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Eficacia clínica y análisis transcriptómico de gránulos de Congrong Shujing (苁蓉舒痉颗粒) en pacientes con enfermedad de Parkinson o síndrome de deficiencia de esencia de Shen (riñón)

CHEN Shi-ya1, XIAO Shao-jian1, LIN You-ning1, LI Xi-yu1, XU Qian2,

YANG Sha-sha2, HUANG Lian-hong3,4 y CAI Jing1,2

RESUMENObjetivo: Evaluar la eficacia clínica y la seguridad deGránulos Congrong Shujing(苁蓉舒痉颗粒, CSG) en el tratamiento de pacientes conenfermedad de Parkinson(PD) y la medicina china (CM) síndrome de Shen (Riñón) deficiencia de esencia, e investigar el mecanismo potencial que involucra la eficacia a través de un enfoque de secuenciación del transcriptoma. Métodos: Los pacientes de EP elegibles con el síndrome de deficiencia de esencia de Shen fueron asignados aleatoriamente a un grupo de tratamiento o a un grupo de control mediante una tabla de números aleatorios, y fueron tratados con CSG combinados con medicina occidental (WM) o placebo combinado con WM, respectivamente. Ambos ciclos de tratamiento duraron 12 semanas. el unificadoEnfermedad de ParkinsonLa puntuación de la escala de calificación (UPDRS), la puntuación de la pregunta PD-39 (PDQ-39), la puntuación de la escala del síndrome de CM y el uso de fármacos de todos los pacientes se evaluaron antes y después del tratamiento. La seguridad se evaluó mediante pruebas de laboratorio clínico y electrocardiógrafos. Se recogieron muestras de sangre de 6 pacientes de cada grupo antes y después del ensayo y se usaron para análisis transcriptómicos mediante análisis de ontología génica y análisis de vías de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto. Los genes expresados ​​diferencialmente se validaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa. Resultados: Se seleccionó un total de 86 pacientes con EP del Tercer Hospital Popular Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional China de Fujian entre enero de 2017 y diciembre de 2017. Finalmente, 72 pacientes completaron el ensayo, incluidos 35 en el grupo de tratamiento y 37 en el grupo de control. En comparación con el grupo de control después del tratamiento, los pacientes del grupo de tratamiento mostraron disminuciones significativas en la puntuación sub-Ⅱ de UPDRS, la puntuación de PDQ-39, la puntuación del síndrome de CM y la dosis equivalente de levodopa (P<0.05). during="" the="" treatment="" course,="" no="" significant="" changes="" were="" observed="" in="" safety="" indicators="" between="" the="" two="" groups="" (p="">0.05). Se propuso un posible mecanismo de eficacia clínica que implicaba la regulación de los procesos relacionados con el metabolismo celular y las vías relacionadas con los ribosomas. Se demostró que el tratamiento con CSG afecta los loci de genes relevantes para la EP, incluidos AIDA, ANKRD36BP2, BCL2A1, BCL2L11, FTH1P2, GCH1, HPRT1, NFE2L2, RMRP, RPS7, TGFBR1, WIPF2 y COX7B. Conclusiones: los CSG combinados con WM se pueden usar para tratar pacientes con EP con síndrome de CM de deficiencia de esencia de Shen con buena seguridad. Se propusieron el posible mecanismo de acción y los loci de genes relevantes. (Nº de registro ChiCTR-IOR-16008394)

PALABRAS CLAVE Gránulos Congrong Shujing, enfermedad de Parkinson, ensayo controlado aleatorizado, secuenciación de ARN, transcriptómica, medicina china

enfermedad de Parkinson(PD) es una enfermedad neurodegenerativa que ocurre tanto en la población de mediana edad como en la de edad avanzada. Su prevalencia, morbilidad y carga económica asociada han aumentado constantemente. En la población general, la prevalencia estimada de PDn en países industrializados es 0.3 por ciento. En el año 2030, se espera que el número de pacientes con EP alcance los 4940000 en China y los 8670000 en todo el mundo. El riesgo relativo de muerte en pacientes con EP es aproximadamente el doble en comparación con la población total. Sin embargo, los regímenes de tratamiento actuales no pueden impedir la progresión de la afección. Con la progresión de la enfermedad, la efectividad clínica del régimen de medicación a menudo disminuye, y el funcionamiento diario y la participación social se ven significativamente comprometidos). Por lo tanto, la atención a largo plazo de los pacientes con EP genera una carga económica significativa para las personas, las familias y la sociedad.

