¿Cómo reduce el polisacárido Cistanche la melanogénesis y reduce el estrés oxidativo?

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El polisacárido de Cistanche deserticola induce la melanogénesis en los melanocitos y reduce el estrés oxidativo

1Departamento de Dermatología, Tercer Hospital Xiangya, Universidad Central del Sur, Changsha, China

2Departamento de Urología, Tercer Hospital Xiangya, Universidad Central del Sur, Changsha, China

3Centro Experimental de Medicina, Tercer Hospital Xiangya, Universidad Central del Sur, Changsha, China

Cistanchedeserticolatiene muchos efectos, haga clic aquí para saber más

Resumen: Como parte principal de los trastornos de pigmentación, las enfermedades de despigmentación de la piel como el vitíligo y el nevus acromático son muy comunes y ahora reciben más atención. La patogenia de la despigmentación incluye la disfunción y la pérdida de melanocitos, que posiblemente sean causadas por la herencia, la autoinmunidad y el estrés oxidativo. Entre ellos,estrés oxidativojuega un papel clave; sin embargo, pocos tratamientos clínicos pueden tratar el estrés oxidativo. Como se informó,Cistanchedeserticola polisacárido(CDP) es un antioxidante eficaz; en base a eso, evaluamos su papel en los melanocitos y revelamos aún más los mecanismos. En este estudio, encontramos que CDP podría promover la melanogénesis en melanocitos epidérmicos humanos (HEM) y células B16F10 de melanoma de ratón, también indujo la pigmentación en el pez cebra. Además, la CDP podría activar la vía de señal de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), luego regulaba al alza la expresión del factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF) y los genes TYR, TRP1, TRP2 y RAB27A aguas abajo. De lo contrario, encontramos que la CDP podría atenuar la citotoxicidad y la apoptosis inducidas por H2O2-en los melanocitos. Más pruebas revelaron que la CDP podría mejorar la vía antioxidante NRF2/HO-1 y eliminar las ROS intracelulares. En resumen, la CDP puede promover la melanogénesis y evitar que los melanocitos sufran lesiones por estrés oxidativo, lo que sugiere que la CDP ayuda a mantener el estado normal de los melanocitos. Por lo tanto, CDP puede ser un nuevo fármaco para el tratamiento de enfermedades despigmentantes.

PALABRAS CLAVE:

Cistanche desertica polisacárido, enfermedad despigmentante, melanocito, melanogénesis, NRF2,estrés oxidativo

1. INTRODUCCIÓN

Las enfermedades despigmentantes de la piel, como el vitíligo y el nevus acromático, se caracterizan por una despigmentación cutánea extensa o en parches.1 Aunque las lesiones cutáneas rara vez causan lesiones físicas graves, afectan la apariencia del paciente y crean una carga psicológica grave, incluso trastornos de salud mental.2 Los principales cambios patológicos en la despigmentación incluyen la disfunción y pérdida de melanocitos, lo que afecta en gran medida la síntesis y el transporte de melanina,3 lo que lleva a una acumulación insuficiente de melanina en la piel.

Actualmente se desconocen los mecanismos involucrados en la despigmentación, pero los estudios han identificado algunos factores relacionados. Por un lado, la función de los melanocitos depende en parte del factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF), que es bien conocido por promover la expresión de genes relacionados con la melanogénesis, incluida la tirosinasa (TYR), la proteína relacionada con la tirosinasa 1 (TRP1), la proteína relacionada con la tirosinasa proteína 2 (TRP2), proteína relacionada con ras Rab-27a (RAB27A) y proteína 1 de unión de actina fascin (FSCN1).4 Entre estos genes, TYR juega un papel clave en la síntesis de melanina mediante la oxidación de l-dopa en dopaquinona.5 Por otro lado, los estudios sugieren una combinación de varios factores que pueden ser responsables de la pérdida de melanocitos, incluidos la herencia, el medio ambiente, la autoinmunidad y el estrés oxidativo.6-9 Entre estos factores, el estrés oxidativo se considera el más importante .

