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Mejora de la producción de glucósidos feniletanoides por un elicitor fúngico en cultivo de suspensión celular de Cistanche deserticola

Cui-tao Lu¹,∗ y Xing-guo Mei²

Palabras clave Cistanche desertica, elicitor fúngico,glucósido feniletanoide, cultivo de células vegetales

Resumen
Cuando, en el día 15 de crecimiento, un elicitor deFusarium solanise agregó a 40 mg l^-1 aCistanche deserticacultivos de suspensión celular, el contenido de echinacósido, acteósido y totalglucósidos de feniletanoide(PeG) en células cultivadas aumentó durante los siguientes 27 días en más del 100 por ciento a 15 mg g^-1peso seco, 9 mg g-1 peso seco y 57 mg g^-1 peso seco, respectivamente. La biomasa final (1,3 mg peso seco ml^-1) no se vio afectado.

Cistanche desertica

Introducción

Cistanche deserticaMamá. (Orobanchaceae), una hierba nativa de China que se usa ampliamente en la medicina tradicional para diversos tratamientos, incluido el uso como sedante o como intensificador de la respuesta inmunitaria (Hsu et al. 1995, Chang et al. 1995).Glucósidos feniletanoides(PeGs) son los principales metabolitos bioactivos enCistanche desertica(Xiong et al. 2000) y se componen de muchos componentes como echinacoside, acteoside, cisacteoside, isoacteoside, 2-acetylacteoside, cistanoside A y osmanthuside B (Wang et al. 2000). Con la creciente demanda de estos productos y la rápida disminución deCistanche deserticaplantas, el cultivo celular sería un medio de producción alternativo atractivo. Muchos elicitores (especialmente los elicitores fúngicos) pueden mejorar la producción de metabolitos en el cultivo de células vegetales (Wang et al. 2001). Li et al. (1998) encontraron que un elicitor fúngico de Fusarium solani aislado de los sistemas de raíces de ambosCistanche deserticay su huésped, Halaxylon ammodendron, podría mejorar el contenido de aminoácidos en los callos deCistanche deserticaPero los cambios en el contenido de PeG en esta línea de callos no se mencionaron en su estudio. En este trabajo, se estudiaron los efectos de un elicitor de F. solani en la biosíntesis de PeG totales y dos PeG bioactivos principales (equinacósido y acteósido), y en los cambios del crecimiento celular en el cultivo en suspensión deCistanche desertica.

materiales y métodos

Cultivos de células vegetales
Se indujo callo a partir de escamas deCistanche deserticay mantenido en medio B5 de Gamborg (1968) suplementado con 0.5 mg de ácido indol-3-acético l^-1, 2 mg cinetina l^-1,y 1 g de hidrolizado de caseína l^-1. El pH se ajustó a 6 antes de la esterilización. Todos los experimentos se realizaron en matraces de agitación de 250 ml, cada uno con 100 ml de medio en un agitador rotatorio (120 rpm y 25 grados) en oscuridad. El inóculo fue de aproximadamente 100 g de peso fresco l^-1.

contenidos efectivos de cistanche deserticola--glucósido feniletanoide

Preparación de elicitor fúngico

La separación de la cepa del hongo, Fusarium solani, y la preparación del elicitor fúngico se realizaron como se describió previamente (Li et al. 1998, Yu et al. 2001). Se añadieron varias cantidades (equivalentes de carbohidratos) de elicitor fúngico a los cultivos en matraz agitado el día 15 (el período de cultivo total fue de 42 días).

Ensayo de viabilidad y acumulación de biomasa
Las células de un matraz de agitación se lavaron con agua destilada y se liofilizaron hasta peso constante. Así se determinó el peso seco. La viabilidad celular (porcentaje de células viables en una población celular) se determinó mediante la reducción de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (Towill & Mazur 1975).

glucósido feniletanoidedeCistanche desertica

Determinación de los contenidos de echinacósido, acteósido y totalglucósidos de feniletanoide(clavijas)
La extracción de PeG se realizó según el método de Du & Liu (1993). liofilizadoCistanche deserticalas células se extrajeron con etanol al 70 por ciento (v/v). La fracción de etanol se concentró, se desengrasó con acetato de etilo saturado con agua y luego se lixivió con n-butanol saturado con agua. La fracción de n-butanol se concentró, se disolvió en agua, se cargó en una columna de resina macroporosa (AB-8, producto químico de la Universidad de Nankai, Tianjin, China) y se eluyó con agua y metanol, sucesivamente. Se recogió la fracción de metanol y se determinó el contenido total de PeG utilizando equinacósido como estándar a 334 nm. El equinacósido y el acteósido se determinaron utilizando la columna Nova Pak C18 (250 × 4,6 mm) en un sistema HPLC (aguas) con detector UV (334 nm).