La levodopa, el "estándar de oro" para el tratamiento de la EP, generalmente es eficaz durante 3 a 5 años. Después de eso, los pacientes comúnmente experimentan complicaciones motoras graves, incluido el fenómeno del final de la dosis, rigidez matutina, congelación y discinesia. Tratamiento de la EP conmedicinas chinas(CM) pueden mejorar los síntomas clínicos de los pacientes y los efectos secundarios correspondientes, mejorando así la calidad de vida de los pacientes con EP.

Gránulos Congrongjing(苁蓉精颗粒, CRJ) se compone principalmente deHerba Cistanchesy Polygonatum sibiricum, que se deriva de la famosa Decocción Dihuang (地黄饮子) con receta clásica de CM que se utiliza para el tratamiento de la EP. En nuestros estudios experimentales anteriores, se confirmaron los efectos beneficiosos de CRJ. Los datos mostraron que Polygonatum sibiricum yHerba Cistanches, el principal componente de CRJ, mejoró la expresión de dopamina, redujo el contenido de factores de apoptosis relacionados (caspasa-3, FasL), aumentó la expresión de factores neurotróficos y disminuyó la apoptosis de las células nerviosas dopaminérgicas. El estudio también mostró que CRJ protegía a las neuronas dopaminérgicas al regular la apoptosis y el factor neurotrófico derivado de células gliales. Todo lo mencionado anteriormente sugería que CRJ era un medicamento terapéutico seguro y valioso para el tratamiento de la EP.

Con base en nuestra experiencia clínica e investigación experimental, CRJ se modificó agregando Radix Paeoniae Rubra, Cortex Moutan y Salvia miltiorrhiza Bge., por lo tantoCGránulos de Shujing ongrong(苁蓉舒痉颗粒, CSG) fueron compuestos. Este estudio observó la eficacia clínica de los CSG en el tratamiento de pacientes con EP con síndrome de CM de deficiencia de esencia de Shen (riñón) y los cambios genéticos en el ARNm de sangre periférica de los pacientes. Para investigar el mecanismo de acción subyacente de los CSG en el tratamiento de la EP, se utilizó un enfoque de secuenciación de ARN (RNA-seq) para analizar exhaustivamente las transcripciones de genes de los pacientes antes y después del ensayo, y para identificar y validar genes expresados ​​diferencialmente (DEG). .

MÉTODOS

Criterios de diagnóstico

Los criterios de diagnóstico de la medicina occidental (WM) se refirieron a los últimos estándares de diagnóstico de EP publicados por la Sociedad Internacional de Parkinson y Trastornos del Movimiento en 2015. Los criterios de diagnóstico de CM del síndrome de deficiencia de esencia de Shen se refirieron a los estándares relacionados publicados por China Press of Traditional Chinese. Medicamento.

Los criterios de inclusión y exclusión

Se incluyeron en el estudio pacientes que cumplieron con los criterios de diagnóstico de WM anteriores, así como con los criterios de diferenciación del síndrome de CM para la deficiencia de esencia de Shen, de 50 a 80 años de edad, con una escala de estadificación de Hoehn-Yahr (HY) de 4 y firmaron consentimientos informados por escrito. . Los pacientes a los que se les diagnosticaron enfermedades graves, como disfunción orgánica grave, enfermedades mentales o neurológicas, infecciones graves, tumores, encefalitis o constitución alérgica, recibieron tratamiento con CM para la EP en los 3 meses anteriores o participaron en otros ensayos clínicos en los últimos 3 meses. excluido.

