Efectos de la angiotensina II sobre la producción de eritropoyetina en el riñón y el hígado

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Resumen: Losriñónes el sitio principal de producción de eritropoyetina en el cuerpo. Desarrollamos un nuevo método para la detección de la proteína EPO mediante transferencia de Western acoplada a la desglicosilación. La detección de Epo desglicosilada permite el examen de pequeños cambios en la producción de Epo. Usando este método, investigamos los efectos de la angiotensina II (ATII) en la producción de Epo en el riñón. ATII estimuló la concentración de Epo en plasma; Expresión de ARNm de Epo, HF2a y PHD2 en segmentos de nefrona en la corteza renal y la médula externa; y expresión de la proteína Epo en la corteza renal. La hibridación in situ y la inmunohistoquímica revelaron que ATII estimula la expresión de ARNm y proteínas de Epo no solo en los túbulos proximales sino también en los conductos colectores, especialmente en las células intercaladas. Estos datos respaldan la regulación de la producción de EPO en el riñón por el sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAS).

Palabras clave: eritropoyetina; angiotensina I; sistema renina-angiotensina-aldosterona; desglicosilación; transferencia de Western; HIF2; túbulos proximales; conductos colectores

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1. Introducción

La eritropoyetina (EPO) estimula la producción de eritrocitos en la médula ósea[1]. La hipoxia y la anemia estimulan la producción de Epo por el riñón [1-4]. La hipoxia severa y la anemia severa causan un aumento de más de 500-veces en la concentración sérica de Epo [5]. Sin embargo, tales condiciones son raras y la mayoría de las personas no las experimentan durante su vida. La concentración sérica de EPO en personas normales es baja y la expresión de la proteína Epo en los riñones de control ha sido demasiado baja para detectarla [5-8]. Desarrollamos un nuevo método de transferencia Western y descubrimos que la Epo desglicosilada es un marcador preciso de la expresión de la Epo [5,9]. La proteína EPO en el riñón se detecta a 34-43 kDa, y la desglicosilación con PNGasa cambia la banda a 22 kDa. La banda Eoo ancha se concentra en una banda estrecha de 22 kDa, lo que da como resultado un aumento en la sensibilidad de detección de 10-100-veces [5,9]. Por lo tanto, se ha hecho posible la detección de pequeños cambios en la producción de Epo.

El sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAS) regula la excreción renal de agua y electrolitos para mantener la homeostasis de los líquidos corporales [10,11]. Los inhibidores de RAS causan anemia al reducir la producción de Epo. Kim et al. informaron que la angiotensina II (ATI) aumenta la producción de Epo a través de la activación de la respuesta de crecimiento temprano mediada por el receptor de angiotensina 1 (AT1R) -1(Egr-1) ​​en células renales humanas 786-O [12,13 ] Kato et al. informó que los ratones transgénicos que tienen genes de renina y angiotensinógeno exhiben eritrocitosis y los ratones knockout que carecen de renina y angiotensinógeno exhiben anemia [14,15]. La infusión de ATII rescató la anemia de los ratones sin angiotensinógeno, lo que sugiere que una vía genética desde el angiotensinógeno hasta la AT desempeña un papel clave en la producción de Epo inducida por ATII. Estos informes sugieren que la producción de Epo está regulada no solo por hipoxia o anemia sino también por RAS [4,12,14-18]. En nuestros informes anteriores, mostramos que la aldosterona estimula la producción de Epo por parte de las células intercaladas de los conductos colectores [7]. En este informe, examinamos los efectos de ATII en la producción de Epo por elriñónyhígado.

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2. Resultados

2.1.Concentración de epo en plasma

La administración de ATI aumentó la concentración de Epo en plasma de 1,4 ± 0,2 a 2,9 ±0,3 mIU/mL (Figura la).

2.2. Expresión de ARNm de epo en la corteza renal y túbulos contorneados proximales microdiseccionados (PCT) y extremidades ascendentes gruesas medulares (MAL)

ATII estimuló la expresión de ARNm de Epo y HIF2& en la corteza renal 13,2±4,7 y 11,4±0,6 veces por A1 y A10, respectivamente(n=3-4) y 9,6±3,7 y 8 0,6±2,6 veces por A1 y A10, respectivamente (n=3-4)(Figura lbc). En PCT microdiseccionado, ATI aumentó el ARNm de Epo en 3,4±0,7 y 2,4± 0.2 veces por 10-9 M y 10-6M ATII, respectivamente (n=3) y HIF2& ARNm por 2.0±{{5{{ 54}}}}.2 y 2.3± 0.8 veces por 10-9M y 10-6 M ATII, respectivamente (n=3)(Figura 1ld,e). ATII también aumentó la expresión de ARNm de Epo en MAL en 4,3±1,0 y 6,5±2,0 veces por 10-M y10-6MATIrespectivamente (n=3)(Figura 1f

