Expresión de alfa defensina 5 humana en el riñón humano y el tracto urinario
Mar 16, 2022
Para más información: ali.ma@wecistanche.com
John David Spencer y otros
Resumen
Fondo:Los mecanismos que mantienen la esterilidad en el tracto urinario no se conocen por completo. Estudios recientes han implicado la importancia de los péptidos antimicrobianos (AMP) en la protección del tracto urinario de la infección. Aquí, caracterizamos la expresión y la relevancia de la alfa-defensina 5 humana (HD5) de AMP en el humanoriñóny tracto urinario en sujetos normales e infectados.
Metodología/Principales Hallazgos:Usando ARN aislado de humanosriñón, uréter y tejido de la vejiga, realizamos PCR cuantitativa en tiempo real para mostrar que DEFA5, el gen que codifica HD5, se expresa de manera constitutiva en todo el tracto urinario. Con pielonefritis, la expresión de DEFA5 aumentó significativamente en elriñón. Usando el análisis de inmunotransferencia, la producción de HD5 también aumentó con la pielonefritis. Inmunotinción HD5 localizada al urotelio de la vejiga y el uréter. En el riñón, HD5 se produjo principalmente en la nefrona distal y en los túbulos colectores. Utilizando ensayos de inmunotransferencia y ELISA, HD5 no se detectó de forma rutinaria en muestras de orina humana no infectada, lo que significa que la producción urinaria de HD5 aumentó con la infección del tracto urinario por E.coli.
Conclusiones/Importancia:DEFA5 se expresa a través del tracto urinario en sujetos no infectados. Específicamente, HD5 se expresa en todo el urotelio del tracto urinario inferior y en los túbulos colectores delriñón. Con la infección, la expresión de HD5 aumenta en elriñóny los niveles se vuelven detectables en la orina. Hasta donde sabemos, nuestros hallazgos representan los primeros en cuantificar la expresión y producción de HD5 en el riñón humano. Además, este es el primer informe que detecta la presencia de HD5 en muestras de orina infectadas. Nuestros resultados sugieren que HD5 puede tener un papel importante en el mantenimiento de la esterilidad del tracto urinario.
Introducción
El tracto urinario, además del meato uretral, suele ser estéril a pesar de su proximidad con la flora fecal. Los mecanismos precisos por los cuales el tracto urinario mantiene su esterilidad no se conocen bien. Los mecanismos propuestos que contribuyen a la defensa del tracto urinario incluyen el flujo de orina, alteraciones en el pH y la osmolaridad de la orina, vaciamiento regular de la vejiga, componentes de defensa química del uroepitelio y desprendimiento/afluencia epitelial de células inmunitarias efectoras con estimulación bacteriana [1]. Además, recientemente se ha demostrado que los péptidos antimicrobianos (AMP) tienen un papel importante en el mantenimiento de la esterilidad del tracto urinario [2]. Los AMP, que sirven como antibióticos naturales producidos por casi todos los organismos, son un componente ubicuo del sistema inmunitario innato. Los AMP son moléculas catiónicas expresadas por glóbulos blancos fagocíticos y células epiteliales. En humanos y otros mamíferos, las defensinas son una familia importante de AMP. Las defensinas suelen tener una actividad antimicrobiana de amplio espectro contra bacterias, virus, hongos y protozoos grampositivos y gramnegativos [2,3]. Las defensinas se sintetizan inicialmente como preproproteínas y se procesan para convertirse en péptidos maduros biológicamente activos [4]. En los seres humanos, las defensinas se clasifican en una de dos familias según su patrón de puentes de disulfuro: las alfa-defensinas o las beta-defensinas [5].
