [1, 2]. Se han completado más de 1500 casos de trasplante clínico de islotes en pacientes con DM1 siguiendo el bien establecido Protocolo de Edmonton [1]. Aunque alrededor del 50 por ciento de los pacientes son independientes de la insulina durante 5 años después del trasplante, la falla del injerto es una preocupación clínica común. Uno de los factores que dificultan el trasplante de islotes es la tasa de proliferación extremadamente baja de las células de los islotes injertados [3]. Además, los estímulos peligrosos del microambiente del injerto, como la inflamación, el rechazo inmunitario del aloinjerto y el estrés metabólico, pueden hacer que las células trasplantadas sufran apoptosis y necrosis, lo que da como resultado la pérdida progresiva del injerto [1]. Por lo tanto, la mejora de la proliferación de células trasplantadas es fundamental para el éxito del tratamiento de la diabetes basado en el trasplante de islotes.

La señalización del factor de crecimiento transformante-beta (TGF-) desempeña funciones pleiotrópicas en muchos procesos biológicos. La transducción de señales se inicia mediante la unión del ligando TGF- a su receptor de tipo 2 TGFBR2. Este último recluta y activa el receptor tipo 1 TGFBR1 por fosforilación. TGFBR1 activado fosforila aún más las proteínas Smad reguladas por receptor (R-Smads), Smad2 y Smad3. Los R-Smad forman un complejo con Smad4, que se traslada al núcleo para regular transcripcionalmente los genes diana [4, 5]. Se informa que el islote pancreático mantiene la señalización de TGF- universalmente activada como lo revela un nivel relativamente alto de Smad2/3 fosforilado en las condiciones fisiológicas. Sin embargo, en respuesta a la demanda de insulina, la actividad de señalización de TGF-disminuye, acompañada de una mayor proliferación celular [6]. Además, la inhibición farmacológica de la señalización de TGF- promueve la proliferación celular in vitro e in vivo [7, 8]. Más importante aún, la eliminación de Smad3 da como resultado una proliferación celular más robusta en comparación con la eliminación de Smad2 en ratones con pancreatectomía parcial, lo que indica que Smad3, pero no Smad2, es el principal efector aguas abajo de la señalización de TGF para regular la proliferación celular [6]. Estudios posteriores muestran que Smad3 suprime la proliferación celular al inducir la expresión de inhibidores de la cinasa dependiente de ciclina (CDKI), incluidos p16, p21 y p57 [7, 8].

Nuestro trabajo reciente también encontró que la eliminación de Smad3 en ratones db/db (Smad3KO-db/db) previene la aparición de diabetes manifiesta sin obesidad, hiperglucemia, resistencia a la insulina e intolerancia a la glucosa. Curiosamente, los ratones Smad3KO-db/db muestran hiperplasia de los islotes con una proliferación celular significativamente mayor e hiperinsulinemia persistente [9]. Esto implica que Smad3 es patógeno en la diabetes y que dirigirse a Smad3 en las células puede representar una nueva terapia de reemplazo de células o islotes para la diabetes. Esto se examinó en el presente estudio mediante el uso de trasplante de islotes de inactivación de Smad3 (Smad3KO) en ratones diabéticos tipo-1 inducidos por estreptozocina (STZ) y en ratones diabéticos tipo-2 db/db.

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Resultados

1. El trasplante de islotes Smad3KO produjo un mejor efecto terapéutico en la diabetes tipo-1 inducida por STZ

Para comparar la eficacia terapéutica de los islotes Smad3KO versus Smad3WT en la diabetes, primero realizamos un trasplante de islotes singénicos debajo de la cápsula renal de ratones diabéticos inducidos por STZ donde la hiperglucemia es causada por una deficiencia celular. A los ratones diabéticos en el día 7 después de la inyección de STZ se les trasplantaron 3 dosis de islotes (50, 100 y 200 islotes por ratón) que se aislaron recientemente de ratones Smad3WT o Smad3KO. Tanto los niveles aleatorios de glucosa en sangre (RBG) como los de glucosa en sangre en ayunas (FBG) se monitorearon semanalmente durante 16 semanas. Las dosis de trasplante se seleccionaron en base a los hallazgos previos de que el trasplante de 300 islotes es suficiente para restaurar rápidamente la euglucemia en ratones sin células [10]. Como se muestra en las Figuras 1A a D, los ratones diabéticos con operación simulada desarrollaron hiperglucemia persistente durante 16 semanas. El trasplante con una dosis baja (50 islotes) de Smad3KO o islotes WT no logró reducir los niveles de RBG y FBG. Sin embargo, los ratones diabéticos que recibieron 100 islotes Smad3KO, pero no la misma dosis de islotes Smad3WT, recuperaron gradualmente el RBG y FBG normales similares a los que recibieron 200 islotes Smad3KO o WT. También encontramos que el efecto reductor de la glucosa en sangre se atribuye únicamente a los islotes trasplantados, ya que la hiperglucemia se repitió inmediatamente una vez que se extrajo el riñón portador de los islotes a partir de las 16 semanas (flecha, Figura 1A).