2.3. Hibridación in situ de Epo y los efectos de ATII

La expresión de ARNm de EPO se observó en nefronas corticales en condiciones basales, como se informó anteriormente [19]. ATII estimuló la expresión de ARNm de Epo en PCT, MAL y túbulos colectores corticales y medulares (CCD y OMCD) después de 2 h (Figura 2:2a, 2d ). La expresión de ARNm de HIF2a aumentó en la mayoría de los segmentos de nefronas y células peritubulares tanto de la corteza como de la médula (Figura 2:2-4b,2-4e). La expresión de ARNm de PHD2 también aumentó en MAL, CCD y OMCD (Figura 2:3-4c, 3-4f).ATII no logró inducir la expresión de ARNm de Epo en las células peritubulares de la corteza renal.

2.4. Análisis de Western Blot de la producción de Epo inducida por ATI en el riñón y el hígado

Los efectos de la fludrocortisona, un agonista de la aldosterona, se examinaron mediante transferencia Western acoplada a la desglicosilación. La banda de Epo desglicosilada a 22 kDa se observó en ratas de control (C2, C4 y C6 en el lado derecho de la Figura 3a), lo que demuestra que la Epo se produce en ratas de control. La fludrocortisona estimuló significativamente la expresión de Epo desglicosilada a las 2 y 4 h después de la inyección. La expresión llegó a ser igual a la de las ratas de control después de 6 h. A continuación, se examinó el efecto de la expresión de ATIIon Epo. El efecto de ATI sobre la producción de Epo fue mayor en la corteza renal que en la médula renal externa (Figura 3b). El efecto de ATI sobre la producción de Epo no se observó en la médula interna renal (datos no mostrados). La ATI aumentó la expresión de la proteína Epo de forma dependiente de la dosis (Figura 3c). La AT aumentó la producción de Epo desglicosilada en la corteza renal en 1.6±0.2 y 3.4±0.3 veces en 1 y 10 mg/kg respectivamente (n=6-8). Por el contrario, no se observó producción de EPO en el hígado, incluso después de la administración de ATII (Figura 3d).

2.5. Inmunohistoquímica de la producción de Epo por el riñón

Por IHC de ratones, en condiciones basales, se encontró tinción de Epo desde los túbulos proximales hasta los conductos colectores (túbulos proximales

3. Discusión

La detección de Epo mediante transferencia de Western fue difícil hasta que encontramos un ensayo acoplado de desglicosilación [5,7,9,20-26]. En hipoxia severa y anemia, la producción de EPO se estimula a un nivel alto y la detección de Epo es fácil [2-5]. Sin embargo, tales condiciones son raras in vivo. Descubrimos que la Epo es producida por el riñón incluso en condiciones de control. La detección de Epo en el riñón de control es difícil, incluso mediante transferencia de Western. La desglicosilación de Epo por PNGasa aumenta la intensidad de la banda de Epo a 22 kDa, lo que permite detectar niveles más bajos de EPO. Usando este método, investigamos los efectos de fludrocortisona y ATII en la producción de Epo.

ATll aumentó la expresión de ARNm de Epo en la corteza renal. A continuación, examinamos los efectos de la expresión de ARNm de ATIIon Epo en PCT microdiseccionado y MAL. ATll aumentó la expresión de ARNm de Epo en PCT y MAL. También examinamos los efectos de ATI mediante hibridación in situ (ISH). ISH reveló que ATI aumenta la expresión de ARNm de Epo no solo en

túbulos proximales sino también en túbulos distales. Además, investigamos la expresión de la proteína Epo mediante transferencia de Western. En este estudio se usó transferencia de Western acoplada a desglicosilación. Los resultados muestran que ATIl aumenta la expresión de la proteína Epo en el riñón pero no en el hígado de forma dependiente de la dosis. La concentración plasmática de Epo aumentó 2-3-veces, lo que es compatible con informes anteriores 4,68,12. Este nivel de producción de EPO en la sangre no se puede medir mediante transferencia Western. Sin embargo, la transferencia de Western acoplada a la desglicosilación hizo posible la detección, y la ATII aumentó significativamente la expresión de la proteína Epo en el riñón. La inmunohistoquímica también mostró que ATlI aumenta la expresión de la proteína Epo tanto en los túbulos proximales como distales. El efecto de ATII es idéntico al de la fludrocortisona en las células intercaladas de los conductos colectores [7]. Nuestro estudio es el primero que muestra la localización intrarrenal de la producción de Epo inducida por ATII por ISH e IHC.