En el tracto urinario, las beta-defensinas se expresan ampliamente en todo el uroepitelio. Células epiteliales que recubren elriñónel asa de Henle, el túbulo distal y el conducto colector expresan constitutivamente beta-defensina 1 humana (hBD1). Aunque los niveles urinarios de hBD1 son insuficientes para matar las bacterias invasoras, hBD1 proporciona un recubrimiento antimicrobiano de acción rápida de los lúmenes tubulares y previene la infección al inhibir la unión bacteriana al urotelio [6]. Estudios recientes indican que el estado redox de hBD1 afecta significativamente la potencia antimicrobiana, de modo que el péptido reducido es mucho más potente que la forma oxidada unida a disulfuro [7]. No se ha determinado el significado de esto en la superficie urotelial. Otra defensina, la beta-defensina 2 humana (hBD2) no se expresa constitutivamente en tejido renal sano; sin embargo, la expresión de hBD2 es inducida por infección [8].
A diferencia de las beta-defensinas, el papel de las alfa-defensinas derivadas del epitelio no está bien descrito en el tracto urinario. La expresión y función de las alfa-defensinas HD5 y HD6 se ha informado principalmente en el intestino delgado, donde las células Paneth las secretan en las criptas intestinales y contribuyen al equilibrio de la microbiota intestinal [9]. HD5 también se ha localizado en los tractos genitales masculinos y femeninos, con evidencia que sugiere que es inducible e importante en la erradicación de infecciones [10,11,12]. Se ha detectado HD5 urinario en pacientes que se han sometido a reconstrucción de neovejiga ileal y derivación urinaria del conducto ileal, por lo que la fuente de producción de HD5 se atribuyó principalmente a las células de Paneth ileales [13,14]. HD5 tiene actividad antibacteriana contra bacterias grampositivas y gramnegativas uropatógenas comunes [15]. HD5 también tiene actividad antimicrobiana contra virus uropatógenos como el adenovirus y el virus BK [16,17,18]. En este estudio, proporcionamos la descripción inicial y la cuantificación de la expresión de HD5 en humanos.riñóny definir aún más su expresión en el tracto urinario inferior durante la esterilidad y la infección.
Resultados
El ARNm de DEFA5 se expresa constitutivamente en la vejiga, el uréter y el riñón humanos.
La PCR cuantitativa en tiempo real demuestra que todas las pruebas de vejiga, uréter yriñónlos especímenes sin infección expresaron constitutivamente DEFA5. La expresión de DEFA5 fue significativamente mayor en el tracto urinario inferior que en el tracto urinario superior (p= 0.014). En la vejiga (n=4), la expresión media de DEFA5 fue de 4656637 transcritos por 10 ng de ARN y en el uréter (n=4) la expresión media de DEFA5 fue de 41126170 transcritos por 10 ng de ARN (Figura 1A) . En el riñón (n=6), la expresión media de DEFA5 fue de 29376274 transcritos por 10 ng de ARN. La expresión de DEFA5 se analizó por separado en la corteza renal, la médula y la pelvis. La expresión de DEFA5 no varió significativamente según la región renal (p= 0.45).
La expresión de DEFA5 y la expresión del péptido HD5 aumentan con la pielonefritis
Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real realizado entejidos renales conla pielonefritis demostró un aumento significativo en la expresión de DEFA5 en comparación con los tejidos renales no infectados. Con pielonefritis (n= 6), la expresión media de DEFA5 aumentó a 782961052 transcritos por 10 ng de ARN (p= 00,019) (Figura 2A).
Para evaluar aún más este aumento en la expresión con pielona-fritis, realizamos análisis de inmunotransferencia en el mismoriñóntejido utilizado para el análisis de PCR en tiempo real para evaluar los aumentos simultáneos en la producción de péptido HD5 (Figura 2B, panel central). El análisis de inmunotransferencia, utilizando antisueros HD5 policlonales, demostró una producción de péptido HD5 significativamente mayor en tejidos renales con pielonefritis (n {{5} }) en comparación con los no infectadosriñóntejidos (n=6). no infectadoriñóntejidos expresaron 300625 ng HD5/gramo de peso de tejido húmedo mientras queriñónel tejido con pielonefritis expresó 600621 ng HD5/gramo de peso de tejido húmedo (p, 0,0001). Las transferencias se volvieron a sondear con GAPDH para que sirvieran como control de carga (Figura 2B, panel central) y también se realizó una tinción de plata para confirmar la carga de proteína igual (Figura 2B, panel superior).
