Cómo el artemetero mejora la lesión renal--Parte I

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El arteméter mejora la lesión renal al restaurar el desequilibrio redox y mejorar la función mitocondrial en la nefropatía por adriamicina en ratones

Peng xun Han y otros

losriñónes un órgano de alta demanda de energía rico en mitocondrias especialmenterenalcélulas tubulares. La evidencia emergente sugiere que la disfunción mitocondrial, el desequilibrio redox y la lesión renal están interconectados. Artemether tiene efectos biológicos al dirigirse a las mitocondrias y exhibe un valor terapéutico potencial parariñónenfermedad. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes no se han dilucidado completamente. Este estudio se realizó para determinar los efectos del arteméter sobre la nefropatía inducida por adriamicina y también se investigaron los posibles mecanismos. In vivo, se estableció un modelo de ratón con nefropatía por adriamicina y los ratones se trataron con o sin arteméter durante 2 semanas. In vitro, las células NRK-52E se estimularon con TGF- 1 y se trataron con o sin arteméter durante 24 h. DespuésrenalSe evaluaron los daños y cambios celulares. Los resultados demostraron que el arteméter redujo la excreción urinaria de proteínas, recuperó las alteraciones podocitarias, atenuó los cambios patológicos y aliviórenallesión tubular. El arteméter también reguló a la baja los niveles de expresión de ARNm de TGF- 1, inhibió la proliferación tubular, restauró los fenotipos de las células tubulares y suprimió las vías de señalización relacionadas con la proliferación. Además, el arteméter restaurórenalDesequilibrio redox, mayor número de copias de ADNmt y función mitocondrial mejorada. En resumen, proporcionamos evidencia inicial de que el arteméter mejora la lesión renal al restaurar el desequilibrio redox y mejorar la función mitocondrial en la nefropatía por adriamicina en ratones. El arteméter puede ser un agente prometedor para el tratamiento de la enfermedad renal.

Crónicoriñónenfermedad(ERC) se está convirtiendo en una carga para la salud mundial y se caracteriza por anomalías en la orina, alteraciones de la estructura morfológica y deteriororenalfunción1. Es urgente explorar la patogenia de la ERC y desarrollar fármacos eficaces que retrasen su progresión.

Como órgano con alta demanda de energía, elriñónes rica en mitocondrias, especialmente enrenalcélulas tubulares. Las mitocondrias se consideran el motor de la célula y participan en muchos procesos celulares. Evidencia emergente sugiere que la disfunción mitocondrial juega un papel fundamental enriñón enjurado2. En una población comunitaria, se observó una asociación negativa entre el número de copias de ADN mitocondrial (ADNmt) en sangre periférica y la prevalencia de microalbuminuria3. Un estudio de metabolómica de la excreción urinaria yrenalEl análisis de la expresión génica reveló que la actividad del ciclo del ácido cítrico está alterada en pacientes con ERC4. Las mitocondrias son el sitio principal de oxidación de ácidos grasos. En humanos y modelos de ratón con fibrosis tubulointersticial, se detectó una oxidación defectuosa de ácidos grasos. La restauración del metabolismo de los ácidos grasos mediante métodos genéticos o farmacológicos previno significativamente la progresión de la fbrosis renal5.

El estrés oxidativo se define como un desequilibrio en la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) por encima de la capacidad de las células/tejidos para desintoxicarlos o eliminarlos. Numerosos estudios han demostrado que la desregulación de lariñónestado redox promueve vías fibrogénicas y eventualmente conduce arenalfracaso6. Las mitocondrias son una fuente importante de ROS celular y regulan el equilibrio redox en cooperación con otros orgánulos7. Desequilibrio redox, disfunción mitocondrial yriñónlesiónestán interconectados. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a estos factores siguen siendo esquivos.

El arteméter es un derivado de la artemisinina con biodisponibilidad mejorada y se usa ampliamente en el tratamiento antipalúdico8,9. Estudios previos han demostrado que los derivados de la artemisinina tienen actividades antivirales, antifúngicas, anticancerígenas y antidiabéticas10–15. Varios estudios han demostrado que los efectos biológicos del arteméter están relacionados con la regulación de las mitocondrias16–18. Sin embargo, los mecanismos precisos no se entienden completamente.

En este estudio, exploramos el papel del arteméter en la nefropatía por adriamicina (AN) e investigamos los mecanismos subyacentes.