AT II también aumentó la expresión de ARNm de HIF2 en la corteza renal y túbulos contorneados proximales, lo que demuestra que el aumento en la producción de Epo por ATII es causado por la estimulación de HIP2, al igual que la aldosterona [7l. Nuestro estudio indica que la producción de EPO por el riñón está regulada por el sistema renina-angiotensina-aldosterona. Se ha sugerido el papel de ATIⅡ en la producción de Epo en el riñón [4,12,16-18]. Jelkmann sugirió efectos indirectos de la angiotensina Ⅱl como factor de crecimiento para los progenitores eritrocíticos mieloides |4|. Kim et al. informó claramente que la angiotensina II estimula la producción de Epo a través de la activación de Egr-1 mediada por AT1R por la proteína quinasa activada por mitógeno p21Ras/quinasa regulada por señal extracelular (ERK) quinasaERK/2 en células renales humanas 786-O [12.13 ]. Kato et al. examinaron el papel de una vía genética desde el angiotensinógeno hasta la ATII. [14,15]. Demostraron que los ratones transgénicos que tenían genes de renina y angiotensinógeno presentaban eritrocitosis. También informaron que los ratones knockout que carecían de renina y angiotensinógeno presentaban anemia que se recuperó con la infusión de ATI, lo que sugiere que una vía genética desde el angiotensinógeno hasta la ATII juega un papel clave en la producción de Epo inducida por ATI. Los mecanismos de producción de Epo en condiciones basales e hipóxicas severas pueden ser diferentes, pero algunos pasos, como la estimulación de HIF2, podrían ser los mismos. La capacidad de producir Epo sería diferente entre las células intersticiales renales y las nefronas. La detección de HIF2 por transferencia Western no tuvo éxito en este estudio; no pudimos detectar la banda HIF2 a alrededor de 115 kDa, incluso mediante el uso de sc-46691, sc-13596, Ab8365 y NB100-122.

4. Materiales y Métodos

4.1.Materiales y animales

Se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley (Japan SLC, Hamamatsu, Japón) y ratones C57BL/6J (Charles River Japan, Yokohama, Japón). Las ratas recibieron 1 o 10 mg/kg de ATI (A1 y A10, respectivamente), y los ratones recibieron 5 mg/kg de ATII mediante inyección intraperitoneal. Al grupo de control se le inyectó solución salina. Después de 4 h, se inyectó a las ratas un anestésico mixto (00,3 mg/kg de medetomidina, 4,0 mg/kg de midazolam y 5,0 mg/kg de butorfanol), y se extrajo sangre. tomado de la aorta abdominal. Los riñones y el hígado se diseccionaron después de perfundir 20 ml de PBS en la aorta abdominal. En algunos experimentos, se incubaron rodajas de riñón en colagenasa (tipo 1, C-0130; Sigma-Aldrich, Burlington, NJ, EE. UU.) y complejos de ribonucleósido vanadilo (R-3380; Sigma-Aldrich) durante 20 min. , y PCT y MAL fueron microdiseccionados, como se describió anteriormente [7]. Se incubaron PCT o MAL microdiseccionados con ATI o el vehículo durante 2 horas a 37 grados. Los ratones se anestesiaron con isoflurano al 1,5 por ciento en O2 al 30 por ciento (una mezcla de O al 100 por ciento y aire) después de 2,4 y 6 horas. Los riñones se extrajeron rápidamente y se cortaron longitudinalmente. Las principales piezas de riñón se fijaron por inmersión en paraformaldehído al 4 por ciento/tampón de fosfato 0,1 M enfriado con hielo durante la noche y se procesaron en parafina para el análisis histológico.

Nuestros protocolos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Ética Institucional del Centro Médico de la Universidad de Kitasato (2018032, 2019029) y la Facultad de Medicina de la Universidad de Kitasato (2019-141).

4.2. PCR en tiempo real

El ARN se extrajo del riñón, el hígado y PCT o MAL microdiseccionado utilizando Qiacube y el RNeasy Mini Kit (74106; Qiagen, Venlo, Países Bajos), como se describió anteriormente [5]. El ADNc se sintetizó utilizando un kit de síntesis de ADNc de la primera hebra Takara PrimeScript II (6210; Takara, Otsu, Japón). La PCR en tiempo real se realizó con sondas de Applied Biosystems (GAPDH Rn01775763 g1, Epo Rn00667869 m1.HIF2 Rn00576515 m1. HIFla Rn01472831 m1, PHD2 Rn00710295 m1; Waltham, MA, EE. UU.) y Premix Ex Taq (RP39LR; Takara). expresión de ARNm en ratas de control y ATII se compararon usando AACT.

