Parte 2|Acteoside suprime la osteoclastogénesis mediada por RANKL al inhibir la inducción de C-Fos y la ruta de NF-kB y atenuar la producción de ROS

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Parte 2|¿Cómo promueven los Acteosides el crecimiento óseo?

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Discusión

La remodelación ósea está estrictamente regulada por el equilibrio entre la formación ósea por parte de los osteoblastos y la reabsorción ósea por parte de los osteoclastos. La reabsorción ósea prolongada y excesiva provoca un desequilibrio en el recambio esquelético, lo que da lugar a enfermedades de reabsorción ósea. Para explorar los efectos deacteósidoen la osteoclastogénesis, utilizamos dos macrófagos, BMM de cultivo primario y células RAW264.7. Estas células fueron estimuladas con RANKL para diferenciarse en osteoclastos en presencia y ausencia deacteósido. Mostramos por primera vez queacteósidoinhibe la diferenciación y formación de osteoclastos.Acteósidoen sí mismo a las concentraciones examinadas no provocó una disminución en la viabilidad de los macrófagos cultivados primarios en ambas condiciones de crecimiento y diferenciación.Acteósidoel tratamiento también disminuyó la actividad de reabsorción de los osteoclastos maduros. Estos resultados sugieren que el acteósido suprime la formación de osteoclastos a partir de macrófagos y la actividad de reabsorción de osteoclastos. Los resultados de nuestro sistema de cultivo, que no incluía osteoblastos ni células del estroma, también sugieren que el acteósido previene la formación de osteoclastos al actuar directamente sobre los precursores de osteoclastos. RANKL activa las MAPK, incluidas p38, ERK y JNK. Estas tres quinasas están involucradas en la diferenciación osteoclástica temprana y, por lo tanto, su inhibición farmacológicamente o con una transfección de JNK dominante negativa suprime la osteoclastogénesis inducida por RANKL [29]. Nuestros resultados revelaron queacteósidoel pretratamiento inhibió todas estas quinasas, lo que indica una regulación negativa no específica de las MAPK. Este resultado difería en parte del informe anterior de que EGCG, el principal compuesto antiinflamatorio en el té verde, atenuó específicamente la activación de JNK sin afectar o la activación de p38 en BMM estimulados por RANKL [7]. También se ha informado que Paeonol, un compuesto antiinflamatorio derivado de una hierba china, inhibe la fosforilación de ERK y p38, pero no la basura, en células RAW264.7 estimuladas por RANKL [30]. Por el contrario, la silibinina, un nuevo inhibidor óseo, atenuó la activación inducida por rangos de p38, ERK y JNK [31]. Estos hallazgos sugieren que los efectos de los compuestos antirresorción en la activación de MAPK por RANKL dependen del compuesto, aunque las tres MAPK están involucradas en la osteoclastogénesis temprana. Teniendo en cuenta la observación de que el acteósido atenuó los niveles de p-JNK en BMM estimulados por RANKL, incluso a 1 mm, el bloqueo de JNK en lugar de p38 MAPK o ERK pareció ser un evento más específico en elacteósidoantiosteoclastogénesis mediada por células. Aunque el acteósido a la misma concentración no redujo el número de osteoclastos en las BMM, hubo una disminución significativa en la formación de fosas con el tratamiento con acteósido. También encontramos que el pretratamiento con SP600125, un inhibidor farmacológico específico de JNK, previno drásticamente la formación de osteoclastos (datos no mostrados). En conjunto, estos hallazgos sugieren que la señalización mediada por JNK está estrechamente relacionada con la supresión de la osteoclastogénesis mediada por actósidos estimulada por RANKL. La señalización de NF-kB regula eventos celulares, incluida la apoptosis, la progresión del ciclo celular, la adhesión celular, la producción de citoquinas y la supervivencia en macrófagos [32]. La señalización de NF-kB también es necesaria para el desarrollo de osteoclastos, lo que se ha demostrado por la aparición de osteopetrosis en ratones knockout para NF-kB [33,34]. Por lo tanto, se propone que la inhibición de NF-kB sea un objetivo eficaz para que los agentes antirresortivos regulen a la baja la actividad de los osteoclastos y traten la osteoporosis. La modificación postraduccional de las proteínas de la subfamilia NF-kB es crucial para modular la actividad de NF-kB. Especialmente, la fosforilación de la subunidad p65 y la quinasa IkB es fundamental para que NF-kB induzca la osteoclastogénesis [7]. Nuestros hallazgos actuales mostraron que la estimulación de RANKL aumentó la actividad de unión al ADN de NF-kB y la fosforilación de la subunidad p65 e Ikea tanto en BMM como en células RAW264.7. El pretratamiento con acteósido inhibió estos aumentos inducidos por RANKL, lo que resultó en una actividad de NF-kB regulada a la baja. En consecuencia, estos resultados sugieren que, además de las MAPK, la señalización de NF-kB es el objetivo principal del acteósido para inhibir la diferenciación y formación de osteoclastos a partir de macrófagos estimulados por RANKL. Además de la señalización de NF-kB, la vía c-Fos/c-Jun/NFATc1 juega un papel clave en el desarrollo de osteoclastos, por lo que la falta de cualquiera de estas proteínas puede detener la osteoclastogénesis [35,36]. En este estudio, encontramos que el acteósido previno la expresión de c-Fos y NFATc1 inducida por RANKL a nivel de ARNm y proteína. JNK es una quinasa corriente arriba de c-Jun, que se requiere para la expresión de NFATc1 y la osteoclastogénesis en respuesta a RANKL [29] . El bloqueo de la vía JNK/c-Jun con un inhibidor de JNK disminuyó la formación de osteoclastos inducida por RANKL y la expresión de c-Fos y NFATc1 [7]. Nuestros resultados y hallazgos previos sugieren que la inhibición de la señalización mediada por JNK por acteoside está estrechamente asociada con la prevención de c-Fos y NFATc1 mediada por RANKL.