Criterios de abandono y terminación

Los pacientes que se retiraron voluntariamente del ensayo o que no pudieron ser contactados se consideraron abandonos. Los pacientes que experimentaron efectos adversos graves o enfermedades y complicaciones graves repentinas y no pudieron continuar con el ensayo, tuvieron un cumplimiento deficiente del sujeto, recibieron menos del 80 por ciento o más del 120 por ciento de las dosis de tratamiento designadas, violaron los protocolos del ensayo, proporcionaron información incompleta que afectados la evaluación de la eficacia fueron excluidos del estudio.

Participantes

Se inscribieron pacientes ambulatorios y pacientes hospitalizados de DP elegibles del Tercer Hospital Popular Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional China de Fujian. El plan experimental, el consentimiento informado y los formularios de informes de casos recibieron la aprobación por escrito del Comité de Ética Médica del Tercer Hospital Popular Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional China de Fujian (No. 2017KS-6-1) y se registraron en el Centro Clínico Chino. Registro de prueba (número de registro ChiCTR-IOR-16008394).

Estimación del tamaño de la muestra

El tamaño de la muestra se calculó en función de los datos presentados en el estudio anterior, y el método de estimación del tamaño de la muestra fue establecido por el China Clinical Trials Statistical Working Grupo. Usando la fórmula de diseño de contenido de la muestra de un diseño totalmente aleatorizado, y considerando una tasa de abandono del 20 por ciento, se determinó que el grupo de tratamiento y el grupo de control deberían incluir 43 sujetos, respectivamente.

Aleatorización, ocultamiento de la asignación y cegamiento

En este estudio, se empleó un método doble ciego completamente aleatorio. Se usó el software SPSS para asignar aleatoriamente a los sujetos a los dos grupos y para generar una tabla con números aleatorios. Los farmacéuticos dispensaron medicamentos de acuerdo con la tabla. Los sujetos, los médicos y los revisores estaban cegados a la asignación de sujetos y fármacos.

drogas

Cada dosis de CSG estaba compuesta por el extractivo deHerba Cistanches6 g, Polygonatum sibiricum 12 g, Salvia miltiorrhiza Bge. 15 g, Radix Paeoniae rubra 12 g y Cortex Moutan 10 g. El placebo se compone de Radix Bupleuri al 5 por ciento con almidón, dextrina, etc. Su apariencia, olor y sabor son similares a los de los CSG. Tanto los CSG (lote n.° 16004691) como el placebo (lote n.° 16004728) fueron proporcionados por Beijing Kangrentang Pharmaceutical Co., Ltd. (Beijing, China) y distribuidos por el Departamento de Farmacia del Tercer Hospital Popular Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional de Fujian. Medicina china.

Tratamiento

Los sujetos del grupo de tratamiento recibieron tratamiento con WM combinado con CSG, mientras que los sujetos del grupo de control recibieron tratamiento con WM combinado con placebos. Los MT fueron seleccionados de acuerdo a la directriz. Entre ellos, los fármacos más utilizados fueron Madopar (lote No. H10930198, Shanghai Roche Pharmaceutical Co. Ltd., China) y Sifrol (Boehringer Ingelheim Pharma GmbH, Alemania). De acuerdo con la pauta provista, durante el tratamiento, los médicos primarios ajustarían la dosis del medicamento según la condición del paciente. Cada dosis de CSG y placebo se dividió en dos paquetes iguales, tomados 0,5 h después del desayuno y la cena, respectivamente, durante 12 semanas consecutivas.

Medidas de resultado

Para las medidas de resultado, incluidas las escalas de calificación del uso de fármacos y los índices relacionados, los sujetos de ambos grupos fueron evaluados por médicos capacitados tanto antes del estudio como 3 meses después de la administración de la dosis inicial.

Medidas de resultado primarias

La Escala Unificada de Calificación de la Enfermedad de Parkinson (UPDRS) estuvo compuesta por puntajes de Ⅰ (comportamiento mental, comportamiento activo y emoción), Ⅱ (actividades de la vida diaria), Ⅲ (examen motor) y Ⅳ (complicaciones motoras). Cuanto mayor sea la puntuación, más grave será la condición.