El péptido HD5 se produce en todo el riñón humano y el tracto urinario.
Se realizó inmunotinción para localizar la producción de HD5 en el tracto urinario. La inmunohistoquímica (IHC) mostró que la inmunorreactividad de HD5 estaba presente en todo el urotelio del uréter y la vejiga de todas las muestras investigadas (n=4, Figura 3). especímenes (n= 6, Figura 4). La inmunofluorescencia (IF) demostró que la expresión de HD5 era mayor en la nefrona distal y los túbulos colectores (Figura 5). El intersticio y los glomérulos no mostraron inmunorreactividad HD5. La inmunotinción que se muestra en las Figuras 3, 4 y 5 se realizó utilizando un anticuerpo anti-HD5 monoclonal de ratón (8C8) que reconoce el propéptido HD5 (Abcam, Cambridge, MA). Los resultados fueron similares cuando se usó el anticuerpo anti-HD5 policlonal de conejo que reconoce el propéptido HD5 y el péptido maduro (datos no mostrados), lo que sugiere que el HD5 se almacena como un propéptido.
Con la pielonefritis, la inmunotinción de HD5 aumentó notablemente. La inmunorreactividad de HD5 aumentó en toda la nefrona proximal, la nefrona distal y los túbulos colectores (Figura 4 y Figura 5). Al igual que en las muestras no infectadas, los glomérulos y el intersticio no mostraron expresión de HD5 con infección. Los controles negativos no mostraron inmunorreactividad HD5.
La orina humana infectada contiene concentraciones medibles de péptido HD5
El análisis de inmunotransferencia, utilizando antisuero policlonal de conejo que detecta el precursor proHD5 y formas procesadas posteriormente, identificó niveles medibles de HD5 en 13 de las 15 muestras de orina analizadas infectadas con E. coli uropatógena (Figura 6A y B). Cuando estaban presentes, los niveles de HD5, normalizados a creatinina en orina, oscilaron entre 299,8 y 669,7630 ng de HD5/mg de Cr en orina (110,67 ng/mL-276,67 ng/mL), lo que corresponde a 11,10-27,67 nmol/L. En muestras de orina no infectadas (n=15), HD5 estaba en o por debajo del límite de detección de (,50 ng). El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) en las mismas muestras de orina, utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón (8C8) que detecta solo el precursor proHD5, detectó niveles medibles de proHD5 en 13 de las 15 muestras infectadas analizadas. Las concentraciones urinarias de proHD5 oscilaron entre 122,78 y 490,060,03 ng de HD5/mg de Cr en orina (30,02 ng/ml a 200,5 ng/ml) cuando estaba presente (Figura 7).
Discusión
En este estudio, proporcionamos la caracterización inicial de HD5 en el ser humanoriñón, uréter y vejiga. Se ha demostrado que HD5 es un AMP importante que previene la infección invasiva en el intestino y se regula al alza en el tracto genital durante la infección [11,18,19,20,21]. Se ha demostrado que los AMP derivados del epitelio, como HD5, son importantes para mantener la esterilidad en el tracto urinario [8,22,23,24]. Las deficiencias en estas defensas mucosas innatas pueden provocar una infección aguda y/o crónica [25,26].