expresión, que suprime la diferenciación de osteoclastos en los macrófagos. Diferencias en los efectos deacteósidoen las células BMM y RAW264.7 se deben, al menos en parte, a las diferencias en la sensibilidad a la inhibición de JNK. El TNF-a puede inducir la osteoclastogénesis independientemente de la señalización de RANKL-RANK [37]. La IL-1 es un potente mediador de la destrucción ósea patológica inducida por la deficiencia de estrógenos o la inflamación[7]. La interrupción del receptor de IL-1 tipo I o la señalización de IL-1 puede revertir la pérdida ósea inducida por la ovariectomía [38] o la artritis reumatoide [39]. Este estudio demostró la capacidad deacteósidopara reducir la producción de citocinas inflamatorias como TNF-a, IL-1b e IL-6 en los macrófagos. Se cree que el acteósido inhibe la producción de citocinas inflamatorias mediante la supresión de la señalización de la cinasa p38 y ERK porque se requiere la activación de ERK1/2, p38 MAPK o ambas para la producción de estas citocinas inducida por lipopolisacáridos en los macrófagos [40,41]. También se informó que la luteolina, un compuesto inflamatorio, suprime la producción de mediadores inflamatorios al inhibir la activación de p38 MAPK [42]. En este estudio, también encontramos que el acteósido atenuó la pérdida ósea en ratones ovariectomizados, como lo demuestra la fuerza de fractura máxima restaurada en la diáfisis media del fémur derecho y la desaparición del hueso cortical osteoporótico. La administración oral de acteósido reguló a la baja los aumentos inducidos por la ovariectomización en los niveles séricos de IL-1b e IL-6, pero no de ALP. Los niveles séricos aumentados de calcio, TRAP y OC en OVX también fueron inhibidos por el tratamiento oral con acteósido, lo que sugiere que el acteósido atenúa la alteración de los biomarcadores específicos para la formación ósea y la reabsorción. Dado que la osteoporosis se caracteriza por una densidad de masa reducida y una microarquitectura ósea trabecular deteriorada, la pérdida de hueso trabecular inducida por OVX y la alteración de los parámetros morfométricos se inhibieron significativamente mediante la administración oral de acteósido. Estos hallazgos sugieren queacteósidose puede usar como un agente antirresorción para tratar la osteoporosis al revertir la activación osteoclástica desequilibrada. Sin embargo, los osteoblastos son el principal factor responsable de la formación de hueso nuevo. Por lo tanto, se necesita un agente capaz de aumentar la proliferación o diferenciación de osteoblastos para mejorar la formación ósea [30]. Por el contrario, encontramos que el acteósido no afectó la diferenciación o la mineralización de los osteoblastos en las células de la médula ósea tratadas con DAG. En conjunto, nuestros resultados sugieren que el acteósido tiene un efecto antirresorción pero no afecta directamente la formación ósea. Se necesitan experimentos más detallados que analicen los parámetros específicos del hueso in vivo e in vitro para aclarar si el acteósido beneficia o no la osteoblastogénesis. , c-Fos y NFATc1. Los datos sugieren dos posibles mecanismos por los cuales el acteósido tiene estos beneficios. Una posibilidad es queacteósido.