Medidas de resultado secundarias

Las medidas de resultado secundarias incluyeronEnfermedad de ParkinsonPuntuación de la pregunta-39 (PDQ-39),(21) puntuación de la escala del síndrome de CM y uso de drogas de WM. PDQ-39 evalúa la calidad de la vida diaria de los pacientes con EP al calificar sus acciones, emociones, vida diaria y apoyo social. La escala de síndrome de MC puntúa los síndromes de MC relacionados de los pacientes con EP para evaluar la gravedad de la enfermedad (Apéndice 1). La dosis de WM se calculó como dosis equivalente de levodopa (LED). Para los medicamentos relacionados con el tratamiento de la EP y sus complicaciones que no estaban incluidos en la fórmula LED (es decir, clorhidrato de benzhexol), se hicieron las observaciones correspondientes.

Evaluación de seguridad

Las pruebas de laboratorio clínico que incluyen 3 rutinas principales (sangre/orina/heces), función hepática (aspartato transaminasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT)) y función renal (nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina sérica (Cr)) así como como electrocardiógrafo (ECG) de los pacientes fueron evaluados antes y después del juicio. Cualquier evento adverso se registró con detalles del momento, el grado de gravedad, los síntomas, la duración, las medidas tomadas y los resultados.

Análisis estadístico

Se utilizó SPSS versión 24.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.) para el análisis estadístico. Los datos de medición con distribución normal se expresaron como la media ± desviación estándar (x–± s), mientras que los datos con distribución no normal se expresaron como la mediana y el rango intercuartílico. Los conteos se expresaron como números absolutos y tasas. Al comparar los datos de medición entre grupos, se aplicó la prueba t de dos muestras si los datos/datos transformados seguían una distribución normal. En otros casos, se aplicó la prueba de suma de rangos de dos muestras. Al comparar los datos de medición antes y después de la prueba, se aplicó una prueba t de muestra pareada si los datos/datos transformados seguían una distribución normal, mientras que se aplicó la prueba de suma de rangos de muestra pareada. Para la comparación de los datos de conteo se empleó la prueba de Chi-cuadrado. PAGS<0.05 was="" considered="" statistically="">

Experimentos de secuenciación del transcriptoma

RNA-seq Se seleccionaron aleatoriamente muestras de sangre de 6 pacientes de cada grupo antes y después del ensayo, y se extrajo, purificó y evaluó el RNA. Para completar la construcción de la biblioteca de muestras de secuenciación, el ARN total se sometió a eliminación de ARNr, fragmentación, síntesis de ADNc de primera cadena, síntesis de ADNc de segunda cadena, reparación terminal, adición de A en el extremo 3', conexión conjunta y enriquecimiento. La biblioteca construida fue validada por Qubit® 2.0 Fluorómetro y Agilent 2100. La secuenciación se realizó después de la validación de la biblioteca.

Análisis Bioinformático

Para el análisis bioinformático, las lecturas sin procesar derivadas del análisis de secuenciación se purificaron primero para obtener lecturas limpias y de alta calidad. Posteriormente, se utilizó un algoritmo de mapeo empalmado de His en 2 (versión 2.04) para el mapeo del genoma de las lecturas limpias. El número de lecturas se convirtió en fragmentos por kilobase del modelo de exón por millón (FPKM) de lecturas asignadas mediante Stringtie (versión 1.3.0) ​​y la media recortada de los métodos de valores M para estandarizar la expresión génica. A continuación, se calculó el cambio en la expresión génica diferencial a partir del FPKM. Los genes con valor ac 0,05 y foldchange 2 se consideraron DEG. A los DEG del grupo correspondiente con eficacia clínica, análisis de enriquecimiento de función de ontología génica (GO) y ruta de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG)

Se aplicó el análisis de enriquecimiento. Después de ajustar los criterios de variación, se seleccionaron los DEG de cada grupo antes y después del ensayo, que fueron los loci del gen efecto delCistanche deserticaextracto. Los genes seleccionados se validaron aún más mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR).