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Resultados

El arteméter redujo la excreción urinaria de proteínas y recuperó las alteraciones de los podocitos.

La proteinuria es un marcador derenallesióny un factor de riesgo independiente para la progresión de la ERC. Como se muestra en la Fig. 1a, en comparación con el grupo de control, la excreción urinaria de proteínas en el grupo AN aumentó significativamente y se redujo significativamente con el tratamiento con arteméter. Los podocitos juegan un papel importante en la formación de proteinuria. Por lo tanto, contamos el número de células positivas WT-1 (que indican el número de podocitos) y medimos el ancho del proceso del pie (FPW) en el glomérulo. Los resultados revelaron que el número de podocitos disminuyó y el FPW aumentó significativamente en los ratones del grupo AN (Fig. 1b-e). El tratamiento con arteméter obviamente recuperó estas alteraciones de los podocitos (Fig. 1b-e).

Figura 1. El arteméter redujo la excreción urinaria de proteínas y recuperó las alteraciones de los podocitos. ( a ) Cuantificación y análisis estadístico de la excreción urinaria de proteínas en varios grupos. n=6 por grupo. (b) Recuento de células positivas WT-1 por glomérulo en cada grupo. n=6 por grupo. ( c ) Medición de FPW en diferentes grupos. n=3 por grupo. (d) Imágenes representativas de la inmunotinción WT-1 en cada grupo. Barra de escala, 20 μm. ( e ) Imágenes representativas de TEM que muestran cambios morfológicos de los procesos del pie. Barra de escala, 500 nm. **PAGS<0.01 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.05,><0.01 and=""><0.001 versus="">

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El arteméter atenuó los cambios patológicos y la lesión tubular renal.

Al final de este estudio, la glomeruloesclerosis focal y segmentaria (Fig. 2a, j), la lesión tubular (Fig. 2b, k) y la fibrosis tubulointersticial (Fig. 2c, l) eran prominentes en los ratones del grupo AN. El tratamiento con arteméter mejoró significativamente estas lesiones patológicas (Fig. 2a-c,j-l). De acuerdo con los cambios patológicos tubulares, los niveles urinarios de Kim-1 y NGAL, que son dos biomarcadores de lesiones tubulares, aumentaron significativamente en el grupo AN y se redujeron significativamente con arteméter (Fig. 2d, e). Además, los niveles de ARNm relacionados con la fibrosis (fibronectina: FN, -actina del músculo liso: -SMA, colágeno: COL I y COL III) también aumentaron significativamente en los ratones del grupo AN y se redujeron por el tratamiento con arteméter (Fig. 2f-i ). De acuerdo con estos cambios moleculares y patológicos, el arteméter redujo significativamente el aumento de la creatinina sérica y el BUN en el grupo AN (Fig. 9a,b).

Figura 2. Cambios patológicos atenuados por arteméter yrenallesión tubular. Evaluación de (a) glomeruloesclerosis, (b) lesión tubular y (c) fibrosis intersticial en cada grupo. Cuantificación de la excreción urinaria de (d)NGAL y (e) Kim-1 en varios grupos. Determinación derenalNiveles de expresión de ARNm de (f) FN, (g) -SMA, (h) COL I y (i) COL III en diferentes grupos mediante qPCR y normalización contra el gen de limpieza -actina. ( j, k ) Imágenes representativas de tinción PAS para glomérulos (barra de escala, 20 μm) y túbulos (barra de escala, 50 μm). (l) Imágenes representativas de la tinción tricrómica de Masson pararenaltubulointersticio. Barra de escala, 50 μm. n=6 por grupo. *PAGS<0.05,><0.01 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.05,><0.01 and=""><0.001 versus="">

El arteméter inhibió la proliferación de células tubulares.

Para determinar el estado de crecimiento celular en elriñón, realizamos inmunohistoquímica para los marcadores de proliferación celular antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) y Ki-67. Los resultados revelaron que las células tubulares positivas para PCNA y Ki-67 aumentaron significativamente en los ratones del grupo AN y disminuyeron significativamente con el arteméter (Fig. 3b-e). TGF- 1 es un regulador crítico de la proliferación celular. En comparación con los ratones del grupo de control, la marcada regulación al alza del ARNm de TGF- 1 enrenalSe observó tejido en ratones del grupo AN, y se reguló significativamente por el tratamiento con arteméter (Fig. 3a).