También se desarrolló tolerancia alterada a la glucosa en los ratones diabéticos operados de forma simulada, que se alivió significativamente al trasplantar la dosis alta (200) de islotes Smad3KO o WT y 100 islotes Smad3KO, pero no con la dosis baja de 50 islotes Smad3KO o WT y 100 Islotes Smad3WT (Figura 1E y G). Como era de esperar, los ratones diabéticos inducidos por STZ no desarrollaron resistencia a la insulina.

Por el contrario, se observó una respuesta prolongada a la insulina en ratones hiperglucémicos con la operación simulada o la terapia ineficaz con 50 islotes Smad3WT o KO y 100 islotes Smad3WT (Figura 1F y H). En línea con la euglucemia recuperada y la intolerancia a la glucosa mejorada, los ratones diabéticos que recibieron 200 islotes Smad3KO o WT y 100 islotes Smad3KO, pero no 50 islotes Smad3KO o WT y 100 islotes Smad3WT, mostraron una disminución del nivel de HbA1c en sangre acompañado de un aumento del nivel de insulina (Figura 1 I y J). Además, la diabetes inducida por STZ causó un retraso en el crecimiento, que se recuperó parcialmente en ratones trasplantados con 200 islotes Smad3KO o WT y 100 islotes Smad3KO (Figura S1). Además, los ratones diabéticos inducidos por STZ también desarrollaron nefropatía diabética a las 16 semanas, como lo demuestra la expansión mesangial, la fibrosis intersticial, la proteinuria y el aumento de la creatinina sérica (Figura 2). Curiosamente, el tratamiento con 100 islotes Smad3KO, pero no con 100 islotes Smad3WT, resultó en protección contra el desarrollo de enfermedad renal diabética, aunque esto también fue notable en ratones diabéticos tratados con la dosis alta de 200 islotes Smad3KO o WT (Figura 2). Estos hallazgos demuestran una mejor eficacia terapéutica de los islotes Smad3KO en la diabetes inducida por STZ y sugieren una reducción de alrededor del 50 por ciento en los islotes necesarios para lograr un control glucémico competente y protección contra la lesión renal diabética mediante el uso de una terapia de reemplazo de islotes deficientes en Smad3- para diabetes.

2. El trasplante de islotes Smad3KO produjo un mejor efecto terapéutico en la diabetes tipo-2 en ratones db/db

Se ha informado que el trasplante de islotes mejora la DM2 en un modelo de ratón alimentado con una dieta rica en grasas desafiado con una dosis baja de STZ [11]. A continuación, investigamos si el trasplante de islotes Smad3KO también produce un mejor efecto terapéutico en la DM2 al tratar ratones db/db con 250 islotes Smad3KO o WT desde la edad prediabética de la semana 4 a la semana 12. Descubrimos que el trasplante con Smad3KO o WT los islotes no influyeron en el crecimiento de los ratones db/db receptores (Figura S2). Aunque los ratones db/db que recibieron el trasplante de islotes Smad3WT mostraron una tendencia a la disminución de RBG y FBG en comparación con los ratones db/db operados de forma simulada, los ratones db/db trasplantados con la dosis equivalente de islotes Smad3KO mostraron una disminución significativa en RBG y FBG (Figura 3A y B). La intolerancia a la glucosa desarrollada en ratones db/db mejoró significativamente con el trasplante de islotes Smad3KO pero no con Smad3WT, aunque la resistencia a la insulina no se alteró (Figura 3C-F). Consistentemente, en comparación con el trasplante de islotes Smad3WT o la operación simulada, los ratones db/db tratados con trasplante de islotes Smad3KO también presentaron una disminución significativa en los niveles de HbA1c en sangre, que estuvo acompañada por un aumento notable en los niveles de insulina en sangre (Figura 3G y H). Además, el tratamiento con 250 islotes Smad3KO atenuó significativamente la expansión mesangial glomerular (Figura 4). Sin embargo, dado que no se evidenciaron cambios significativos en la creatinina sérica, proteinuria y fibrosis renal en ratones db/db a la edad de 12 semanas, no se encontraron alteraciones obvias en estos parámetros en ratones db/db tratados con Smad3KO o islotes WT (Figura 4). En conjunto, estos datos indican de nuevo que el trasplante de islotes Smad3KO produce un mejor tratamiento que los islotes Smad3WT en ratones db/db diabéticos tipo-2.