Los mecanismos deestrés oxidativoque causan la despigmentación han sido parcialmente revelados; la sobrecarga de especies reactivas de oxígeno (ROS) es un factor clave.10 La sobrecarga de ROS en la despigmentación implica un desequilibrio entre los sistemas pro y antioxidante.11 Uno de los elementos que participan en este desequilibrio es el factor nuclear eritroide 2-relacionado deterioro de la ruta antioxidante del factor 2/elemento de respuesta antioxidante (NRF2/ARE).12 La ruta consta de NRF2 y enzimas antioxidantes como la hemooxigenasa-1 (HMOX-1, HO-1) , catalasa (CAT), glutatión peroxidasa 1 (GPX1) y NAD(P)H quinona deshidrogenasa 1 (NQO1).13 Cuando los melanocitos están expuestos a un exceso de ROS, NRF2 puede trasladarse al núcleo y unirse a los ARE conservados, luego promover la expresión de enzimas antioxidantes. Sin embargo, en algunas enfermedades de despigmentación, como el vitíligo, una vía antioxidante NRF2/ARE deteriorada no puede eliminar eficazmente las ROS.14 Las terapias clínicas comúnmente utilizadas en la despigmentación incluyen corticosteroides tópicos o sistémicos, inhibidores de la calcineurina, ultravioleta B de banda estrecha (NBUVB; 311 nm) , 308-nm excimer light, trasplante epidérmico autólogo y terapia de medicina tradicional china (MTC). Los corticosteroides y los inhibidores de la calcineurina pueden reducir la activación inmunitaria anormal,15 mientras que las fototerapias se utilizan como tratamientos de primera línea; en particular, NBUVB estimula la proliferación de melanocitos y la destrucción de células T,16 mientras que la luz excimer 308-nm induce la apoptosis de las células T.17 Además, los efectos de las terapias de la MTC están relacionados con la promoción de la melanogénesis.18 Hasta cierto punto, estos métodos son útiles para mejorar la despigmentación, pero el control de la progresión de la enfermedad sigue siendo un desafío. Es necesario desarrollar nuevas terapias, especialmente para el estrés oxidativo, que antes estaba descuidado.

Cistanche deserticase conoce como 'ginseng del desierto'.19 Sus componentes son útiles en el daño hepático inducido por etanol y en la hiperplasia inflamatoria intestinal; también se puede usar como reactivo antifatiga, antiinflamatorio y antitumoral.20-22 Recientemente, Guo et al informaron queCistanche desertica polisacárido(CDP), uno de sus principales componentes, poseía actividad antioxidante y hepatoprotectora20; otros dos estudios identificaron su papel en la protección de las células de una lesión en condiciones de privación/reperfusión de oxígeno-glucosa y osteoporosis23,24. Sin embargo, el papel de la CDP en las enfermedades despigmentantes no ha sido dilucidado. Aquí, nuestro objetivo era confirmar si CDP cestrés oxidativopodría afectar la melanogénesis y proteger a los melanocitos del estrés oxidativo.

2.|MATERIAL Y MÉTODOS

2.1|Químicos y anticuerpos

Cistanche deserticapolisacárido(CDP) y l-dopa se adquirieron de Yuanye Biotec (pureza mayor o igual al 98 por ciento; Shanghái, China). Peróxido de hidrógeno (H2O2), dimetilsulfóxido (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-bromuro de difeniltetrazolio ( MTT), y un kit de detección de apoptosis de Anexina V-FITC se adquirieron de Sigma-Aldrich. Se adquirió paraformaldehído neutro al 4 por ciento de Biosharp (Hefei, China); y un kit de tinción de inmunofluorescencia (Alexa Fluor 488) y diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (DCFH-DA) se adquirieron de Beyotime Biotec (Shanghai, China). Se adquirieron un kit de tinción de Fontana-Masson y un kit de extracción de proteínas nucleoplasmáticas de Sloarbio (Beijing, China). El suplemento de crecimiento de melanocitos humanos (HMGS), el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y el medio 254 se adquirieron de Gibco. El suero bovino fetal (FBS) se adquirió de BI (Kibbutz Beit-Haemek, Israel). Anticuerpos primarios para actina, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK,

p38, p-p38, NRF2 y HO-1 se adquirieron de Cell Signaling Technology, un anticuerpo primario para MITF se adquirió de St John's Laboratory, un anticuerpo primario para p-MITF se adquirió de Affinity Biosciences, un anticuerpo primario para GAPDH se adquirió de Bioworld, y el anticuerpo primario para TRP1 se adquirió de Merck Millipore.

2.2| Cultivo celular y tratamiento.