4.3. Hibridación in situ

Se realizó ISH, como se describió anteriormente [5, 27]. En resumen, el ARN total de los riñones de ratón (636612; BDBioscieces Clontech) se transcribió inversamente con un kit de PCR de ARN (AMV), ver. 3.0 (RR019; Takara), y la sonda de cRNA para Epo (número de acceso de GenBank NM 007942).HIF2 (número de acceso de GenBank n.º NM 010137), o PHD2 (n.º de acceso de GenBank NM_053207) con cebadores de PCR de cola de región promotora T7. Las secciones hibridadas se trataron sucesivamente con avidina al 0,1 %, solución de biotina al 0,01 %, caseína al 0,5 %/TBS, anticuerpo de fragmento anti-DIG F (ab') de oveja conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (11207733910; Roche Diagnostics, Basilea, Suiza) solución de tiramida biotinilada y estreptavidina conjugada con HRP (P0397; DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca). Las secciones se tiñeron con el sistema líquido DAB (BSB 0016: Bio SB.Santa Barbara.CA, EE. UU.) y hematoxilina de Mayer (30002; Muto Pure Chemicals, Tokio, Japón).

4.4. inmunohistoquímica

Las secciones de riñón se inmunoteñeron, como se describió anteriormente [7, 28]. En resumen, las secciones se bloquearon con suero de cabra normal al 5 por ciento y reaccionaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-Epo humano (sc-7956, 1:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.), seguido de Histofine Tinción simple MAX-PO (414341F; Nichirei Bioscience, Tokio, Japón). Las secciones se tiñeron usando el sistema líquido DAB y se contrastaron con hematoxilina de Mayer.

Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio óptico (Axioplan 2; Carl Zeiss, oberkochen, Alemania) con una cámara digital (AxioCam MRcb; Carl Zeiss). Las imágenes capturadas se analizaron utilizando un sistema de análisis de imágenes (AxioVision Rel.4.6; Carl Zeiss).

4.5. Análisis de Western Blot con desglicosilación

Se realizó un análisis de transferencia Western, como se describió anteriormente [4, 6, 7]. La proteína se recolectó de la corteza renal y el hígado usando CelLytic MT (C-3228; Sigma-Aldrich) y se usó para transferencia Western. Las muestras de riñón e hígado se desglicosilaron usando N-glicosidasa F (PNGasa, 4450); Takara, como se describió anteriormente. En resumen, se añadió 1 μL de SDS al 10 % a 10 μL de muestras de riñón o hígado y se hirvió durante 3 min. Luego, se agregaron 11 uL de tampón estabilizador 2X y las muestras se agitaron en vórtex. Después de la adición de 1-2 μL de PBS o PNGasa, las muestras se incubaron en un baño de agua durante 20 ha 37 grados. Después de la incubación, las muestras se centrifugaron y el sobrenadante se recolectó y usó para SDS-PAGE (10-20 porcentaje de gel de gradiente: Cosmo Bio No, 414893. Tokio, Japón). El tampón estabilizador 2X contenía Tris- HCl (pH 8,6), 48 mMEDTA, 4 % de Nonidet P-40 y 8 % de 2-mercaptoetanol. Se utilizó Epo humana recombinante (rhEpo, 587102; BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.) como control positivo. Después de SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Immobilon-P; IPVH00010: Merck Millipore, Burlington.NI.USA) con 120 mA durante 60-90 min. La membrana se bloqueó con leche descremada al 5 % (Morinaga, Japón) durante 60 min y se incubó con el anticuerpo contra Epo (sc-5290, 1:500; Santa Cruz Biotechnology) durante 60 min a temperatura ambiente. Después del lavado, la membrana se incubó con un anticuerpo secundario (IgG de cabra anti-ratón (H más L);115-035-166, 1:5000; Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, EE. UU.) durante 60 min. Las bandas se visualizaron mediante el sistema de detección de transferencia Western ECL Select (RPN2235; GE Healthcare Bio-Science AB, Chicago, IL, EE. UU.) y LAS4000 (Fujifilm, Tokio, Japón).

4.6. Mediciones de concentración de epo en plasma

Se recogió plasma de ratas de control y tratadas con ATI 4 h después de la inyección peritoneal. Las concentraciones de EPO en plasma fueron medidas por CLEIA (SRL, Tokio, Japón) utilizando Access Epo de Beckman Coulter (Brea, CA, EE. UU.).

4.7. Plasma E

Los datos se expresan como la media ± SEM. La significación estadística se realizó utilizando Excel Statistics (BellCurve, Tokio, Japón). La significancia estadística se analizó utilizando una prueba f o un análisis no paramétrico utilizando la prueba de Kruskal-Wallis y comparaciones múltiples mediante la prueba de Shirley-Williams. valores p<0.05 were="" considered="" statistically="">

5. Conclusiones

En conclusión, nuestro estudio muestra que ATII aumenta la expresión de ARNm y proteína de Epo en los túbulos renales proximales y distales. Combinado con nuestros estudios previos, la producción de Epo por el riñón en condiciones basales está regulada por el sistema renina-angiotensina-aldosterona.