Las células TH17 humanas activan los poros de Gasdermin E para liberar IL-1 en la activación del inflamasoma NLRP3

Se ha demostrado que las respuestas inmunes innatas pueden adoptar propiedades adaptativas como la memoria. Se desconoce si las células T utilizan vías de señalización inmune innata para diversificar su repertorio de funciones efectoras. Gasdermin E (GSDME) es una molécula formadora de poros de membrana que se ha demostrado que ejecuta la muerte celular piroptótica y, por lo tanto, sirve como un posible punto de control del cáncer. En el presente estudio, mostramos que las células T humanas expresan GSDME y, sorprendentemente, que esta expresión está asociada con una viabilidad duradera y reutilizada para la liberación de la interleucina alarmina (IL)-1. Esta propiedad estaba restringida a un subconjunto de células T auxiliares humanas tipo 17 con especificidad por Candida albicans y regulada por un inflamasoma NLRP3 intrínseco de células T, y su participación en una cascada proteolítica de caspasas-8, caspasas{{6) sucesivas. }}, y escisión de GSDME después de la estimulación del receptor de células T y la maduración de calpaína con licencia de calcio de la forma pro-IL-1. Nuestros resultados indican que la formación de poros de GSDME en las células T es un mecanismo de liberación de citoquinas no convencional. Este hallazgo diversifica nuestra comprensión del repertorio funcional y el equipo mecánico de las células T y tiene implicaciones para la inmunidad antifúngica.

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Las células T colaboradoras (células TH) son importantes activadores de respuestas efectoras específicas de antígeno a través de su secreción de distintas citoquinas. Las células T auxiliares tipo 17 (células TH17), en particular, son reconocidas por sus funciones antifúngicas a través de la secreción de su citocina característica IL-17A, que está regulada por el factor de transcripción RAR-receptor huérfano relacionado (ROR). t1. También son los principales culpables de la patogénesis de enfermedades autoinmunes2. TH1Anteriormente se había reconocido que 7 células mostraban heterogeneidad funcional3. Las funciones proinflamatorias o antiinflamatorias se ejercen mediante la coexpresión diferencial de IL-17 con interferón (IFN) o IL-10, respectivamente4–7. En general, esto ha dado forma al concepto de dualismo de las células TH17 y ha estimulado la investigación sobre las señales y objetivos moleculares que controlan la dicotomía entre los dos resultados funcionales de las células TH17 para aplicaciones terapéuticas3,4,8,9. Sin embargo, sigue siendo difícil lograr una comprensión profunda de la identidad y la base mecanicista de los destinos patógenos versus inmunorreguladores de las células TH17. Mecanismos efectores adicionales, aún por descubrir, que van más allá de la producción de IL-17 también podrían operar en células TH17 con especificidades objetivo antifúngicas o antibacterianas. Las citocinas IL-1, de las cuales IL-1 e IL-1 representan los miembros más destacados, ejercen profundos efectos inflamatorios. Al liberarse de las células presentadoras de antígenos (APC), no solo inducen respuestas inflamatorias innatas rápidas sino que también organizan la inmunidad adaptativa al promover la polarización de las células TH17 y la patogenicidad de las células T al unirse a su receptor IL-1R1 compartido4,10,11 . El cebado de células TH17 independientes de IL-1-, que también se ha descrito previamente, da como resultado la producción de células TH17 antiinflamatorias4. Por lo tanto, la IL-1 de fuentes celulares innatas sirve como un factor de cambio para la dicotomía entre el destino de las células TH17 proinflamatorias y antiinflamatorias. A diferencia de la mayoría de las otras citocinas, las citocinas IL-1 carecen de un péptido señal y, por lo tanto, se secretan mediante un mecanismo no convencional independiente del retículo endoplásmico (RE)-Golgi.

