Segunda parte Diferencias del proteoma urinario en la diabetes canina con y sin presencia de microalbuminuria

Resultados

Finalmente, se incluyeron en el análisis proteómico siete perros normoalbuminúricos con diabetes mellitus DM I, siete perros diabéticos con microalbuminuria DM II y siete perros sanos en el grupo control. Los perros diabéticos fueron diagnosticados en base a variables clinicopatológicas. Todos cumplían con los criterios de diabetes mellitus: glucemia en ayunas mayor o igual a 11 mmol/L (200 mg/dL) y glucosuria. La microalbuminuria se definió como una proporción entre albúmina y creatinina en la orina mayor o igual a 0,1 y menor o igual a 0,3 [18-20]. Ninguno de los perros tenía signos de enfermedad renal crónica (presión arterial sistólica, creatinina sérica y proporción de proteína en orina a creatinina dentro del rango fisiológico). Las características clínicas de los grupos de estudio se muestran en la Tabla 1 y la Tabla complementaria S1.

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Nuestro estudio reveló 286 manchas de proteínas comunes en geles 2D de los dos grupos de diabéticos y el grupo de control. De estas proteínas, 11 han mostrado expresiones diferentes estadísticamente significativas (p menor o igual a 0.05), por lo que se extrajeron del gel electroforético. De estas 11 proteínas de orina, cinco fueron identificadas positivamente por MALDI-TOF MS. Cinco proteínas que fueron identificadas positivamente por MALDI-TOF se escindieron de un gel representativo de cada grupo. Los puntos de corte se correspondían entre sí. La Tabla 2 contiene la lista de proteínas identificadas positivamente, junto con sus nombres, genes y números de acceso de bases UniProt. Con el programa Delta2D, una de las cinco proteínas: Zinc Finger Protein 2 se asignó para ser regulada positivamente solo en el grupo de perros diabéticos con microalbuminuria, mientras que el grupo de perros diabéticos normoalbuminúricos estaba en el mismo nivel en comparación con el grupo de control. Cuatro de las cinco proteínas de la orina identificadas (glutaredoxina-3, haptoglobina, proteína 1A que contiene el dominio C2HC con dedo de zinc, glutatión S-transferasa Mu 1 se asignaron a reguladas al alza en dos grupos de diabéticos (Tabla 2, Figura 1). Figura 1 muestra puntos de gel de electroforesis bidimensionales representativos de proteínas significativamente (p menor o igual a 0.05) expresadas diferencialmente en el grupo de control frente a los grupos de diabetes. La Figura 2 muestra una imagen fusionada de los geles electroforéticos condensados ​​del Proporción: el cociente de las medias grupales de los volúmenes de puntos relativos: el volumen de un punto determinado en el grupo de control es el denominador del parámetro de proporción (Rt > 1,5 sobreexpresión, Rt < 0,67 supresión). proteínas, se utilizó el programa Panther para asignarlas al proceso biológico apropiado.

Discusión

La orina en la diabetes es una fuente de proteínas de fácil acceso y se investigó previamente en pacientes humanos y modelos animales de muchas maneras, también utilizando enfoques proteómicos. Hasta donde sabemos, no existe ningún estudio sobre el análisis proteómico de la orina canina diabética. Nuestro primer objetivo fue averiguar si el perfil proteico de la orina diabética canina difiere de la normoalbuminuria, microalbuminuria y sujetos sanos.

El presente estudio demostró cambios que ocurren en el proteoma de la orina con diabetes mellitus.

Hemos identificado cinco proteínas urinarias expresadas diferencialmente en perros diabéticos: glutatión S-transferasa Mu 1, proteína 1A que contiene el dominio C2HC con dedo de zinc, haptoglobina, glutaredoxina-3 y proteína con dedo de zinc 2. Todas estas proteínas estaban reguladas al alza en perros diabéticos. orina. La única proteína regulada positivamente solo en los perros microalbuminúricos fue la proteína de dedo de zinc 2. Se podría considerar vincular esta proteína con la progresión de la enfermedad.

Se cree que el proceso autoinmune juega un papel potencialmente importante en la etiopatología de la diabetes canina y, por lo tanto, se observó en nuestro estudio anterior en la película lagrimal diabética [10], al identificar proteínas relacionadas con la inflamación. En este estudio investigamos la orina y, según el resultado, también pudimos confirmar esta suposición. Observamos una regulación al alza de varios agentes inflamatorios en las muestras de orina aisladas de pacientes diabéticos caninos.