Resultados

Efecto del elicitor fúngico sobre la acumulación de biomasa y la biosíntesis total de PeG Los efectos del elicitor fúngico sobre la biomasa celular y la acumulación total de PeG dependieron de la dosis añadida (equivalentes de carbohidratos). Como se muestra en la Figura 1, las dosis más bajas de elicitor fueron favorables para el peso seco deCistanche deserticacélulas. El pico fue con el elicitor a 20 mg l^-1(dando 1,76 mg peso seco ml^-1).
La acumulación total de PeG aumentó significativamente con el elicitor de hongos entre 20 mg l^-1y 80 mg l^-1. Elicitor a 40 mg l-1 obtuvo el mayor rendimiento (57 mg g^-1), que fue más del doble de lo obtenido en el cultivo de control sin elicitor. El experimento adicional usó el elicitor fúngico a 40 mg1^-1.

Fig. 1. Peso de células secas y acumulación total de PeG en cultivo de células en suspensión deCistanche deserticaen respuesta a varias dosis de elicitor fúngico. Se añadió un elicitor fúngico al medio el día 15. Se tomaron muestras después de otros 27 d. ▲, peso final de celda seca; ◆, el contenido total de PeG. Los valores son medias de resultados por triplicado y las barras de error representan desviaciones estándar.

Evolución temporal del crecimiento celular y la biosíntesis de PeG
La Figura 2 muestra el curso temporal de la viabilidad celular y la biosíntesis de PeG (equinacósido y acteósido) de células en suspensión después de que los cultivos se sometieran a 40 mg l^-1elicitor fúngico el día 15 d. En los siguientes 27 días de cultivo, el echinacósido y el acteósido, los dos PeG bioactivos principales enCistanche desertica, ambos aumentaron considerablemente. El día 39 se lograron ambas acumulaciones máximas, alcanzando 14,7 mg g^-1peso seco y 8,9 mg g^-1 peso seco, respectivamente. No se observó una diferencia significativa en la viabilidad celular entre los cultivos tratados con elicitor y el control.

Fig. 2. Viabilidad celular y biosíntesis de equinacósido y actósido en cultivo celular en suspensión deCistanche deserticadespués del tratamiento por 40 mg l^-1elicitor de hongos. El elicitor fúngico se añadió al medio el día 15.◆, se trató con echinacósido con elicitor; ◇, control de equinacósido; ●, tratado con acteósido con elicitor;○,

control de actósidos; ▲, viabilidad celular tratada con elicitor; △, control de viabilidad celular. Los valores son medias de resultados por triplicado y las barras de error representan desviaciones estándar.

Discusión

Muchos componentes derivados de hongos (fragmentos de pared celular, polisacáridos, oligosacáridos, glicoproteínas, etc.) se han utilizado como inductores fúngicos en la producción de metabolitos secundarios con muchas especies de células vegetales. En este trabajo, el homogeneizado (compuesto principalmente por polisacáridos) de la cepa de hongo Fusarium solani aislado de los sistemas de raíces deCistanche deserticay Halaxylon ammodendron demostró ser un elicitor eficaz para la biosíntesis de PeG en el cultivo celular deCistanche desertica. El uso de este elicitor para estimular la síntesis de PeG en las células no solo fue significativo sino que se exhibió poco después de la elicitación. Esta conclusión coincidió con algunos estudios previos sobre cultivo de células vegetales (Wang et al. 2001).

En el estudio previo de Li et al. (1998), cuando se agregó al medio de cultivo un elicitor fúngico de F. solani, se indujo el callo de las semillas deCistanche deserticapodría permanecer vivo en la subcultura subsiguiente a largo plazo, y la producción de iridoides podría mejorarse. Indicó que las células cultivadas podrían sintetizar metabolitos secundarios de resistencia a enfermedades cuando son atacadas por microorganismos. Aunque los iridoides no se determinaron en nuestro experimento, hemos demostrado que los polisacáridos de F. solani podrían usarse como inductores fúngicos efectivos en la producción de PeG conCistanche deserticacélulas.

contenidos efectivos de cistanche deserticola--glucósido feniletanoide

De: ' Mejora deglucósidos de feniletanoideproducción por un elicitor fúngico en cultivo de suspensión celular deCistanche desertica' por Cui-tao Lu¹,∗ y Xing-Guo Mei²

----Biotechnology Letters 25: 1437–1439, 2003. © 2003 Kluwer Academic Publishers. Impreso en los Países Bajos.

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