Pro-IL-1 requiere escisión enzimática antes de su liberación al espacio extracelular y la participación de su receptor. El inflamasoma NLRP3 es un complejo proteico citosólico multimérico que ensambla infección microbiana y daño celular y recluta caspasa-1 para la posterior escisión de pro-IL-1. La salida de IL-1 también requiere la escisión del gas dermina D (GSDMD) mediada por caspasa-1- y la formación de poros en un proceso llamado piroptosis, una forma inflamatoria de muerte celular13,14. Por otro lado, se cree que IL-1 se procesa independientemente del inflamasoma NLRP3 a través de puntos de control regulatorios que aún no se conocen bien10. A pesar de estas vías completamente distintas para la maduración y liberación de IL-1 e IL-1, ambas citoquinas son producidas conjuntamente por células del sistema inmunológico innato, lo que apunta a la existencia de vías aún por identificar. rutas correguladoras. En el presente estudio, mostramos que un subconjunto de células TH17 humanas activa una cascada de señalización dependiente de NLRP3-para inducir la formación de poros de membrana mediante GSDME, que sirve para la liberación autocrina de IL proinflamatoria-1. Este hallazgo revela un modo no convencional de secreción de citoquinas por parte de las células T humanas y, por lo tanto, diversifica el repertorio funcional y mecanicista de las células T.

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Resultados

La producción de IL-1 es una característica de las células TH humanas

Para investigar la heterogeneidad del subconjunto de células TH17 humanas y revelar funciones distintas y su control molecular, realizamos una secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) de células TH17 humanas activadas, que se habían aislado ex vivo de sangre periférica según su expresión única de marcadores de superficie del receptor de quimiocinas15. El análisis exploratorio mediante aproximación y proyección múltiple uniforme (UMAP) y agrupamiento de Leiden de todas las células TH17 identificó seis grupos individuales (Fig. 1a). Una población distinta y rara (6%) de células TH17 que expresan IL1A se enriqueció selectivamente en el grupo 1 (Fig. 1a, b). La comparación de todos los genes en el grupo 1 con todos los demás grupos reveló que IL1A estaba significativamente regulada positivamente (Tabla complementaria 1). Esto fue inesperado dado que no se considera que la IL-1 pertenezca al repertorio canónico de citocinas efectoras de las células T, sino que representa una señal de peligro innata16. Sin embargo, IL1A no se encontraba entre los principales genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en el grupo 1, lo que requirió una estrategia de búsqueda más profunda para desenmascarar su importante regulación positiva en una subpoblación de células TH17 (Figura 1 complementaria). A nivel de proteína, los clones de células TH17 también se segregaron en distintos clones de células IL-1 + e IL-1, lo que respalda la heterogeneidad de la expresión de la proteína IL-1 a nivel unicelular dentro de la población de células TH17 (Fig. 1c). Para comparar la expresión de IL1A por las células TH17 con la de otros tipos de células inmunitarias, en particular los productores auténticos de IL-1 previamente informados, interrogamos múltiples conjuntos de datos públicos de scRNA-seq de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). Sorprendentemente, esto no reveló ninguna expresión de IL1A en varios tipos de células inmunes de PBMC en reposo, incluidas las células T, las células B, las células asesinas naturales (NK), las células NKT, los monocitos y las células dendríticas (Figuras complementarias 2a, b). Incluso los monocitos no mostraron ninguna expresión de IL1A a nivel unicelular, a menos que se aplicara a estas células un estímulo inductor de IL1A específico, específicamente lipopolisacárido (LPS) (Figura complementaria 2c, d), que desenmascaró su capacidad de producción de IL1A. y la asociación de la expresión de IL1A con una respuesta inmune innata inflamatoria en curso (Figura complementaria 2e). Es interesante que una comparación transcriptómica unicelular de los DEG entre células IL1A+ e IL1A– de células TH17 versus monocitos demostró casi ninguna superposición en la coexpresión de genes (IL1A y CCL3), lo que sugiere en gran medida un modo diferente de regulación de IL1A en T. células versus monocitos (Fig. 1d). En conjunto, estos resultados revelan la existencia de una subpoblación distinta de células que expresan IL-1 - dentro del subconjunto de células TH17.