3. La deficiencia de Smad3 promueve la proliferación celular en los islotes injertados tanto en ratones diabéticos inducidos por STZ como en ratones db/db.

A continuación, investigamos los posibles mecanismos por los que el trasplante de islotes Smad3KO produce un mejor efecto terapéutico tanto en T1DM como en T2DM. Primero examinamos la masa celular en los islotes injertados mediante inmunotinción con insulina. En la diabetes inducida por STZ, no pudimos detectar la existencia de células positivas para insulina debajo de la cápsula renal en ratones injertados con 50 islotes Smad3KO o WT en la semana 16 después del trasplante, lo que indica la pérdida de células. Inesperadamente, los ratones diabéticos que recibieron 100 islotes Smad3WT mostraron solo unos pocos grupos de células productoras de insulina dispersas, pero esto aumentó en gran medida en los ratones diabéticos tratados con 100 islotes Smad3KO, lo que resultó en un aumento de casi 17-veces en la masa celular (Figura 5A y B). Curiosamente, los ratones diabéticos que recibieron una dosis alta de 200 islotes Smad3KO o WT exhibieron una masa celular similar (Figuras 5A y B). Estos hallazgos fueron consistentes con el efecto dependiente de la dosis del trasplante de islotes sobre la hiperglucemia, como se muestra en las Figuras 1A y B.

A continuación, investigamos si el aumento de la masa celular en los injertos de islotes Smad3KO está asociado con una mayor proliferación celular. La inmunofluorescencia de dos colores mostró que en la semana 16 posterior al trasplante de islotes, los ratones tratados con 100 islotes Smad3WT mostraron PCNA indetectable o raro más insulina más células, que aumentó principalmente en aquellos que recibieron 100 islotes Smad3KO o una dosis alta de 200 Smad3KO o WT islotes (Figura 5C y D). Luego investigamos si Smad3 controla la proliferación celular temprana en los islotes injertados en condiciones diabéticas progresivas mediante el etiquetado de BrdU en el día 7 posterior al trasplante de islotes cuando los niveles de glucosa en sangre permanecieron altos. El etiquetado de BrdU reveló un aumento de 3-veces en BrdU más insulina más células en 100 injertos de islotes Smad3KO en comparación con la misma dosis de injertos de islotes Smad3WT (Figura 5E y F). Este hallazgo indica que la deficiencia de Smad3 promueve en gran medida la proliferación celular a través del ciclo celular en fase S en condiciones de hiperglucemia, lo que contribuye a un aumento de 17-veces en la masa celular como se observa en la semana 16 después del trasplante de islotes (Figura 5A y B) . En conjunto, todos estos hallazgos sugieren que la deficiencia de Smad3 promueve en gran medida la proliferación celular, restaurando así la euglucemia en la diabetes tipo -1 inducida por STZ.

Del mismo modo, también se detectaron actividades proliferativas de células altas en injertos de islotes Smad3KO en ratones db/db diabéticos tipo-2, como se muestra por un aumento de 5-veces en la masa celular en comparación con aquellos con injertos de islotes Smad3WT en el edad de la semana 12 después del trasplante de islotes (Figura 6A y B), que se asoció con un aumento de 2.5-veces en insulina más PCNA más células (Figura 6C y D). Mediante el uso de marcaje con BrdU, también detectamos un aumento de 3-veces en insulina más BrdU más células en injertos de islotes Smad3KO el día 7 después del trasplante en ratones db/db de 12-semanas de edad (Figura 6E y F). Este hallazgo confirma nuevamente que las células que carecen de Smad3 son resistentes a la hiperglucemia y siguen siendo altamente proliferativas para mantener la masa celular para mejorar la DM2.