Se cultivaron células B16F10 de melanoma de ratón en medio DMEM suplementado con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de mezcla de antibióticos de penicilina-estreptomicina. Los melanocitos epidérmicos humanos (HEM, por sus siglas en inglés) se separaron del prepucio humano (consulte nuestro estudio anterior25) y se cultivaron en medio 254 complementado con HMGS, 5 % de FBS y 1 % de mezcla de antibióticos de penicilina y estreptomicina. Todas las células se cultivaron en una incubadora húmeda a 37 grados con 5 por ciento de CO2. CDP se disolvió en DMSO y se diluyó

con el medio antes de su uso, la concentración final de DMSO fue inferior al 0,1 por ciento. El H2O2 se diluyó con el medio antes de su uso.

2.3|Cultivo y tratamiento de pez cebra

Los embriones de pez cebra y el medio se adquirieron de EzeRinka Biotech. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Central del Sur. Los peces cebra se cultivaron en 12-placas de pocillos a 37 grados de la luz y se trataron con diferentes concentraciones de CDP. Se utilizó un microscopio invertido para observar y registrar diariamente las melaninas en la cabeza y la cola del pez cebra. Después de la observación, cambiamos el medio y volvimos a agregar el CDP. La densidad de melanina en las colas del pez cebra se midió con la imagen J y los valores se presentan como densidades ópticas integradas (IOD).

2.4| Viabilidad celular

La viabilidad celular se midió usando un ensayo MTT. Para investigar la citotoxicidad de CDP, se implantaron células HEM y B16F10 en 96-placas de pocillos a una densidad de 2 × 1{{30}}3 células/pocillo y se cultivaron hasta las células se unieron a placas. A continuación, las células se trataron con diferentes concentraciones (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 y 320 ug/mL) de CDP durante 24, 48 o 72 horas. Antes de la medición, se agregaron 20 μL de MTT a cada pocillo y las placas se incubaron a 37 grados durante 4 horas. Después de eso, descartamos el sobrenadante y agregamos 160 μL de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales de formazán. El valor de absorbancia a 490 nm se midió mediante un lector de placas multimodo (PerkinElmer). Para investigar el efecto de la CDP en la condición de citotoxicidad inducida por H2O2-, se sembraron células HEM y B16F10 en placas de 96-pocillos a una densidad de 4 × 103 células/pocillo. Las células se trataron con diferentes concentraciones de CDP (0, 20, 40 u 80 ug/ml) durante 24 horas, momento en el que añadimos H2O2 (concentraciones finales: 500 μm para HEM y 1,0 mm para células B16F10) a cada pocillo. y se incubaron las células durante otras 24 horas. Establecimos grupos de control negativo (NC) y tratados con CDP. Los pasos de detección fueron los mismos que los descritos anteriormente.

2.5|Ensayo de NaOH del contenido de melanina

Las células se cultivaron en placas Petri de {{0}}mm y se trataron con CDP a diferentes concentraciones (0, 20, 40 y 80 ug/mL) durante 48 horas, luego se digirieron con tripsina y se recolectaron en 1. 5-mL tubos. Lavamos las células dos veces con agua doblemente destilada, las resuspendimos en 1 ml de etanol y las agitamos para liberar la melanina. Luego centrifugamos (200 g, 5 minutos) la mezcla y descartamos el sobrenadante, agregamos 1 ml de DMSO al 10 % (diluido con solución de NaOH 1 mm) en cada tubo y suspendimos el sedimento. Incubamos la suspensión en un baño de agua a 80 grados durante 1 hora para disolver la melanina. Finalmente, transferimos 200 μL del líquido a una placa de pocillos 96-y usamos un lector de placas multimodo para medir el valor de absorbancia a 470 nm.

2.6|Mediciones de actividad de tirosinasa

Las células se cultivaron en placas Petri de {{0}}mm y se trataron con CDP antes de la medición, se digirieron con tripsina y se recogieron en tubos de 1,5-mL, y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS ). Pasamos 106 células de cada muestra a un tubo nuevo y descartamos el sobrenadante después de la centrifugación, luego agregamos 1 ml 0.5 por ciento de Triton X-100 al sedimento celular y almacenamos el mezcla a 0 grados durante 15 minutos. A partir de entonces, agregamos 1 mL de l-dopa (1 mm, diluido con 0tampón de fosfato 1 M) como sustrato y mezclamos la solución, movimos 200 μL de la mezcla a una 96-placa de pocillos inmediatamente, y midió el valor de absorbancia (A0) a 475 nm utilizando un lector de placas multimodo, repitiendo la medición a los 10 minutos (A10). La actividad tirosinasa se calculó mediante (A10-A0)/105, y los resultados se expresan como porcentaje ( por ciento ) frente al control negativo.