El subconjunto de células TH17 productoras de IL-1 -es proinflamatorio

Para explorar la relevancia fisiológica de la expresión de IL1A en células TH17 humanas, realizamos una comparación transcriptómica imparcial de células IL1A + e IL1A-TH17 después de scRNA-seq. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) para genes coexpresados ​​con IL1A en células TH17, así como el análisis de enriquecimiento utilizando DEG, revelaron una sorprendente asociación de IL1A con la activación y proliferación de células T después de un interrogatorio imparcial de todos los términos de ontología genética (GO) disponibles ( Fig. 2a y Fig. complementaria 3). Este hallazgo cuestionó el papel previamente asignado a la IL-1 en la senescencia y muerte celular en el nuevo contexto de las células T17. El análisis de enriquecimiento también reveló una fuerte sobrerrepresentación de varios términos GO relacionados con la "inflamación", lo que sugiere que la expresión de IL1A por las células TH17 contribuyó a una identidad de células T patógenas con funciones en enfermedades inflamatorias (Fig. 2a). Esta idea fue respaldada por la regulación positiva de genes anotados con el término GO 'respuesta celular a la interleucina-1', considerando el efecto de interruptor proinflamatorio previamente informado de la IL-1 sobre la funcionalidad general de las células TH174 y el efecto supresor de IL-1 autocrino en la expresión IL-10 (Datos ampliados, figuras 1a a c). Una comparación directa de las células IL1A+ versus IL1A-TH17 en todos los grupos demostró que las células IL1A+ TH17 mostraban firmas proinflamatorias significativamente mejoradas, pero antiinflamatorias reducidas (Fig. 2b) 7. Además, el grupo 1, que se enriqueció con células IL1A+ TH17, fue significativamente más proinflamatorio y menos antiinflamatorio que los otros cinco grupos, como lo indica GSEA (Fig. 2b). Es interesante que una comparación transcriptómica masiva de subconjuntos de células TH17 proinflamatorias versus antiinflamatorias reveló que IL1A incluso se encuentra entre los principales genes regulados positivamente en el subconjunto de células TH17 proinflamatorias (Fig. 2c, d y Datos ampliados Fig. 2). La IL10, en cambio, estaba altamente regulada a la baja, como se esperaba según informes anteriores4,7. Esta correlación recíproca de la expresión de IL-1 e IL-10 por las células TH17 también se observó a nivel de proteína mediante citometría de flujo (Fig. 2e). El análisis de enriquecimiento con DEG demostró una representación excesiva de las vías KEGG (Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto) para enfermedades autoinmunes como la "artritis reumatoide" y la "enfermedad inflamatoria intestinal" (Fig. 2f), lo que respalda la naturaleza proinflamatoria del TH17 que expresa IL1A. subconjunto de células. De hecho, los pacientes que padecen artritis idiopática juvenil (AIJ), una forma altamente inflamatoria de artritis reumatoide en niños cuya patogénesis se ha relacionado previamente con IL-1 e IL-1 18 innatas,19, revelaron significativa y fuertemente expresión elevada de IL-1 por células IL-17+ TH en comparación con células IL-17+ TH de sangre de control sana (Fig. 2g). En cambio, no se observó ningún aumento de IFN- en las células IL-17+ TH de la sangre de pacientes con AIJ en comparación con la sangre de un donante de control, a pesar de la asociación previamente informada de IFN- con la patogenicidad de las células TH17 (Fig. 2g, panel derecho). 4. Además, el análisis del líquido sinovial compatible con sangre demostró frecuencias muy altas de células IL-1 + TH, lo que sugiere que las células T, más allá de las células innatas, también podrían representar una fuente celular relevante de IL{{74} asociada a la enfermedad. } en el sitio de la inflamación.