Nuestros resultados cuantitativos de PCR en tiempo real demuestran que DEFA5 se expresa constitutivamente en el ser humanoriñones, uréteres y vejiga. La expresión de DEFA5 aumenta desde el tracto urinario superior al tracto urinario inferior, siguiendo el flujo del chorro urinario y la creciente cercanía al punto de invasión de la microbiota. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que cuantifica la expresión de DEFA5 en el riñón y la vejiga humanos. Recientemente, Townes et al demostraron que el uréter distal normal puede expresar DEFA5 [14]. Nuestros resultados también sugieren que DEFA5 se expresa constitutivamente en el uréter distal. Aunque la expresión de DEFA5 en el tracto urinario es casi 100-veces menor que la que se encuentra en los tejidos gastrointestinales, la expresión uroepitelial basal de DEFA5 es comparable a la expresión de los amplificadores del tracto urinario descritos anteriormente como catelicidina, hBD-1, hBD -2 y ribonucleasa 7[6,8,22,24,27].
En contraste con el tracto gastrointestinal maduro donde DEFA5 se expresa en niveles altos tanto en estados de salud como en infección/inflamación, nuestros datos cuantitativos de PCR en tiempo real demuestran que la expresión de DEFA5 en elriñónse regula significativamente con la infección [27,28,29]. Este patrón de expresión inducible es análogo a la expresión de DEFA5 en el aparato reproductor femenino, donde la expresión de DEFA5 aumenta con la salpingitis [30]. En el tracto urinario, Townes et al han mostrado una tendencia hacia una mayor expresión ureteral de DEFA5 en pacientes con ITU que se han sometido a una derivación urinaria por conducto ileal [14]
Nuestro análisis de inmunotransferencia complementa los datos de PCR en tiempo real al demostrar que la producción de péptido HD5 aumenta con la pielonefritis. Este patrón inducible de producción de HD5 es similar al observado en algunos miembros de la familia de las beta-defensinas. hBD2 muestra un patrón inducible de producción con infección del tracto urinario y/o pielonefritis crónica [8,31,32]. Se ha demostrado que la producción del péptido HD5 aumenta en el tracto genital femenino superior y en la uretra masculina con inflamación [11,30].
Usando inmunotinción, demostramos que HD5 se produce uniformemente en todo el urotelio del uréter y la vejiga. Debido a que la gran mayoría de las infecciones urinarias se deben a la flora fecal que asciende a la vejiga, estos resultados sugieren que la expresión de HD5 está presente en lugares donde la exposición microbiana ocurre con mayor frecuencia [33]. Por lo tanto, HD5 está idealmente posicionado para prevenir una infección microbiana ascendente. En elriñón, HD5 se produce principalmente en la nefrona distal y el túbulo colector. Estos hallazgos sugieren que HD5 se produce en lugares donde se colocará para tener una actividad antimicrobiana óptima. Estudios previos han demostrado que las propiedades antimicrobianas de las defensinas dependen de la concentración de sal, con concentraciones más altas de sal que disminuyen la actividad antimicrobiana [23,34,35]. Especulamos que las bajas concentraciones de sal de la nefrona distal y los túbulos colectores proporcionan un entorno favorable para la actividad antimicrobiana HD5.
Los análisis de inmunotransferencia y ELISA también demuestran que HD5 se secreta en la orina en niveles bajos. Dado el tamaño (8,1 kDa y 3,7 kDa) y la carga positiva de la proHD5 y la HD5 completamente procesada, es posible que parte del péptido HD5 urinario se origine, al menos en parte, a partir del filtrado de plasma. Sin embargo, hay poca evidencia que sugiera que HD5 persiste en el plasma [27]. Además, para aparecer en la orina, HD5 necesitaría escapar de los mecanismos eficientes de absorción de péptidos en el túbulo proximal [6,36]. Finalmente, las muestras de orina utilizadas se sometieron a centrifugación antes de realizar los ensayos, eliminando las fuentes celulares de HD5.
En las concentraciones detectadas, es poco probable que el HD5 urinario sea directamente antimicrobiano contra los microorganismos uropatógenos, ya que el HD5 completamente procesado tiene una concentración inhibitoria mínima (MIC) entre 6 y 10 mg/mL contra las bacterias uropatógenas gramnegativas comunes [15]. Sin embargo, es probable que las concentraciones en la superficie de la mucosa sean más altas. Además, el análisis de inmunotransferencia demuestra que las concentraciones de HD5 son significativamente mayores en elriñón. Estos resultados sugieren que HD5 está involucrado en la defensa de la mucosa del tracto urinario. Se observa un patrón análogo con hBD1, donde las concentraciones urinarias de hBD1 son insuficientes para exhibir actividad antimicrobiana pero se detectan concentraciones de péptido más altas cerca de los túbulos renales [6,31].