Figura 3. El arteméter reguló a la baja los niveles de expresión de ARNm de TGF- 1 e inhibió la proliferación tubular. ( a ) Determinación de los niveles de expresión de ARNm de TGF- 1 renal en cada grupo. (b, c) Recuento de células tubulares positivas para PCNA y Ki-67 por mm2 en varios grupos. ( d, e ) Imágenes representativas de inmunotinción PCNA y Ki-67 en cada grupo. Barra de escala, 20 μm. n=6 por grupo. **PAGS<0.01 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.01 and=""><0.001 versus="">

Artemeter restauró el fenotipo de las células tubulares y suprimió las vías de señalización relacionadas con la proliferación.

Como marcador de fenotipo epitelial representativo, la E-cadherina (fosfo S838 más S840) se redujo significativamente en el grupo AN y se reguló al alza por arteméter (Fig. 4a, b, f, j). Las señales relacionadas con la proliferación Erk1 / 2, p38 y S6RP se activaron en ratones del grupo AN y fueron inhibidas por arteméter (Fig. 4a, c - e, g - i, k). Para determinar si los efectos del arteméter en las células tubulares estaban mediados por TGF- 1, realizamos un estudio in vitro. Se incubaron células NRK-52E con 10 ng/ml de TGF- 1 en combinación con o sin arteméter durante 24 h. En comparación con el grupo no tratado, TGF- 1 aumentó significativamente la viabilidad celular (Fig. 5a) e indujo la activación de Erk1/2 y S6RP (Fig. 5b,e,h,c,f,i). La coincubación de arteméter disminuyó la viabilidad celular de forma dependiente de la dosis (Fig. 5a) e inhibió la activación de Erk1/2 y S6RP a una concentración de 200 μM (Fig. 5b, e, h, c, f, i). La señal de p38 se activó ligeramente por estimulación con TGF- 1 pero no en un grado significativo. La intervención con arteméter tampoco tuvo efecto sobre la señalización de p38 (Fig. 5d, g, j).

Figura 4. Efectos del arteméter sobre el fenotipo de las células tubulares y las vías de señalización relacionadas con la proliferación. (a–i) Bandas de Western blot y análisis cuantitativo de pE-cadherina (S838 más S840), E-cadherina, p-Erk1/2 (Tr202/Tyr204), Erk1/2, p-p38 MAPK (Tr180/Tyr182), p38 MAPK, p-S6RP (Ser235/236) y S6RP en elriñónen cada grupo. ( j, k ) Imágenes representativas de tinción inmunohistoquímica de pE-cadherina (S838 más S840) y p-S6RP (Ser235/236) en elriñón. Las imágenes mostraron que estas proteínas se expresan predominantemente en los túbulos renales. Barra de escala, 20 μm. n=6 por grupo. *PAGS<0.05 and=""><0.01 versus="" control;=""><0.05,><0.01 and=""><0.001versus>

Figura 5. Efectos del arteméter sobre la viabilidad celular y las vías de señalización relacionadas con la proliferación in vitro. ( a ) La viabilidad celular se analizó mediante el ensayo MTT después del tratamiento con TGF - 1 y diferentes concentraciones de arteméter durante 24 h. n=6 por grupo. *P < 0.05="" vs.="" tgf-="" 1:0="" más="" arte:="" 0="" grupo;=""><0.001 vs.="" tgf-β1:(10+dmso)="" +="" art:="" 0="" group.="" (b–d)="" representative="" western="" blot="" bands="" of="" p-erk1/2="" (tr202/tyr204),="" erk1/2,="" p-s6rp="" (ser235/236),="" s6rp,="" p-p38="" mapk="" (tr180/tyr182),="" and="" p38="" mapk="" after="" treatment="" with="" the="" indicated="" amount="" of="" artemether="" and="" tgf-β1.="" (e–j)="" bar="" graphs="" present="" the="" fold="" change="" of="" these="" proteins="" after="" normalization="" to="" β-actin.="" n="3" per="" group.=""><0.05 versus="" tgf-β1:0+art:="" 0="" group;=""><0.05 versus="" tgf-β1:10+art:="" 0="">

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Efectos del arteméter sobre el equilibrio redox renal.