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La expresión IL-1 está regulada por un programa TH17

Para investigar si la expresión de IL-1 es una propiedad general de las células T, enriquecimos subconjuntos de células TH individuales de PBMC de acuerdo con su expresión diferencial de receptores de quimiocinas (Datos ampliados, figura 3) y comparamos su IL-1 secreción. IL-1 fue producida específicamente por el subconjunto de células TH17, pero no por el subconjunto de células TH1, el subconjunto de células TH2 o las células T reguladoras (células Treg) (Fig. 3a-c). Sorprendentemente, su nivel de secreción tras la estimulación con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 coincidió con el de los monocitos humanos estimulados con LPS y nigericina, lo que indica que las células TH17 humanas, a pesar de su identidad inmune adaptativa, sirven como una fuente importante de la señal de peligro IL. -1 (Figura 3a). La expresión de la proteína IL-1 intracelular estuvo ausente en las células TH en reposo recién aisladas, pero fue inducible por la activación del receptor de células T (TCR), con un enriquecimiento significativo en las células TH17 en comparación con las células TH enriquecidas con células TH1, TH2 y Treg (Fig. 3b ,C). Estos hallazgos parecen ser específicos del sistema inmunológico humano porque informes anteriores excluyeron la producción de IL-1 por parte de las células T de ratón16. La asociación única de IL-1 con el subconjunto de células TH17 nos impulsó a analizar mecánicamente la regulación de esta citoquina. Es interesante que la expresión de IL-1 se redujo con la inhibición específica de ROR-t, el factor de transcripción maestro de las células TH17 (Fig. 3d, e) 1. Estos datos están en línea con la presencia de supuestos sitios de unión para ROR- t y ROR- en las regiones promotoras y potenciadoras de IL1A (Datos ampliados, Fig. 4a, b). El destino de un subconjunto particular de células TH está determinado por el microambiente de citocinas polarizadoras distintas durante la estimulación de células T vírgenes. Observamos la expresión y secreción intracelular más alta de IL -1 en el cebado de células T vírgenes en condiciones de polarización de células TH17 (IL -1 y factor de crecimiento transformante (TGF) -) (Fig. 3f, g). Sin embargo, los tratamientos únicos con IL-1 o TGF- solos no condujeron a una expresión significativa de IL-1 en células T vírgenes, lo que subraya el efecto sinérgico de las citoquinas combinatorias de cebado de células TH17 en la inducción de novo de IL-1 (Figura complementaria 4). Por el contrario, las condiciones de cebado de células TH1 (IL-12) y TH2 (IL-4) no alteraron significativamente la secreción de IL-1 en comparación con la secreción bajo estimulación en ausencia de citoquinas polarizantes. En conjunto, estos hallazgos demuestran que las células T vírgenes adquieren la capacidad de producir IL-1 a través de citocinas polarizadoras de células TH17. Las células TH de memoria también mostraron una regulación positiva adicional significativa de su citocina efectora IL-1 en microambientes IL-1 y TGF (Fig. 3h).

Figura 1|Un subconjunto distinto de células TH17 humanas puede expresar IL-1.

La identidad de los subconjuntos de células TH también se caracteriza por distintas propiedades de migración, que están asociadas con la expresión diferencial de los receptores de quimiocinas20. Observamos que la expresión de IL-1 se enriqueció en las células T CCR6+ pero no en las células T CCR6– y se redujo en las células T CXCR3– en comparación con las células T CXCR3+, aunque no hubo diferencias en Expresión de IL-1 entre células CCR4+ y CCR4– (Fig. 3i). Estos datos demuestran que las células productoras de IL-1 -muestran el patrón de migración previamente asignado a las células productoras de IL-17-15. En conjunto, estos datos muestran consistentemente que IL-1 es una función única de las células TH17 humanas.

Figura 2|Las células TH17 productoras de IL-1 son proinflamatorias

Figura 3|La producción de IL-1 por las células T está restringida al destino de las células TH17

La calpaína es un requisito previo para la secreción de IL-1 por las células TH17