4. La deficiencia de Smad3 promueve la proliferación celular in vitro

Se ha informado que la inhibición farmacológica de TGFBR1 promueve la proliferación celular in vitro [7, 8]. Por lo tanto, investigamos si la eliminación genética de Smad3 también promueve la proliferación celular cultivando las células de los islotes Smad3KO y WT seguidas por el etiquetado de BrdU. La inmunofluorescencia doble mostró que las células de los islotes que carecen de Smad3 exhibieron un nivel significativamente más alto de células positivas para BrdU (5,7 por ciento) en comparación con las células de los islotes Smad3WT (2,4 por ciento) (Figura 7A y B). La proliferación aumentada de células Smad3KO también se demostró mediante el aumento de la expresión de PCNA como lo reveló el análisis de transferencia Western (Figura 7C), lo que confirma el papel regulador clave de Smad3 en la proliferación celular.

5. RNA-seq identifica a E2F3 como un gen diana de Smad3 que regula la proliferación celular

Para descubrir el mecanismo aguas abajo de Smad3 en la regulación de la proliferación celular, realizamos RNA-seq en islotes aislados de ratones db/m o db/db con o sin eliminación del gen Smad3, incluidos Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT -db/m, y ratones Smad3KO-db/m como se describió previamente [9]. Se realizó un análisis de enriquecimiento de vías entre los genes expresados ​​diferencialmente (DEG) entre los islotes Smad3WT y Smad3KO en el fondo db/m o db/db. En el trasfondo genético de db/db, Smad3KO dio como resultado cambios sustanciales en los genes o vías relacionados con el ciclo celular, como lo revelan los análisis GO y KEGG (Figura 8A y Figura S3). Dados los genes individuales, el análisis de RNA-seq reveló un aumento en la expresión de genes relacionados con la ciclina, las quinasas dependientes de ciclina (CDK) y la familia de proteínas del ciclo de división celular (CDC) en los islotes Smad3KO-db/db en comparación con Smad3WT-db /db islotes, que se validó aún más en células de islotes Smad3KO cultivadas mediante RT-PCR (Figura S4 A y C). Por el contrario, en el trasfondo genético de db/m, Smad3KO no causó una influencia notable en los genes o vías relacionados con el ciclo celular (Figura S3B y C). Se informa que la señalización de TGF-/Smad3 regula negativamente el ciclo celular al inducir los genes inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina (CDKI) [7, 8, 12]. Sorprendentemente, la expresión de ninguno de estos genes CDKI se suprimió en los islotes Smad3KO-db/db in vivo y en las células de los islotes Smad3KO cultivadas según lo revelado por RNA-seq y RT-PCR, respectivamente (Figura S4B y C). Por el contrario, los niveles de expresión de varios genes CDKI como p16, p18 y p57 incluso aumentaron en células de islote Smad3KO cultivadas (Figura S4C). Esto implica que existe un mecanismo alternativo en la proliferación celular regulada por Smad3-.

Por lo tanto, analizamos el potencial de unión de Smad3 para las secuencias promotoras de los 224 DEG en el término GO del ciclo celular con el software del navegador ECR (Figura 8A). Entre ellos, un gen llamado E2F3 atrajo nuestra atención ya que es un ejecutor clave y terminal que regula la entrada G1/S del ciclo celular [13, 14]. Encontramos un sitio potencial de unión a Smad3 en el promotor del locus E2F3 de ratón que también se conserva en humanos (Figura 8B).

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Para investigar si E2F3 es esencial para la proliferación celular regulada por Smad3-, examinamos la asociación entre E2F3 y Smad3 en los islotes. De acuerdo con el RNA-seq, la inmunohistoquímica detectó que la expresión de E2F3 se redujo en gran medida en los islotes de los ratones Smad3WT-db/db pero aumentó en gran medida en los ratones Smad3KO-db/db (Figura 8C). Además, también se observó una mayor expresión de E2F3 en células de islote Smad3KO cultivadas tanto a nivel de ARN como de proteína (Figura 8 DF). Por el contrario, el silencio de E2F3 mediado por adenovirus anuló la actividad proliferativa de las células (insulina^másBrdU^más) en células de los islotes Smad3KO (Figura 9), lo que revela un papel esencial para E2F3 en la proliferación celular regulada por Smad3-.