2.7| Tinción de melanina de Fontana-Masson

Las células se cultivaron en 12-placas de pocillos hasta alcanzar una densidad del 50 por ciento. Después del tratamiento, las células se fijaron con paraformaldehído neutro al 4 por ciento durante 30 minutos y se lavaron con agua destilada. Luego agregamos 500 μL de solución de plata y amoníaco de Fontana a cada pocillo y almacenamos las placas en la oscuridad durante 16 horas para teñir la melanina. A continuación, lavamos las células con agua destilada cinco veces (1 minuto cada vez) y las empapamos en 500 μL de hiposulfito durante 5 minutos; finalmente, retiramos el hiposulfito y lavamos las células nuevamente con agua destilada durante 1 minuto. Luego usamos un microscopio invertido para observar y registrar las melaninas.

2.8|Extracción de ARN y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa

Las células se cultivaron en 6-placas de pocillos. Después del tratamiento, las células se digirieron con tripsina y se recogieron en tubos de 1,5-mL. Lavamos las células dos veces con PBS, luego agregamos 1 ml de tampón de lisis, agitamos la mezcla y colocamos los tubos en hielo durante 5 minutos para lisar las células por completo. El ARN se extrajo con un kit de ARN total (Omega Bio-Tek) y se transcribió inversamente (RT) con ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (PCR) se realizó utilizando KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). El volumen de reacción de la mezcla de RT fue de 20 μL, mientras que el volumen de reacción de la mezcla de PCR fue de 20 μL (cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, primer F 1 μL, primer R 1 μL, agregue DEPC H2O a 20 μL ). Los experimentos se realizaron de acuerdo con los protocolos. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla S1.

2.9|Extracción de proteínas y Western blotting/inmunofluorescencia

Las células se cultivaron en placas Petri de 100- mm. Después del tratamiento, las células se digirieron con tripsina y se recogieron en tubos de 1,5-mL. Lavamos las células dos veces con PBS, luego agregamos 500 μL de tampón de lisis RIPA (Thermo Fisher) complementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo de 1 mm (Thermo Fisher) y cóctel de inhibidor de fosfatasa diluido 1: 100 (Roche). La proteína nuclear y del citoplasma se extrajo utilizando el kit de extracción de proteínas nucleoplasmáticas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Colocamos los tubos en hielo durante 30 minutos y los agitamos cada 5 minutos para lisar completamente las células. Centrifugamos las células (200 g, 4 grados, 15 minutos), movimos el sobrenadante a un tubo nuevo y medimos la concentración de proteína total usando un kit de ensayo de proteína BCA (KeyGEN Biotec). Hervimos las proteínas con tampón de carga 5x (Beyotime Biotec, China) a 100 grados durante 10 minutos, luego las almacenamos a -80 grados. Se usó el método de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en transferencia Western, y se separaron 20 ug de proteína de cada grupo y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno. Después del bloqueo del antígeno, incubamos la membrana en un anticuerpo primario diluido 1:1000 durante 16 horas a 4 grados, luego lavamos la membrana con PBST y la incubamos en anticuerpo secundario fluorescente diluido 1:10 000 durante 1 hora a 37 grados. . La intensidad de la fluorescencia se detectó utilizando un sistema de imágenes Odyssey CLx (LI-COR). La inmunofluorescencia se realizó con el kit de tinción de inmunofluorescencia (Alexa Fluor

488) con una dilución 1:100 del anticuerpo primario.

2.10|Medición de la apoptosis celular

Las células se cultivaron en placas Petri de {{0}}mm y se trataron con diferentes concentraciones (0, 20, 40 y 80 ug/mL) de CDP durante 24 horas y se les añadió H2O2 ( concentraciones finales: 500 μm para HEM, 1,0 mm para células B16F10) en cada pocillo y se incubaron durante otras 24 horas. También establecimos grupos tratados con CDP y NC. Después del tratamiento, digerimos las células con tripsina libre de EDTA y las recolectamos en tubos, luego lavamos las células dos veces con PBS y las resuspendimos en 100 μL de PBS. Las células se tiñeron con un kit de detección de apoptosis de Anexina V-FITC de acuerdo con el protocolo y se detectaron por citometría de flujo (FCM). Se utilizó el software FlowJo para analizar la tasa de apoptosis.