Para explorar el mecanismo de secreción de IL-1, tratamos las células TH17 con el inhibidor de la exportación de proteínas brefeldina A (BFA) y descubrimos que la secreción de IL-1 no se vio afectada, a diferencia de la de las citocinas convencionales, como como IL-17A (datos ampliados, figuras 5a-c). Esto respalda la existencia de una vía no convencional independiente del RE-Golgi para la secreción de IL-1 por las células T y está en línea con informes previos para tipos de células innatas21,22. Una propiedad única que ha sido previamente asignada a la IL-1 es su localización simultánea en el citoplasma y la membrana plasmática23. Sin embargo, encontramos que las células TH17, a diferencia de los monocitos, no mostraban IL -1 unida a la membrana (Datos ampliados, figura 5d). Aunque se requiere la escisión de pro-IL-1 para generar IL extracelular bioactiva-1, se sabe que IL-1 se libera pasivamente tras la muerte celular y ejerce su potencial bioactivo después de unirse a IL{ {19}}RI en su forma escindida o no escindida24. Para determinar si la pro-IL-1 se somete a procesamiento intracelular para su liberación controlada por las células T humanas, evaluamos las formas maduras y completas de IL-1 en el sobrenadante de las células TH17 activadas. Para excluir cualquier monocito contaminante como fuente potencial de IL-1 secretada, generamos clones de células TH17 durante un período de 2 semanas y los reestimulamos con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante otros 5 días antes de la inmunotransferencia. En los seis clones de células TH17 probados, encontramos un enriquecimiento preferencial de la forma escindida de IL-1 en los sobrenadantes del cultivo (Fig. 4a). Los lisados ​​​​de células TH17, por el contrario, mostraron un enriquecimiento preferencial de la forma pro-IL -1 no escindida, como se esperaba (Figura complementaria 5a). Estos resultados excluyen la liberación pasiva de pro-IL-1 durante la necrosis celular como modalidad de salida predeterminada de IL-1 en las células T y, en cambio, sugieren que las células TH17 humanas deben poseer maquinaria molecular para pro-IL{{ 46}} escisión para permitir la liberación extracelular controlada de esta potente molécula bioactiva por parte de células T viables, en contraste con las células innatas (Figura complementaria 5b). Sin embargo, esto no excluye una contribución adicional de la necrosis de las células T a la liberación de la proforma bioactiva de IL-1 (Figura complementaria 5a). El procesamiento de Pro-IL-1 en distintos sitios de escisión puede ser catalizado por varias proteasas17,25,26. La calpaína es una cisteína proteasa dependiente de calcio que puede dar lugar al fragmento maduro de IL-1 p1726, que identificamos en este documento. Detectamos actividad de calpaína en células TH17. Aumentó tras la activación con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 (Fig. 4b). La secreción de IL -1 por las células TH17 dependía de la actividad intrínseca de la calpaína de las células T porque la inhibición farmacológica de la calpaína redujo la secreción de IL -1 por las células TH17 activadas en el espacio extracelular de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4c). . En consecuencia, la inhibición de la calpaína resultó en una acumulación intracelular de pro-IL-1 (Fig. 4d). Para corroborar la dependencia de la secreción de IL-1 de la calpaína, también eliminamos genéticamente la calpaína en células TH17 humanas utilizando repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas (CRISPR) –Cas9. Esto reveló un papel para CAPN2, pero no para CAPN1, en la secreción de IL-1 por las células TH17 humanas (Fig. 4e). Por el contrario, la secreción de IL -1 inducida por LPS-/nigericina por parte de los monocitos no dependía de la calpaína (Fig. 4f). Estos datos fueron consistentes con la expresión preferencial de CAPN2 pero no de CAPN1 por subconjuntos de células T humanas en contraste con las células dendríticas, que mostraron un patrón de expresión del gen de calpaína invertido (Figura complementaria 6). La secreción de IL-1 en las células TH17 aumentó con la acumulación intracelular de calcio y la inhibición de la sarco-/ER Ca2+ ATPasa con tapsigargina (Fig. 4g) y disminuyó con la quelación del calcio extracelular con (etilenbis (oxinitruro) )tetraacetato (EGTA) (Fig. 4h), consistente con la función dependiente de calcio de la calpaína y la secreción de IL-1 dependiente de TCR26. En conjunto, estos datos demostraron que la actividad proteolítica de la proteasa calpaína dependiente de calcio es un requisito previo para la secreción de IL-1 no convencional por parte de las células TH17 humanas activadas por TCR.