Para confirmar aún más la unión predicha de Smad3 en el promotor E2F3, realizamos inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en islotes de ratón aislados (Figura 10A). La especificidad del anticuerpo Smad3 utilizado para ChIP se validó inicialmente mediante inmunoprecipitación en islotes de ratón (Figura 10B). ChIP PCR confirmó la unión de Smad3 al promotor E2F3 como el anticuerpo anti-Smad3, pero ningún isotipo de IgG no específico precipitó con éxito el fragmento de cromatina correspondiente al promotor E2F3 (Figura 10C). La RT-PCR cuantitativa reveló un enriquecimiento de 6- veces la secuencia del promotor E2F3 en el ensayo ChIP con el anticuerpo Smad3 en comparación con el isotipo IgG (Figura 10D), lo que demuestra que Smad3 puede unirse a la región promotora del locus genómico E2F3 .

Para validar la importancia funcional de la unión de Smad3 en el promotor E2F3, construimos un vector informador de luciferasa impulsado por un promotor E2F3 de ratón que alberga el sitio de unión de Smad3 o su forma mutante (Figura 10E). El ensayo de luciferasa dual en células HEK293T reveló una transcripción sólida de luciferasa impulsada por el promotor E2F3 clonado, que se inhibió significativamente al sobreexpresar Smad3. Sin embargo, la mutación del sitio de unión de Smad3 anuló el efecto inhibidor de Smad3 (Figura 10F). Estos hallazgos proporcionaron evidencia directa del papel supresor de Smad3 en la transcripción de E2F3 al unirse a su promotor.

En este estudio, demostramos que el trasplante de islotes deficientes en Smad3- produjo un mejor efecto terapéutico sobre la diabetes y la lesión renal diabética en ratones diabéticos inducidos por STZ y ratones db/db. En la diabetes inducida por STZ, el trasplante de 100 islotes Smad3KO pero no de 100 Smad3WT resultó en un aumento de 17-veces en la masa celular, lo que se asoció con un aumento significativo en los niveles de insulina en sangre y, por lo tanto, mejoró la intolerancia a la glucosa y recuperó la euglucemia, lo que resultó en en la protección contra la lesión renal diabética.

También se encontraron resultados similares en T2DM en ratones db/db en los que el trasplante con 250 islotes Smad3KO pero no la misma dosis de islotes Smad3WT también aumentó 5- veces la masa celular y produjo un mejor control glucémico. Estos hallazgos sugieren que la deficiencia de Smad3 es resistente a los microambientes diabéticos y promueve en gran medida la expansión de las células de los islotes injertados y la producción de insulina para exhibir un mejor control glucémico. Curiosamente, también encontramos que el tratamiento con 100 islotes Smad3KO podría producir un control glucémico igual al uso de 200 islotes Smad3WT o KO en la diabetes inducida por STZ. Esta observación sugiere que la deficiencia de Smad3 puede reducir en gran medida (al menos un 50 por ciento) la cantidad de islotes necesarios para el establecimiento exitoso de la independencia de la insulina en la terapia de reemplazo de células de los islotes para la DM1. Estos hallazgos coinciden con el informe anterior de que el pretratamiento de los islotes con SB-431542, un inhibidor de TGFBR1, promueve la proliferación y función de las células después del trasplante [15]. Sin embargo, como Smad2 también juega un papel esencial en la liberación de insulina estimulada por la glucosa en las células [16], apuntar a Smad3 pero no a TGFBR1 aguas arriba en los islotes (células) puede ser más favorable para el tratamiento de reemplazo celular de la diabetes. Por lo tanto, el trasplante de islotes deficientes en Smad3-puede representar clínicamente una nueva terapia tanto para la DM1 como para la DM2. Además, el tratamiento con islotes Smad3KO también podría proteger contra la lesión renal diabética a las 16 semanas de DM1, aunque esto no es profundo en la DM2 debido a la mínima lesión renal diabética que ocurre en ratones db/db a la semana 12 de edad.