2.11| Medición de ROS intracelular

Las células se cultivaron en {{0}}placas de pocillos y se trataron con diferentes concentraciones (0, 20, 40 y 80 ug/mL) de CDP durante 24 horas, a las que se les añadió H2O2 (concentraciones finales: 500 μm para HEM,

1.0 mm para células B16F10) a cada pozo, los incubó por otro

24 horas y configurar grupos tratados con CDP y NC. Después del tratamiento, lavamos las células dos veces con PBS para eliminar todo el medio y FBS, luego diluimos la sonda DCFH-DA a 1:1000 con medio y la añadimos a cada pocillo. Incubamos las células a 37 grados durante 30 minutos y las lavamos tres veces con un medio sin suero. usamos un

microscopio de fluorescencia invertido para observar y registrar la fluorescencia, luego usó ImageJ para medir la intensidad de la fluorescencia.

2.12|Estadísticas y análisis

Los datos de este trabajo se presentan como media ± desviación estándar (SD), y el análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism (versión 7.0) o SPSS (versión 22.0), y Student's Se usó la prueba t o el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para las comparaciones de grupos múltiples. El valor gris de las bandas de proteína WB se estandarizó con GAPDH o -actina. Se consideraron significativos valores de p < 0,05.="" todos="" los="" experimentos="" fueron="" repetidos="" al="" menos="" tres="">

3|RESULTADOS

3.1|Melanogénesis inducida por CDP en células HEM y B16F10

Antes de comenzar, utilizamos el ensayo MTT para investigar la citotoxicidad potencial de CDP en HEM y células B16F10 de melanoma de ratón. Las células se trataron con CDP a diferentes concentraciones durante 24, 48 o 72 horas. Las pruebas de viabilidad HEM demostraron que cuando las concentraciones eran inferiores a 320 ug/ml, la CDP no influía en la viabilidad celular; sin embargo, la viabilidad disminuyó significativamente cuando la concentración alcanzó 320 ug/mL a las 24, 48 y 72 horas (P < 0,05;="" figura="" 1a).="" la="" viabilidad="" de="" las="" células="" b16f10="" también="" disminuyó="" a="" las="" 48="" y="" 72="" horas="" cuando="" la="" cdp="" alcanzó="" los="" 320="" ug/ml="" (p="">< 0,01),="" pero="" no="" se="" observaron="" cambios="" a="" concentraciones="" más="" bajas="" (figura="" 1b).="" luego="" exploramos="" preliminarmente="" el="" papel="" de="" cdp="" en="" la="" melanogénesis="" y="" comparamos="" sus="" efectos="" con="" los="" de="" la="" hormona="" estimulante="" de="" melanocitos="" (-msh;="" concentraciones:="" 20,="" 100="" y="" 400="" nm)="" y="" dmso="" (0,1="" por="" ciento)="" en="" hem.="" los="" resultados="" de="" los="" ensayos="" de="" tinción="" de="" melanina,="" actividad="" de="" tirosinasa="" y="" contenido="" de="" melanina="" sugirieron="" que="" cdp="" era="" comparable="" con="" -msh="" para="" promover="" la="" melanogénesis,="" mientras="" que="" el="" tratamiento="" con="" dmso="" al="" 0,1="" por="" ciento="" no="" hizo="" ninguna="" diferencia="" (figura="">