La secreción de IL-1 por las células TH17 está regulada por la activación del inflamasoma NLRP3

A pesar del papel esencial de la calpaína en la maduración pro-IL-1, el mecanismo que conduce a la salida extracelular de la IL-1 escindida seguía siendo desconocido y, por lo tanto, se abordó a continuación. La liberación extracelular de IL-1 por parte de las células mieloides se ha asociado previamente con la activación del inflamasoma NLRP3, la actividad no enzimática de la caspasa-1 y la liberación de IL-1 16,27. Probamos si las células TH17 humanas poseían la estructura molecular del inflamasoma NLRP3 y encontramos la expresión proteica de NLRP3 y la molécula adaptadora, una proteína similar a una mota asociada a la apoptosis que contiene una CARD (ASC), en células TH17 humanas (Datos ampliados, Fig. 6a, b). Observamos la activación continua del inflamasoma en células TH17 activadas por TCR mediante la identificación de motas de ASC utilizando la tecnología ImageStream (Fig. 5a, b) 28,29. Sorprendentemente, el aumento de las frecuencias de las motas de ASC se limitó únicamente al subconjunto de células TH17 (Fig. 5b, izquierda). Las células TH17 incluso se aproximaron a la formación de motas ASC de los macrófagos estimulados por LPS y ATP (Fig. 5b, derecha). Los subconjuntos de células TH1 y TH2, por el contrario, mostraron niveles de fondo de motas ASC (Fig. 5b, izquierda). Además, la formación de motas ASC y motas NLRP3- se anuló por completo en presencia del inhibidor específico del inflamasoma NLRP3 MCC950, lo que corrobora la existencia de una activación continua del inflamasoma NLRP3 en las células TH17 (Fig. 5b, izquierda y datos ampliados en la Fig. 6c). La participación selectiva del inflamasoma NLRP3 por parte de las células TH17 fue respaldada aún más por la fuerte inducción de transcripciones de NLRP3 en la estimulación de células T en presencia de las citoquinas IL -1 y TGF- polarizadoras de células TH17 (Fig. 5c). Es importante destacar que la secreción de IL-1 por las células TH17 se redujo significativamente mediante la inhibición específica del inflamasoma NLRP3 con MCC950 (Fig. 5d), lo que demuestra el papel crítico del inflamasoma NLRP3 en la secreción de IL-1 por células TH17 humanas. La caspasa-1 es la proteína efectora canónica en el complejo inflamasómico NLRP330. Observamos la expresión de procaspasa -1 en células TH17 humanas activadas (Fig. 5e). Sin embargo, a diferencia de los hallazgos en monocitos estimulados con LPS y nigericina, no se detectó caspasa -1 escindida en lisados ​​de células TH17 humanas (Fig. 5e). Esta observación fue corroborada por la ausencia de tinción con caspasa-1 FLICA en células TH17 que fueron estimuladas en presencia o ausencia de estímulos de citoquinas promotoras de IL-1 (Datos ampliados, figuras 7a-e). Además, excluimos la liberación extracelular de caspasa -1 mediante ELISA después de la estimulación de células TH17 con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 5 días (Fig. 5f). Incluso en presencia del estímulo IL-1 IL-1, la secreción de caspasa-1 no fue inducible y permaneció tan baja como la de los monocitos en reposo (Fig. 5f). La inhibición farmacológica de caspasa-1 con Ac-YVAD-CMK no redujo la secreción de IL-1 en presencia o ausencia de inducción de IL-1 por IL-1. Más bien, observamos una secreción de IL -1 ligeramente elevada en la inhibición de caspasa -1 (Figuras complementarias 7a, b). Es importante destacar que las células TH17 no mostraron ninguna alteración en la secreción de IL-1 en el agotamiento de la expresión de CASP1 diseñado por CRISPR-Cas9- (Fig. 5g). En línea con la ausencia de caspasa bioactiva-1, no observamos ninguna secreción de IL-1 por parte de las células TH17 humanas. Esto contrastó con el caso de los monocitos, que demostraron una secreción de IL-1 dependiente de caspasa tras la estimulación con LPS y ATP (datos ampliados, figura 7f). Además, ninguna IL-1 intracelular fue detectable o inducible mediante citocinas polarizadoras de IL-1 -en células TH17 o clones de células TH17 o detectable en células TH17 activadas mediante análisis de scRNA-seq (Datos ampliados Fig. 7g,h, i). Esto contrastaba con el hallazgo de los monocitos, que coexpresaban IL-1 e IL-1 a nivel unicelular, lo que concuerda con la secreción sugerida previamente y el supuesto patrón de corregulación de ambas IL-1 citocinas (datos ampliados, figura 7g)16,27. En conjunto, estos datos demuestran que las células TH17 humanas producen IL-1 independientemente de la caspasa-1 y la IL-1, a diferencia de los monocitos y presumiblemente otras células inmunes innatas, a pesar de la clara participación del inflamasoma NLRP3.