En comparación con el grupo de control, las enzimas redox asociadas, incluidas la catalasa, la superóxido dismutasa 2 (SOD2) y la glutatión peroxidasa 1 (GPX1), se redujeron significativamente en el grupo de AN y aumentaron significativamente con el tratamiento con arteméter (Fig. 6a-d) . La tinción inmunohistoquímica reveló que estas enzimas se expresaban principalmente en los túbulos renales y rara vez en los glomérulos. Su distribución en túbulos también exhibió un patrón específico. La catalasa se expresó principalmente en la unión cortico-medular, SOD2 se expresó principalmente en la médula y GPX1 se expresó principalmente en la corteza (Fig. 6f-h). En línea con el desequilibrio redox en elriñón, urinarioLa excreción de H2O2 aumentó significativamente en el grupo AN y se redujo con arteméter (Fig. 6e). El arteméter aumentó la masa mitocondrial y mejoró la función mitocondrial. En los ratones del grupo AN, se observó pérdida del canal de aniones dependiente de voltaje (VDAC), translocasa de la membrana mitocondrial externa 20 (TOM20), citocromo c oxidasa IV (COX IV) y factor de transcripción mitocondrial A (Tfam) y estos efectos fueron aumentado por el tratamiento con arteméter (Fig. 7a-e). Debido a que la proteína Tfam juega un papel importante en el mantenimiento del número de copias de mtDNA, medimos el número de copias de mtDNA en cada grupo. De acuerdo con la reducción de Tfam, el número de copias de mtDNA también se redujo en el grupo AN y aumentó con arteméter (Fig. 7g-l). Además, se observó una menor tasa de liberación de H2O2 mitocondrial renal en el grupo AN, que aumentó con el tratamiento con arteméter (Fig. 7f).

Figura 6. Efectos del arteméter sobreriñónequilibrio redox y excreción urinaria de H2O2. ( a ) Imágenes de transferencia Western que muestran los niveles de proteína renal de catalasa, SOD2 y GPX1 en cada grupo. ( b – d ) Los gráficos de barras muestran el cambio de pliegue de estas proteínas después de la normalización a -actina. n=4 por grupo. (e) Excreción urinaria de H2O2 en varios grupos. n=6 por grupo. ( f – h ) Imágenes representativas de inmunotinción de catalasa renal, SOD2 y GPX1 en cada grupo. Barra de escala, 200 μm. *PAGS<0.05 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.05 and=""><0.001 versus="">

Fuga de protones regulada por arteméter y señalización de AMPK.

Para explorar el efecto directo del arteméter en las mitocondrias, realizamos una prueba de estrés mitocondrial utilizando el analizador Seahorse XF. En comparación con el grupo no tratado, la estimulación con TGF- 1 no afectó la fuga de protones ni la producción de ATP (Fig. 8a-c). Por el contrario, el tratamiento con arteméter aumentó significativamente la fuga de protones y disminuyó la producción de ATP (Fig. 8a-c). Como se muestra en la Fig. 8d,e, la señal de AMPK fue activada por arteméter. Además, el estudio in vivo mostró que los niveles de ARNm de la proteína de desacoplamiento (UCP2) en elriñónfueron regulados significativamente por arteméter (Fig. 8f).

Figura 8. Efectos del arteméter sobre la fuga de protones y la señalización de AMPK. (a) La respiración mitocondrial celular se midió con un analizador de flujo extracelular Seahorse XF24 después de tratar las células con la cantidad indicada de arteméter y TGF- 1 durante 24 h. (b, c) Los gráficos de barras presentan el cálculo de la fuga de protones y la producción de ATP en varios grupos según el protocolo del fabricante. n=5 por grupo. ( d, e ) Imágenes representativas de transferencia Western y análisis cuantitativo del cambio de pliegue de p-AMPK (Tr172) después del tratamiento con TGF - 1 y arteméter durante 24 h. n=3 por grupo. ( f ) El nivel de expresión de ARNm renal de UCP2 en cada grupo de ratones se normalizó frente al gen de limpieza - actina. n=6 por grupo. #PAGS<0.05 and=""><0.001 versus="" tgf-β1:10+art:="" 0="" group;=""><0.05 versus="">

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De: 'Arteméter mejorariñónlesiónrestaurando el desequilibrio redox y mejorando la función mitocondrial en la nefropatía por adriamicina en ratones' porPeng xun Han y otrosl

---Informes científicos|(2021) 11:1266