La glutatión S-transferasa Mu 1 GSTM1 es el principal antioxidante celular que protege contra los tóxicos ambientales, así como contra la lesión celular mediada por ROS (especies reactivas al oxígeno). La N-acetilcisteína, una molécula precursora de la biosíntesis de GSH, atenúa la gravedad de la diabetes en el modelo de diabetes inducida por aloxano [21] y la sobreexpresión de glutamato cisteína ligasa, la enzima involucrada en el paso limitante de la síntesis de GSH, protege los islotes pancreáticos del estrés oxidativo [ 22]. GSH desintoxica ROS, reduce los peróxidos y desintoxica múltiples compuestos a través de la conjugación de glutatión-s-transferasa (GST) [21]. En nuestro estudio, observamos la regulación al alza de la glutatión S-transferasa Mu 1 en ambos grupos de diabéticos. Este resultado sugiere que GSTM1 podría contribuir al desarrollo de pacientes diabéticos. Suponemos que la sobreexpresión de GSTM1 en la orina diabética es una reacción defensiva positiva. Se deben realizar más estudios sobre la orina canina en la diabetes mellitus, involucrando grupos de pacientes más grandes para verificar la expresión de esta proteína en pacientes proteinúricos.

La haptoglobina (Hp) es una glicoproteína plasmática sintetizada por los hepatocitos y secretada en respuesta a la inflamación y la infección [23]. El papel principal de la Hp es unirse a la hemoglobina libre (Hb) liberada durante la destrucción intravascular de los eritrocitos [24], formando el complejo Hp-Hb y, al hacerlo, prevenir el estrés oxidativo en la vasculatura. Estudios clínicos sugirieron que el polimorfismo de Hp es un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedad cardiovascular y un predictor independiente de resultados cardiovasculares en estos pacientes [25]. Hay dos alelos comunes para Hp (1 y 2) y, por lo tanto, tres genotipos comunes de Hp: Hp 1-1, Hp 2-1 y Hp 2-2. La protección antioxidante proporcionada por Hp depende del genotipo; la proteína codificada por Hp 1-1 proporciona una protección antioxidante superior en comparación con la codificada por Hp 2-2. Un estudio mostró que las personas diabéticas con Hp 2-2 tienen más probabilidades de desarrollar nefropatía, retinopatía y enfermedades cardiovasculares que aquellas con los genotipos Hp 2-1 o Hp 1-1 [26]. El mecanismo potencial por el cual el genotipo Hp2-2 puede causar un mayor riesgo de complicaciones vasculares es a través de un estrés oxidativo y/o inflamación elevados. Por lo tanto, disminuir el estrés oxidativo en pacientes con diabetes que usan suplementos antioxidantes puede ayudar a reducir el riesgo de eventos cardiovasculares [27]. En nuestro estudio, la haptoglobina se identificó como una proteína urinaria regulada al alza en dos grupos de diabéticos. Suponemos que la sobreexpresión de esta proteína puede estar asociada con la destrucción intravascular en perros diabéticos. Existe la necesidad de determinar si la haptoglobina se asocia con un mayor riesgo de desarrollar nefropatía diabética en un grupo más grande de perros en diversas etapas de la nefropatía diabética.

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Glutaredoxina-3. Las glutaredoxinas utilizan el poder reductor del glutatión para mantener y regular el estado redox celular y las vías de señalización dependientes de redox, por ejemplo, al catalizar la glutatión S reversible de la proteína. Debido a la importancia general de estos procesos, las glutaredoxinas se han implicado en diversas condiciones fisiológicas y relacionadas con enfermedades, como la defensa inmunitaria, la hipertrofia cardíaca, la lesión por hipoxia-reoxigenación, la neurodegeneración y el desarrollo, la progresión y el tratamiento del cáncer en humanos y modelos animales. [28]. La función exacta de la glutaredoxina-3 aún no está clara.

Proteína con dedos de zinc 2. La proteína con dedos de zinc ZIC2 está codificada por el gen ZIC2 y puede interactuar con el ADN y las proteínas [29] Las anotaciones de ontología génica (GO) relacionadas con el gen ZIC2 incluyen la actividad del factor de transcripción de unión al ADN y la unión al ADN de la cromatina [30] . Estas proteínas están involucradas en la regulación de múltiples pasos del metabolismo del ARN, incluido el empalme, la poliadenilación, el transporte, la traducción y la descomposición del ARNm. Varias proteínas con dedos de zinc son cruciales para muchos aspectos de la regulación inmunitaria al dirigirse a los ARNm para la degradación y modulación de las vías de señalización [31]. Hay una falta de información sobre la proteína de dedo de zinc 2 en la diabetes mellitus. Es interesante que en nuestro estudio hayamos notado una sobreexpresión de esta proteína en orina microalbuminúrica. Ciertamente, vale la pena ampliar el estudio y analizar la contribución de Zinc Finger Protein 2 en la fisiopatología de la diabetes mellitus.

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Conclusiones

En resumen, hasta donde sabemos, este estudio es el primero en estudiar el proteoma urinario de perros con diabetes mellitus. Parece que ciertas proteínas específicas se expresan en la orina, y esos marcadores pueden vincularse con la patología de la diabetes mellitus. Nuestro estudio respalda la visión actual de las complicaciones diabéticas como una enfermedad en la que la inflamación, el estrés oxidativo y el deterioro del estado redox celular juegan un papel crucial, lo que convierte a estos procesos en un objetivo para un posible tratamiento futuro. Debido a las limitaciones de este estudio piloto, se deben realizar más investigaciones sobre la orina canina en la diabetes mellitus, involucrando grupos más grandes de pacientes para verificar su importancia en el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad.