Debido a que IHC demuestra que proHD5 es una forma importante de HD5 en elriñóny debido a que tanto la HD5 madura como la proHD5 se detectan en la orina, especulamos que la HD5 se secreta principalmente como una molécula precursora y luego se somete a un procesamiento proteolítico para generar formas maduras, similares a los tractos genitourinario y gastrointestinal [11,30,37]. En el intestino delgado, las células de Paneth producen tripsina, que escinde el propéptido HD5 para que el péptido completamente procesado sea la forma predominante en la luz intestinal [37]. En la uretra masculina, el procesamiento clave y las enzimas activadoras de HD5 son las proteasas de neutrófilos aportadas por los neutrófilos reclutados en el sitio de la infección [11]. Quedan por determinar las contribuciones del tripsinógeno epitelial, la tripsina urinaria y/o las proteasas de neutrófilos en el procesamiento de HD5 en el tracto urinario durante la infección. Además, los efectos de los cambios en el entorno urinario sobre la función HD5 (alteraciones en la osmolaridad, el pH y las concentraciones catiónicas) también quedan por determinar.
En conclusión, este es el primer estudio que identifica y cuantifica la expresión y producción de HD5 en el tracto urinario. Nuestros resultados sugieren que HD5 es un AMP derivado del epitelio que puede desempeñar un papel importante en la inmunidad innata del uroepitelio humano al prevenir la translocación de patógenos invasores a la circulación. La elucidación de los factores que regulan la producción de HD5 puede brindar una visión novedosa de la patogenia de las infecciones urinarias en pacientes con riesgo de infecciones urinarias y pacientes con infecciones crónicas.
Métodos
Aprobación del estudio
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes que participaron en este estudio. Para los sujetos menores de 18 años, se obtuvo el consentimiento por escrito de los padres/tutores. La Junta de Revisión Institucional del NationwideChildren's Hospital (NCH) aprobó este estudio junto con el proceso de consentimiento y los documentos (IRB07-00383).
Muestras de orina y tejidos humanos
Se obtuvo tejido de vejiga y uréter distal no infectado (n= 4) de niños sometidos a reimplantación ureteral por razones distintas a la infección recurrente. no infectadoriñónlas muestras (n=6) se obtuvieron de pacientes sometidos a nefrectomía por tumores renales. Las muestras de tejido estaban libres de signos macroscópicos de enfermedad o inflamación.Riñóntejido de pacientes con pielonefritis crónica fue proporcionado por la Red Cooperativa de Tejidos Humanos (n=6) [38]. Dos patólogos independientes confirmaron el diagnóstico histopatológico de pielonefritis. Las muestras de tejido se congelaron instantáneamente o se conservaron como secciones incrustadas en parafina fijadas con formalina neutra. Se disecaron secciones de tejido renal no infectado en corteza, médula o pelvis renal antes del almacenamiento (n=4).
Se obtuvieron muestras de orina no infectadas e infectadas de niños que acudieron al departamento de emergencias del NCH oa la clínica de nefrología. El diagnóstico de una ITU se realizó mediante un urocultivo positivo de acuerdo con las Directrices de la Academia Estadounidense de Pediatría [39]. Todas las muestras de orina infectadas tenían 0,106 CFU/ml de E.coli. Los valores de pH urinario oscilaron entre 5,5 y 8,5 (media de orina 6,9). No se midió la composición iónica de la orina. Las muestras de orina se centrifugaron para eliminar el sedimento de orina y se añadió un cóctel de inhibidores de proteasa (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU.).