inhibe la osteoclastogénesis debido a su potencial antioxidante. Numerosos estudios han demostrado que la producción de ROS mediada por receptores puede servir como mediador de señalización aguas abajo [43–45]. Algunas quinasas y factores de transcripción son sensibles al estado redox celular, que afecta a varios eventos celulares. RANKL estimula la producción de ROS, que media las respuestas celulares inducidas por RANKL para la diferenciación de osteoclastos [24]. El tratamiento previo con antioxidantes, como N-acetilcisteína y glutatión, previno la generación de ROS mediada por RANKL, lo que indica que los antioxidantes reducen la pérdida ósea al disminuir la reproducción inducida por RANKL [24]. De acuerdo con estos hallazgos, el presente estudio revela queacteósidoatenúa las ROS intracelulares producidas en los BMM durante la diferenciación de los osteoclastos de forma dependiente de la dosis. Esta observación sugiere que la inhibición de la osteoclastogénesis se debe, al menos en parte, al potencial antioxidante del acteósido. También sugerimos que el acteósido podría regular a la baja el flujo de entrada de Ca2 plus, lo que suprime la osteoclastogénesis. Recientemente se informó que Acteoside inhibe las alergias de tipo I al regular a la baja la señalización de NFAT y JNK en células basófilas [46]. El receptor sensor de calcio está estrechamente relacionado con la regulación de la osteoclastogénesis [47]. Esta relación sugiere que un canal de calcio está involucrado enacteósidoinhibición inducida de la diferenciación y formación de osteoclastos. Sin embargo, se requieren más estudios para explorar los mecanismos exactos por los cuales el acteósido actúa como un agente antirresortivo a través de la modulación de Ca2 más la homeostasis.

En conclusión, nuestros hallazgos actuales muestran que el acteósido inhibe la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL de BMM y macrófagos RAW264.7 y suprime la resorción ósea por parte de osteoclastos maduros.Acteósidotambién previene la activación inducida por RANKL de tres MAPK conocidas y factores de transcripción como NF-kB, c-Fos y NFATc1, así como la producción de citoquinas inflamatorias como TNF-a, IL-1b, y IL-6. Además, la administración oral de acteósido atenúa la osteoporosis inducida por ovariectomía, aunque no afecta la osteoblastogénesis de las células de la médula ósea. En conjunto, estos hallazgos sugieren que el lado CTE tiene funciones beneficiosas en la reducción de la formación y la actividad de los osteoclastos como un potente agente antirresortivo.

información de soporte

Figura S1 Estructura química del acteósido.

(TIF)Figura S2Acteósidopreviene la formación de hoyos inducida por RANKL en BMM. Se pretrataron BMM con las dosis indicadas deacteósidodurante 2 h en placas de pocillos 24- recubiertas de hueso y estimuladas con 50 ng/ml de M-CSF y 100 ng/ml de RANKL durante 7 días. Se observó la formación de hoyos bajo microscopía óptica. B, las BMM se cultivaron con M-CSF y RANKL en presencia de variosacteósido({{0}}–20 mM), y 7 días después, el área reabsorbida se cuantificó a partir de 3 experimentos independientes y se expresó como un porcentaje de control (n=4 por experimento). *p,0.05, **p,0.01 y ***p,0.001 frente a células cultivadas con M-CSF y rango.

Figura S3 Acteoside atenúa la producción de citocinas inflamatorias en células RAW264.7 estimuladas por RANKL.

Las células se pretrataron con concentraciones crecientes (0–10 mM) deacteósidodurante 2 h seguido de estimulación con 100 ng/ml de RANKL durante 48 h. Los niveles de TNF-a, IL-1b e IL-6 se determinaron utilizando kits ELISA. ***p,0.001 vs. células sin RANKL y acteósido. #p,0,05 y ##p,0,01 frente a células estimuladas solo con RANKL.

Contribuciones de autor

Concibió y diseñó los experimentos: S-YL J-CL. Realizó los experimentos: S-YL K-SL S-HK SHY. Analizado los datos: K-SL S-YL J-CL. Reactivos/materiales/herramientas de análisis aportados: S-YL SHY J-CL. Escribió el artículo: S-YL SHY J-CL.

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