RESULTADOS

Condiciones de finalización de la prueba

A total of 86 PD patients were selected from the Third Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine between January 2017 and December 2017, 43 patients in each group. Finally, 72 patients completed the trial following the protocol, including 35 in the treatment group and 37 in the control group. The study flow diagram is presented in Figure 1. Between groups, no statistically significant difference was observed in age, disease stage, and H-Y stage (P>0.05, Tabla 1).

Comparación de puntajes UPDRS entre los dos grupos

There was no significant difference between the two groups before treatment in UPDRS total score and subsection score (P>0.05). En comparación con las puntuaciones antes del tratamiento, la puntuación total UPDRS y la puntuación sub-Ⅱ disminuyeron significativamente en el grupo de tratamiento después del tratamiento (P<0.05). moreover,="" when="" compared="" with="" the="" control="" group="" after="" treatment,="" the="" updrs="" sub-ⅱ="" score="" was="" significantly="" decreased="" in="" the="" treatment="" group=""><0.05). however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" updrs="" total="" score="" between="" the="" two="" groups="" after="" treatment="" (p="">0.05, Tabla 2).

Comparación de las puntuaciones del PDQ-39, las puntuaciones del síndrome de CM y el consumo de drogas entre los dos grupos

There was no significant difference between the two groups before treatment in PDQ-39 scores, CM syndrome scores, and drug dosage (P>0.05). En comparación con antes del tratamiento, las puntuaciones PDQ-39, la puntuación del síndrome de CM y la LED se redujeron significativamente en el grupo de tratamiento después del tratamiento (P<0.05). moreover,="" when="" compared="" with="" the="" control="" group="" after="" treatment,="" the="" pdq-39="" score,="" cm="" symptom="" score="" and="" led="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" treatment="" group=""><0.05, table="">

Evaluación de seguridad

During the trial, 2 cases in the treatment group with adverse events were observed. Both adverse reactions were light in grade and occurred on day 4 after the start of the trial, with symptoms of internal heat, thirsty, and dryness heat. One of them was not willing to continue the trial and dropped out. One week after terminating the CM granules, the symptoms reduced and then disappeared. Regarding the other subject, after Paeoniae Rubra and Salvia Miltiorrhiza were added to the CSGs, symptoms reduced after 4 days and disappeared. No changes were observed in the clinical laboratory tests and ECG that were directly related to the trial. In addition, no statistically significant differences were observed between the two groups in any of the indices before and after the trial (P>0.05).

Comparación de genomas

De las seis muestras en cada grupo, el rango del número de lecturas en el gen de referencia fue 74452867–117774869. Las proporciones de mapeo de las secuencias del transcriptoma de muestra fueron del 87,30 % al 96,14 %.

Análisis funcional de DEG Análisis GO de DEG
Los DEG del grupo de tratamiento antes y después del ensayo se agruparon en 47 grupos funcionales (Figura 2). Además, los DEG entre el grupo de tratamiento y el grupo de control después del ensayo se agruparon en 35 grupos funcionales (Figura 3). Los DEG se relacionaron principalmente con procesos de regulación y metabolismo celular.

Análisis de enriquecimiento KEGG de DEG
Análisis de enriquecimiento de vías utilizando la base de datos pública KEGG de DEG del grupo correspondiente con significación estadística clínica de P<0.05 of="" the="" efficacy="" evaluation="" indices="" above="" suggested="" that pd-related="" degs="" were="" likely="" to="" be="" enriched="" in="" the="" following="" 4="" signaling="" pathways:="" (1)="" ribosome-related signaling="" pathways,="" (2)="" endocytosis-related="" signaling="" pathways,="" (3)="" foxo="" signaling="" pathways,="" and="" (4)="" were="" identified.="" moreover,="" 1="" up-regulated="" gene="" and="" 12="" down-regulated="" genes="" were="" identified="" in="" the="" control="" group.="" according="" to="" the="" quantitative="" analysis="" of="" degs,="" 13="" highly="" degs="" related="" to="" csgs="" had="" an="" effect="" in="" the="" pd="" patients="" screened,="" including="" aida,="" ankrd36bp2,="" bcl2a1,="" bcl2l11,="" fth1p2,="" gch1,="" hprt1,="" nfe2l2,="" rmrp,="" rps7,="" tgfbr1,="" wipf2,="" and="">

Análisis de RT-PCR
Los genes mencionados anteriormente se validaron mediante análisis RT-PCR. Entre ellos, AIDA, ANKRD36BP2, BCL2A1, GCH1, HPRT1, NFE2L2, RMRP, RPS7 y COX7B eran genes regulados al alza, mientras que TGFBR1 estaba regulado a la baja (Apéndice 3). Además, no hubo diferencia significativa en el cambio de los otros tres genes.