Aislamiento de ácido ribonucleico y transcripción inversa
El ARN total se aisló de tejido congelado utilizando el sistema de aislamiento de ARN PromegaTotal (Promega, Madison, WI, EE. UU.). Para la síntesis de ADNc, 4–8 mg de ARN total se transcribieron inversamente con transcriptasa inversa Superscript III utilizando un cebador oligo-(dT)12–18 de acuerdo con el protocolo del proveedor (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.).
Clonación de plásmidos específicos de genes para curvas estándar
El ADNc que codifica DEFA5 y GAPDH se clonó en un vector de plásmido 4-Topo (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Los plásmidos fueron secuenciados para confirmar que la correcta
Se obtuvieron construcciones. Se cuantificaron diluciones en serie de plásmidos específicos de genes (mediante absorbancia espectrofotométrica a 260 y electroforesis en gel de agarosa teñida con bromuro de etidio) y se usaron en PCR en tiempo real para generar curvas estándar para cada reacción.
PCR cuantitativa en tiempo real
La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó usando ADNc monocatenario de humanosriñón, uréter y tejido de la vejiga con pares de cebadores de oligonucleótidos específicos usando el sistema de PCR en tiempo real 7500 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE. UU.). : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 y cebador inverso DEFA5 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).
Brevemente, el ADNc correspondiente a 10 ng de ARN sirvió como modelo en una reacción de 25 ml que contenía 2,0 mM de cada cebador y 16 Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green mix. Las condiciones de la PCR fueron: desnaturalización inicial a 95uC durante 10 minutos, seguida de 40 ciclos, cada uno de los cuales consistía en desnaturalización a 94uC durante 30 segundos, hibridación a 64uC durante 30 segundos y extensión a 72uC durante 30 segundos. La emisión de fluorescencia de ciclo a ciclo se controló a 530 nm y se analizó utilizando 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems). Se incluyeron estándares de plásmidos específicos de genes con cada conjunto de reacciones. Como control positivo, se incluyó ARN de íleon terminal en cada conjunto de reacciones y los resultados se compararon con estándares publicados previamente [27].
Para confirmar la amplificación por PCR del producto previsto, se analizó una muestra representativa mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,5 por ciento. Los productos se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio y se compararon con estándares de tamaño de ADN para confirmar el tamaño del producto anticipado (no mostrado). Además, se determinó una curva de perfil de temperatura de fusión de cada reacción de PCR al final de cada reacción.
Anticuerpos HD5
El propéptido HD5 (AA20-94) y las formas parcialmente procesadas (AA36-94 y 56–94) se identificaron utilizando un anticuerpo anti-HD5 monoclonal de ratón (8C8) comercialmente disponible (Abcam). El propéptido HD5 y el péptido maduro (AA63-94) se identificó usando antisuero policlonal de conejo descrito previamente [13,40].
inmunotransferencia
secciones del mismoriñónlas muestras utilizadas para el análisis PCR cuantitativo en tiempo real (3–6 mg de peso húmedo) se pulverizaron con un mortero en nitrógeno líquido y se disolvieron en tampón RIPA con inhibidores de proteasa. Las proteínas urinarias se extrajeron de las muestras de orina utilizando el microkit de concentración de proteínas en orina ProteospinTM (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Canadá). Las concentraciones de proteínas en riñón y orina se cuantificaron usando un ensayo de Bradford modificado y se confirmaron usando una lectura de una DO280 nm. Se cargaron concentraciones iguales de tejido renal o proteína urinaria en geles con gradiente de dodecilsulfato de sodio al 18 por ciento y se sometieron a electroforesis. Para asegurar la misma carga de proteínas, se realizó una tinción de plata.