Refinamos aún más nuestra exploración en consecuencia. Los HEM se trataron con CDP a diferentes concentraciones (20, 40 y 80 ug/mL) durante 48 horas; se realizaron los ensayos de tinción de melanina, contenido de melanina y actividad de tirosinasa, y todos mostraron aumentos significativos después del tratamiento con CDP de una manera dependiente de la concentración que alcanzó su punto máximo en el grupo de 80 ug/mL (P < 0,05,="" figura="" 2a-c)="" .="" luego="" medimos="" los="" niveles="" de="" arnm="" y="" proteínas="" de="" los="" genes="" relacionados="" con="" la="" melanogénesis="" (mitf,="" tyr,="" trp1,="" trp2,="" rab27a="" y="" fscn1).="" cdp="" aumentó="" significativamente="" los="" niveles="" de="" arnm="" de="" esos="" genes="" en="" hem="" (p="">< 0,05;="" figura="" s2a).="" además,="" los="" niveles="" de="" proteínas="" mitf,="" tyr,="" trp1="" y="" rab27a="" aumentaron,="" al="" igual="" que="" la="" proporción="" de="" mitf="" fosforilado="" a="" mitf="" total="" (p="">< 0,05),="" mientras="" que="" trp2="" y="" fscn1="" no="" mostraron="" diferencias="" (figura="" 2d,="" e).="" los="" resultados="" indicaron="" que="" la="" cdp="" puede="" promover="" la="" melanogénesis="" y="" regular="" al="" alza="" la="" expresión="" de="" genes="" relacionados="" con="" la="" melanogénesis="" en="" los="" melanocitos="">

Además, volvimos a verificar los efectos de CDP con células B16F10 y descubrimos que el contenido de melanina de las células B16F10 aumentó significativamente (P < 0,01;="" figura="" s2b).="" además,="" cdp="">

3.2|CDP promovió la melanogénesis en el pez cebra

Para investigar si CDP podría promovermelanogénesisin vivo, utilizamos embriones de pez cebra. Los embriones de pez cebra se dividieron en cuatro grupos y se trataron continuamente con medio solo (NC) o CDP a diferentes concentraciones (20, 40 y 80 ug/mL); la densidad y distribución de los gránulos de melanina se observaron y registraron todos los días. A medida que crecían los embriones de pez cebra, encontramos que la densidad de melanina aumentaba gradualmente en la cabeza y la cola. En el tercer día, las diferencias entre grupos eran distinguibles y la diferencia siguió aumentando hasta que finalizamos el experimento en el sexto día (Figura 3A). Usamos la Imagen J para medir la densidad de melanina en las colas del pez cebra; la densidad de melanina en los grupos tratados con CDP fue significativamente mayor que la del grupo de control (P < 0,05;="" figura="">

3.3|Vía de señal MAPK activada por CDP en células HEM y B16F10

Revelar los mecanismos por los cuales CDP promoviómelanogénesis, tratamos los HEM con CDP a diferentes concentraciones (20, 40 y

80 ug/ml) durante 48 horas y luego investigó los niveles fosforilados y totales de las proteínas ERK, JNK y p38 en la vía de señalización de MAPK. Según lo medido por transferencia Western, los niveles de p-ERK, p-JNK y p-p38 aumentaron después del tratamiento con CDP (P < 0,05),="" mientras="" que="" los="" niveles="" totales="" de="" ellos="" no="" cambiaron="" (figura="" 4a,="" b).="" los="" experimentos="" se="" repitieron="" con="" células="" b16f10="" y="" los="" niveles="" fosforilados="" de="" las="" proteínas="" erk,="" jnk="" y="" p38="" aumentaron="" (p="">< 0,05),="" pero="" los="" niveles="" totales="" de="" mapk="" no="" cambiaron="" (figura="" 4c,="" d),="" de="" acuerdo="" con="" los="" resultados="" en="" hem.="">

3.4|CDP atenuado H2O2-inducido

citotoxicidad y apoptosis en células HEM y B16F10

Usamos H2O2 para simular laestrés oxidativoambiente y exploró más a fondo el papel de CDP en los melanocitos bajoestrés oxidativo. La concentración final de H2O2 utilizada en los HEM fue de 500 μm, mientras que en las células B16F10 fue de 1,0 mm. Para investigar el efecto de la CDP en la citotoxicidad inducida por H2O2-, pretratamos las células HEM y B16F10 con CDP en diferentes concentraciones (20, 40 y 80 ug/mL) durante 24 horas, luego agregamos H2O2 y continuamos con el tratamiento. durante 24 horas antes de realizar la observación y el ensayo MTT.

El H2O2 provocó una aparente formación de ampollas en la membrana y una contracción celular en los HEM; en los grupos tratados previamente con CDP, la situación se alivió. El tratamiento con CDP solo no tuvo efecto (Figura 5A). El ensayo MTT mostró un resultado similar en el sentido de que el tratamiento con H2O2 disminuyó la viabilidad de HEM, mientras que CDP mejoró significativamente este impacto dañino.