DISCUSIÓN

Un total del 95 por ciento de los pacientes con EP tienen entre 40 y 70 años. La edad de aparición suele ser alrededor de los 50 años y la incidencia aumenta con la edad. En estudios anteriores, se sugirió que los ingredientes activos en los CSG reducían el daño relacionado con la oxidación de la EP y disminuían la apoptosis de las neuronas dopaminérgicas. Los resultados de este ensayo indicaron que los CSG redujeron la dosis del medicamento y mejoraron la calidad de vida de los pacientes con EP. En este estudio, un total de 72 de 86 sujetos completaron la prueba. La tasa de finalización fue solo del 83,7 por ciento, que fue relativamente baja en comparación con otros ensayos clínicos similares. Las razones pueden estar relacionadas con los dos conjuntos de pruebas exhaustivas de los sujetos antes y después del ensayo, cuestionarios complicados y un seguimiento regular de 3-meses. visitas de seguimiento para ajuste de dosis. Se requieren más esfuerzos para mejorar el cumplimiento de los sujetos y la tasa de finalización de los ensayos.

Sin embargo, hay más preguntas por responder. ¿Pueden los CSG sustituir medicamentos, como la dopamina, en la etapa inicial del tratamiento de la EP y retrasar la toma de medicamentos? ¿Hasta qué etapa de la DP los CSG tienen un efecto significativo en la reducción de la dosis de medicación? ¿Pueden los CSG extender el período efectivo de la medicación? Para abordar estas preguntas, se justifican más esfuerzos, incluidos estudios de casos adicionales, períodos de tratamiento más prolongados, seguimiento prolongado después del tratamiento, mayor estratificación detallada de la gravedad y la edad, y un análisis estadístico más completo.

Con base en la observación de la efectividad de los CSG en el tratamiento de pacientes con EP, en este estudio investigamos el posible mecanismo de la eficacia clínica de los CSG y genes relacionados a través de la tecnología RNA-seq. Se obtuvieron la transcripción, los resultados del análisis de la función GO relacionados con la eficacia clínica, los resultados del análisis de la ruta KEGG y los loci del gen actuante en el tratamiento de CSG en la EP. Sin embargo, se necesitarán más esfuerzos para identificar la vía principal que está involucrada en la actividad de los CSG, los ingredientes activos y los monómeros en los CSG para el tratamiento de la EP y los síntomas correspondientes de los loci de genes sobre los que actúan los CSG. Futuro
los estudios deben centrarse en integrar las teorías de MC con la bioinformática y la biología molecular moderna para investigar los efectos y el mecanismo de acción de la terapia de refuerzo de Shen en el tratamiento de la EP.

En resumen, los hallazgos indicaron que los CSG fueron efectivos para mejorar la calidad de vida, aliviar los síntomas de la MC y reducir la dosis del fármaco en pacientes con EP con síndrome de deficiencia de esencia de Shen. No se observaron efectos secundarios graves durante el ensayo. Nuestro estudio indicó que los CSG podrían ser un nuevo fármaco potencial para el tratamiento de la EP. Sin embargo, se necesitan estudios multicéntricos de mayor tamaño de muestra para confirmar estos hallazgos, lo cual está dentro de nuestro plan de investigación futuro.

Extraído de: Eficacia clínica y análisis transcriptómico de los gránulos de Congrong Shujing (苁蓉舒痉颗粒) en pacientes con enfermedad de Parkinson del síndrome de deficiencia de esencia de Shen (riñón) por CHEN Shi-ya1, etc.

------Chin J Integr Med 2020 Jun;26(6):412-419