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Referencias

18. Whittemore, JC; branquia, VL; Jensen, WA; Radecki, SV; Lappin, MR Evaluación de la asociación entre la microalbuminuria y la proporción de albúmina-creatinina en orina y la enfermedad sistémica en perros. Mermelada. Veterinario. Medicina. Asoc. 2006, 229, 958–963.

19. Gentilini, F.; Dondi, F.; Mastrorilli, C.; Giunti, M.; Calzolari, C.; Gandini, G.; Mancini, D.; Bergamini, PF Validación de un ensayo inmunoturbidimétrico humano para medir la albúmina canina en orina y líquido cefalorraquídeo. J. Vet. Diagnóstico investigando 2005, 17, 179–183.

20. Nabity, MB; Boggess, MM; Kashtán, CE; Lees, GE Variación diaria de la proporción de proteína en orina: creatinina en perras con proteinuria glomerular estable causada por nefropatía hereditaria ligada al cromosoma X. J. Vet. Interno. Medicina. 2007, 21, 425–430.

21. Bekris, LM; Shepard, C.; Peterson, M.; Hoehna, J.; Yserloo, BV; Rutledge, E.; Farín, F.; Kavanagh, TJ; Lernmark, A. Glutationes-transferasa M1 y polimorfismos T1 y asociaciones con la edad de inicio de la diabetes tipo 1. Autoinmunidad 2005, 38, 567–575.

22. Tran, POT; Parker, SM; Le Roy, E.; Franklin, CC; Kavanagh, TJ; Zhang, T.; Zhou, H.; Vliet, P.; Oseid, E.; Harmon, JS; et al. La sobreexpresión adenoviral de la subunidad catalítica de glutamilcisteína ligasa protege los islotes pancreáticos contra el estrés oxidativo. J. Biol. química 2004, 279, 53988–53993.

23. Raynes, JG; águila, S.; McAdam, KP Síntesis de proteínas de fase aguda en células de hepatoma humano: regulación diferencial del amiloide sérico A (SAA) y la haptoglobina por interleucina-1 e interleucina-6. clin. Exp. inmunol. 1991, 83, 488–491.

24. Murray, RK; Connell, GE; Pert, JH El papel de la haptoglobina en el aclaramiento y distribución de la hemoglobina extracorpuscular. Sangre 1961, 17, 45–53.

25. Recaudación, AP; Hochberg, I.; Jablonski, K.; Resnick, ÉL; Lee, ET; Mejor, L.; Howard, BV Strong Heart Study El fenotipo de haptoglobina es un factor de riesgo independiente de enfermedad cardiovascular en personas con diabetes: The Strong Heart Study. Mermelada. Col. Cardiol. 2002, 40, 1984–1990.

26. Nakhoul, FM; Miller-Lotan, R.; Awaad, H.; Asleh, R.; Levy, AP Hipótesis: genotipo de haptoglobina y nefropatía diabética. Nat. clin. Practica nefrol. 2007, 3, 339–344.

27. Seferovi´c, JP; Asanin, M.; Seferovi´c, PM Haptoglobina y genotipos de haptoglobina en la diabetes: ¿una bala de plata para identificar a los que responden a la terapia con antioxidantes? EUR. J. anterior Cardiol. 2018, 25, 1498–1501.

28. Lillig, CH; Berndt, C.; Holmgren, A. Glutaredoxin Systems. bioquimica Biografía. Acta Gen. Subj. 2008, 1780, 1304–1317.

29. Aruga, J.; Hatayama, M. Genómica comparativa de los genes de la familia Zic. En Familia Zic: Evolución, Desarrollo y Enfermedad; Aruga, J., Ed.; Avances en Medicina Experimental y Biología; Springer: Singapur, 2018; págs. 3 a 26; ISBN 978-981-10-7311-3.

30. Zic2 promueve el crecimiento tumoral y la metástasis a través de PAK4 en el carcinoma hepatocelular—ScienceDirect.

31. Fu, M.; Blackshear, PJ Proteínas de unión a ARN en la regulación inmunitaria: un enfoque en las proteínas con dedos de zinc CCCH. Nat. Rev. Inmunol. 2017, 17, 130–143.

Dagmara Winiarczyk 1, Mateusz Winiarczyk 2 , Katarzyna Michalak 3 , Stanisław Winiarczyk 3 y Łukasz Adaszek 3

1 Departamento de Enfermedades Internas de Pequeños Animales, Universidad de Ciencias de la Vida de Lublin, 20-400 Lublin, Polonia

2 Department of Vitreoretinal Surgery, Medical University of Lublin, 20-059 Lublin, Poland; winiarm86@gmail.com

3 Departamento de Epizootiología, Universidad de Ciencias de la Vida de Lublin, 20-400 Lublin, Polonia; artica@wp.pl (KM); genp53@interia.pl (SO); ukaszek0@wp.pl (Ł.A.)