3.5|CDP eliminó H2O2-inducida por ROS intracelulares en células HEM y B16F10

Para investigar los mecanismos de CDP para disminuir la citotoxicidad y la apoptosis inducidas por H2O2-, detectamos además las ROS intracelulares en células HEM y B16F10 utilizando una fluorescencia DCFH-DA

4|DISCUSIONES Y CONCLUSIONES

En este estudio, investigamos el papel de CDP en HEM y células B16F10. Por primera vez, descubrimos que CDP podía promovermelanogénesisen los melanocitos y promover la pigmentación en el pez cebra. Un experimento posterior mostró que la ruta de señalización de MAPK se activó bajo el tratamiento con CDP. Investigamos más a fondo su papel enestrés oxidativoy descubrió que la CDP podía atenuar la citotoxicidad y la apoptosis inducidas por H2O2- en los melanocitos; mientras tanto, CDP podría activar la vía antioxidante NRF2/HO-1 y eliminar las ROS intracelulares bajoestrés oxidativocondiciones.

La proteína quinasa activada por mitógenos es una vía vital involucrada en la regulación de MITF, un factor de transcripción clave que promueve la expresión demelanogénesisy posteriormente afecta la síntesis y el transporte de melanina.26,27 En nuestro estudio, la activación de ERK, JNK y p38 en los melanocitos aumentó significativamente después del tratamiento con CDP; mientras tanto, las expresiones de MITF/p-MITF y MITF-driven TYR, TRP1, TRP2 y RAB27A

fueron regulados en consecuencia. Por lo tanto, sugerimos que CDP puede

promovermelanogénesisa través de la activación de la vía MAPK, pero aún se desconoce cómo CDP activa MAPK. Según estudios recientes, el receptor tipo toll 4 (TLR4) se expresa en gran medida en los melanocitos y está involucrado en la melanogénesis.28,29 TLR4 es una importante proteína transmembrana que puede unirse específicamente a los lipopolisacáridos (LPS)30; estudios informaron que LPS puede inducir la melanogénesis. 29 Curiosamente, variospolisacáridosextraída de plantas o hongos, según se informa, activó los TLR y las vías de señalización posteriores, como MAPK y el factor nuclear kappa beta (NF-κB). ling camino y promuevemelanogénesis. Además, se sabe que los receptores similares a dominios de oligomerización de unión a nucleótidos (NLR, por sus siglas en inglés) reconocen ligandos intracelulares e impulsan la activación de las vías de señalización de MAPK y NF-κB.33,34 Como se informó, los polisacáridos extraídos de Ganoderma lucidum y Astragalus pueden ingresar a las células y afectar a los NLR.35,36 Por lo tanto, es posible que la CDP pueda ingresar a los melanocitos y regular la vía de señalización de MAPK a través de los NLR. Sin embargo, se necesitan más estudios para verificar esta hipótesis.

Algunos estudios hasta la fecha informaron la aplicación de hierbaspolisacáridosen la melanogénesis para inhibir la producción de melanina. 37,38 Sin embargo, en este estudio, CDP promovió la melanogénesis en

melanocitos, y este efecto se confirmó después de la comparación con -MSH. CDP es también una especie depolisacáridoextraído de hierbas, sospechamos que el efecto opuesto de CDP puede estar relacionado con las diferencias estructurales entre CDP y otrospolisacáridos. Los polisacáridos se forman por polimerización de monosacáridos pero varían en tipo de monosacárido, composición de monosacárido, enlace glucosídico, estructura de la cadena lateral y peso molecular39,40; se cree que estos factores determinan sus funciones biológicas.41 Los estudios existentes han propuesto la estructura de la CDP y sugirieron que la estructura de la CDP posteriormente influye en su función.42 Por lo tanto, se necesitan más pruebas para comprender completamente la CDP y confirmar nuestra hipótesis.