Mecánicamente, encontramos que Smad3 funciona al suprimir E2F3 para inhibir la proliferación celular. Esto está respaldado por la evidencia de que el promotor E2F3 contiene un sitio de unión funcional a Smad3, según lo confirmado por ChIP y el ensayo indicador de luciferasa. Las células de los islotes que carecen de Smad3 mostraron una proliferación mejorada en un mecanismo dependiente de E2F3- ya que la eliminación de E2F3 abolió esta actividad proproliferativa. E2F3 pertenece a la familia E2F y es un componente crítico de la maquinaria Rb-E2F que gobierna la entrada del ciclo celular G1/S [13]. Los E2F son los factores transcripcionales y los ejecutores finales para regular los genes que orquestan el progreso del ciclo celular [14]. Se ha demostrado que la sobreexpresión de E2F3 promueve la proliferación celular en islotes de roedores y humanos [17]. Los hallazgos de que Smad3 se dirige transcripcionalmente a E2F3 para reprimir el ciclo celular en las células proporciona un nuevo mecanismo regulador para la proliferación celular. Por lo tanto, la interrupción de Smad3 en las células de los islotes promueve la proliferación de células dependientes de E2F3-como lo demuestra un marcado aumento en las células PCNA plus o BrdU plus productoras de insulina, lo que sugiere que el tratamiento con una dosis subterapéutica de los islotes Smad3KO es suficiente para expandir la célula. mass e inhibe tanto la DM1 en ratones inducidos por STZ como la DM2 en ratones db/db.

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Se informa que la señalización de TGF- desempeña un papel fundamental en el desarrollo y la función de las células de los islotes pancreáticos, detiene el ciclo celular y provoca la apoptosis celular al inducir CDKI [7, 8, 18]. Para nuestra sorpresa, los experimentos tanto in vivo como in vitro revelaron que la transcripción de CDKI no cambió o incluso aumentó en los islotes Smad3KO (Figura S4). Esta discrepancia puede atribuirse a las diferentes condiciones experimentales. Los resultados del estudio actual se derivaron de ratones Smad3KO (islotes). Sin embargo, los estudios previos se basan en la inhibición farmacológica de TGFBR1, que influirá en toda la señalización de TGF- [7, 8]. Además, usamos muestras de islotes de ratones adultos jóvenes (edad de 8-10 semanas), mientras que en estudios anteriores se usaron islotes de animales relativamente viejos o donantes cadavéricos de personas mayores [7, 8]. Como las células de los islotes muestran una acumulación de CDKI asociada con la edad [19], los CDKI en células envejecidas pueden ser más sensibles a la inhibición de la señalización de TGF-.

Hubo varias limitaciones en el presente estudio. En primer lugar, se investiga la eficacia del trasplante de islotes en el modelo de ratón diabético inducido por STZ sin reacción autoinmune. Por lo tanto, la ventaja de Smad3KO sobre la terapia de islotes Smad3WT para la diabetes también debe verificarse en un modelo auténtico de DM1 en el futuro. En segundo lugar, los hallazgos de este estudio se basan en la terapia celular Smad3KO de islotes completos, pero no en células específicas. No está claro si otros tipos de células distintas de las células en el islote desempeñarían un papel dependiente de Smad3- para modular la proliferación celular mediante vías de diafonía intercelular. Por lo tanto, se justifican más estudios con Smad3KO específicos de células. Además, los hallazgos de este estudio deben verificarse en muestras de islotes humanos para demostrar su importancia clínica.

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Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 y Hui-Yao Lan2,7

1 Centro de Investigación de Medicina Integrada y Departamento de Nefrología, Hospital de Medicina Tradicional China Afiliado de la Universidad Médica del Suroeste, Luzhou, Sichuan, 646000, China.

2. Departamento de Medicina y Terapéutica, e Instituto Li Ka Shing de Ciencias de la Salud, Universidad China de Hong Kong, Hong Kong, 999077, China.

3. Laboratorio Conjunto Guangdong-Hong Kong sobre Enfermedades Inmunológicas y Genéticas del Riñón, Hospital Popular Provincial de Guangdong, Academia de Ciencias Médicas de Guangdong, Guangzhou, Guangdong, 510080, China.

4. Laboratorio Estatal Clave de Bioelectrónica, Laboratorio Clave de Jiangsu para Biomateriales y Dispositivos, Escuela de Ciencias Biológicas e Ingeniería Médica, Universidad del Sudeste, Nanjing, China.

5. Laboratorio clave de prevención y tratamiento de la enfermedad renal crónica de la ciudad de Zhanjiang, Instituto de Nefrología, Hospital afiliado de la Universidad Médica de Guangdong, Zhanjiang, Guangdong, 524001, China.

6. Base Nacional de Investigación Clínica de Medicina Tradicional China, Hospital de Medicina Tradicional China Afiliado de la Universidad Médica del Suroeste, Luzhou, Sichuan, 646000, China.

7. Laboratorio Conjunto de Investigación sobre Enfermedades Renales Inmunológicas y Genéticas del Hospital Popular Provincial de CUHK-Guangdong, Universidad China de Hong Kong, Hong Kong, 999077, China.