Después de la separación electroforética, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Después de la fijación con 0.05 por ciento de glutaraldehído en TBS, las membranas se bloquearon en leche descremada al 5 por ciento durante 30 a 60 minutos y se incubaron en una dilución 1:1,000 de antisuero policlonal HD5 de conejo durante la noche. . Después del lavado, se aplicó el anticuerpo secundario, una IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante anti-conejo diluida 1:10,000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.), durante 1 hora a temperatura ambiente. inmunotransferencias deriñónlos tejidos también se sondaron con anticuerpo anti-GAPDH (Sigma Aldrich) durante dos horas a temperatura ambiente y luego se incubaron con el anticuerpo secundario descrito anteriormente. Las proteínas se visualizaron usando un sistema de detección ECL y una película de quimioluminiscencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BioExpress, Kaysville, UT, EE. UU.).
HD5 se cuantificó comparando las intensidades de banda resultantes con una dilución en serie de proteína proHD5 estándar recombinante (Peptides International, Louisville, KY, EE. UU.).RiñónLas concentraciones de HD5 se estandarizaron al peso del tejido húmedo. Las concentraciones de HD 5 en orina se dividieron por la creatinina en orina para establecer proporciones estandarizadas de HD en orina5-a creatinina (mg/mg) para tener en cuenta la dilución de la orina. Las concentraciones de creatinina en orina se determinaron utilizando el ensayo de microplaca de creatinina de Oxford Biomedical Research (Rochester Hills, Michigan, EE. UU.).
inmunohistoquímica
Después de la desparafinización, rehidratación y recuperación de antígenos, se realizó un bloqueo de biotina y un bloqueo de proteína libre de suero (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, EE. UU.). Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 uC con anticuerpo monoclonal de ratón HD5(8C8) (1:2{{10}}0; Abcam) o antisuero policlonal de conejo (1:500) seguido de anticuerpo biotinilado anti-polivalente adulterado. Estreptavidina/HRP (Laboratorios ScyTek). Las secciones se revelaron utilizando tetracloruro de diaminobencidina al 0,1 por ciento con peróxido de hidrógeno al 0,02 por ciento y se contrastaron con hematoxilina. Las secciones de controles negativos se incubaron con suero no inmune en lugar de anticuerpo HD5.
inmunofluorescencia
Se realizó inmunofluorescencia doblemente marcada para ayudar a localizar la expresión de HD5 en elriñón. El conducto colector se marcó dos veces para las células principales con anticuerpo policlonal de cabra anti-acuaporina humana-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.) [41]. El asa de Henle se marcó doblemente con anticuerpo policlonal de ratón anti-uromodulina humana (Sigma-Aldrich) y el túbulo proximal se marcó doblemente con acuaporina policlonal antihumana de cabra-1 (Santa Cruz) [41,42]. Anti-cabra policlonal de burro con rodamina (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EE. UU.), anti-ratón de cabra con rodamina (JacksonImmunoResearch Laboratories) y anti-conejo policlonal de burro con FITC (Santa Cruz) sirvieron como anticuerpos secundarios.
Todas las secciones se prepararon como se describe anteriormente. Se incubaron con una mezcla de antisueros de ratón contra HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulina (1:500), AQP-1 (1:400) en la habitación temperatura durante 90 minutos. El anticuerpo secundario se aplicó durante 90 minutos a temperatura ambiente y las secciones se montaron utilizando medios de montaje con DAPI. Se utilizó suero no inmune como control negativo. Los portaobjetos se examinaron con un microscopio Leica DM4000B y se fotografiaron digitalmente con la cámara/software Spot RT (Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, EE. UU.).
ELISA
Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) anticuerpo monoclonal de ratón durante 2 horas a temperatura ambiente, se añadió estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (Biolegend, San Diego CA, EE. UU.) durante 30 minutos. Después de la incubación con solución de sustrato TMB durante 15 minutos (Kem-En-Tec Diagnostics), la reacción se terminó con solución STOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.) y se leyó a una longitud de onda de 450 nm. Las concentraciones de HD5 del ensayo ELISA se dividieron por la creatinina en orina para establecer proporciones estandarizadas de HD5-en orina a creatinina (mg/mg) para tener en cuenta la dilución de la orina como se describe anteriormente.
Referencias
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