La melanogénesis es un importante mecanismo protector de resistencia

daño ultravioleta y mantenimiento de la homeostasis corporal43; al mismo

tiempo, los melanocitos se exponen fácilmente a entornos desfavorables como la sobrecarga de ROS.11 Se sabe que las ROS participan en la promociónmelanogénesis, uno de los mecanismos es la activación de MAPKs.44 Pero los estudios también revelaron que este efecto existe solo dentro de un cierto nivel de ROS, mientras que la sobrecarga de ROS afecta significativamente la melanogénesis.45 La relación entre ROS, MAPK y la melanogénesis es variable bajo diferentes condiciones, por lo tanto, el equilibrio entre los sistemas pro y antioxidantes es obviamente importante. En enfermedades despigmentantes como el vitíligo, un sistema antioxidante desequilibrado y una sobrecarga incontrolable de ROS dañarán los melanocitos y disminuirán la viabilidad celular.11,46 En este estudio, utilizamos diferentes concentraciones de H2O2 para simular la sobrecarga de ROS en las células, y los HEM mostraron una peor tolerancia a H2O2 que las células B16F10. Cuando los melanocitos fueron sometidos a tratamiento con H2O2, su viabilidad y tasa de apoptosis empeoraron, pero

El pretratamiento de CDP podría revertir parcialmente la tendencia. Al mismo tiempo, ROS fue eliminado. Como se informó, la activación de la ruta de antioxidación de NRF2/ARE es un método principal de eliminación de ROS en las células de la piel.14 En nuestros experimentos, los niveles de proteína de NRF2 y HO-1 en los melanocitos aumentaron después del tratamiento con H2O2 sin CDP; esto significa que H2O2-indujoestrés oxidativopuede activar la vía NRF2/HO-1, pero es insuficiente para mantener un equilibrio redox y proteger a la célula de lesiones. Sin embargo, el pretratamiento con CDP mejoró la vía de antioxidación de NRF2/HO-1 y restableció el equilibrio. Por lo tanto, sugerimos que la CDP puede proteger a los melanocitos de la lesión por estrés oxidativo mediante la activación de la vía de antioxidación NRF2/HO-1 y la eliminación de ROS.

Encontramos que el tratamiento con CDP solo no tiene influencia en ROS o NRF2/HO-1 en los melanocitos. Este resultado sugiere que la CDP puede afectar el equilibrio redox bajo estrés oxidativo, pero no en condiciones normales. Además, la vía de antioxidación de NRF2/HO-1 está supuestamente regulada por las vías de señalización de PI3K, NF-κB y MAPK.47,48 En nuestro estudio, la CDP pudo activar la vía de señalización de MAPK. Es posible que CDP pueda activar la vía NRF2/HO-1 a través de MAPK de regulación ascendente. Como informó Slominski, los melanocitos son sensores de estrés involucrados en una red reguladora, y sus funciones pueden cambiar rápidamente en respuesta al medio ambiente.49 Sugerimos que el papel de la CDP está influenciado por el estado de los melanocitos, puede promover la melanogénesis sin afectar el antioxidante. sistema bajo condiciones normales pero restaurar el equilibrio redox bajoestrés oxidativocondiciones. Por lo tanto, la CDP puede mantener la función y la supervivencia de los melanocitos de dos maneras diferentes. La CDP ayuda a los melanocitos a mantener la homeostasis, que también es una función importante de la melanogénesis.50,51

En conclusión, CDP puede promover lamelanogénesisde melanocitos

a través de la activación de la vía de señalización MAPK. CDP puede mejorar la supervivencia de los melanocitos mediante la activación de la vía antioxidante NRF2/HO-1 y la eliminación de ROS intracelulares en condiciones de estrés oxidativo. Nuestros hallazgos son significativos porque demuestran que CDP puede promovermelanogénesisy proteger a los melanocitos deestrés oxidativolesión, que es posiblemente responsable de la disfunción y pérdida de melanocitos. Los hallazgos de este estudio indican que la CDP podría ser un fármaco novedoso en el tratamiento de enfermedades despigmentantes.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81703101), los Nuevos Proyectos de Talento Xiangya del Tercer Hospital Xiangya de la Universidad Central del Sur (No. JY201623 y No. 20170301), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Hunan ( No. 2018JJ3788 y No. 2018JJ3793) y la comisión de salud del Proyecto de Hunan (No. C2019173). Dr. Yibo Hu realizó la parte principal del estudio y escribió el manuscrito; El profesor Jing Chen y Qinghai Zeng diseñaron el estudio y guiaron la redacción del manuscrito; El profesor Jinhua Huang, Lihua Huang y Hong Xiang brindaron asistencia técnica y analizaron los datos; El Dr. Yixiao Li, Ling Jiang, Yujie Ouyang, Yumeng Li, Lun Yang y Xiaojiao Zhao contribuyeron con parte de los experimentos.

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores confirman que no existen conflictos de interés.

DECLARACIÓN DE DISPONIBILIDAD DE DATOS

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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