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IL-1a sale de las células TH17 a través de los poros GSDME

Las gasderminas pertenecen a una familia de moléculas efectoras formadoras de poros recientemente identificadas que permiten la liberación de mediadores inflamatorios31. Nuestro análisis del transcriptoma reveló una regulación positiva selectiva de la expresión de GSDME en el subconjunto de células TH17 estimuladas por IL -1 - proinflamatorias, pero ninguna regulación de ningún otro miembro de la familia de la gastrina (Fig. 6a). Esto fue sorprendente teniendo en cuenta que nunca antes se había informado de la expresión de GSDME en células T primarias. Por el contrario, GSDMD, que se sabe que está regulado por el inflamasoma NLRP3 y que es un objetivo de la caspasa -1 (ref. 31), no estaba regulado positivamente, lo que respalda la idea de una señalización del inflamasoma NLRP3 no canónica. Anteriormente se ha demostrado que GSDME forma poros de membrana en células inmunes innatas que pueden servir como conductos para la liberación extracelular de alarminas e iniciar la muerte celular piroptótica similar a GSDMD32. Para probar la asociación de GSDME con el subconjunto de células TH17, evaluamos si las citocinas polarizadoras de células TH17 corregulan GSDME. Sólo la combinación de TGF- con IL-1 (TH17), pero no IL-12 (TH1) o IL-4 (TH2), aumentó los niveles de transcripción de GSDME según lo evaluado mediante transcripción inversa-cuantitativa. PCR (RT-qPCR) (Fig. 6b). Esto fue respaldado por la existencia de supuestos sitios de unión para los factores de transcripción ROR y BATF (factor de transcripción de cremallera de leucina básico, similar a ATF) asociados a células TH17 en las regiones promotoras de GSDME (Datos ampliados, Fig. 8a, b) 33. La expresión de GSDMD, por el contrario, no estaba regulada por citoquinas polarizadoras de células T (Figura complementaria 8). Este resultado nos llevó a evaluar la expresión de GSDME a nivel de proteína en células TH17 humanas. La proforma GSDME fue inducible mediante la activación de TCR. La inducción de la proteína GSDME en respuesta a esta señal inmune adaptativa fue inesperada, pero está respaldada aún más por la existencia de supuestos sitios de unión de factores de transcripción que responden a la señalización de TCR, como NFAT, FOS, JUN y RELA en las regiones promotoras de GSDME (Datos extendidos, Fig. 8a). ,b). GSDME se expresó ya 24 h después de la estimulación policlonal. El GSDME formador de poros N-terminal escindido fue detectable en momentos tardíos, 3 a 4 días después de la estimulación con TCR de las células TH17 (Fig. 6c). Se indujo concomitantemente GSDMD de longitud completa en la activación de células T. Por el contrario, no se observó escisión de GSDMD, como se predijo por la ausencia de secreción de caspasa -1 e IL -1, lo que deja el papel de GSDMD en las células TH17 abierto para análisis adicionales (Fig. 6c). A continuación, nuestro objetivo fue explorar si los poros de GSDME sirven como conductos para la liberación extracelular de IL-1 en células TH17. Por lo tanto, eliminamos GSDME con tecnología CRISPR-Cas9 y monitoreamos la liberación de IL-1 en el sobrenadante a lo largo del tiempo mediante ELISA. La ausencia de GSDME, pero no de GSDMD, inhibió significativamente la liberación de IL-1 por las células TH17 (Fig. 6d). Esto demuestra claramente que la formación de poros de GSDME sirve como mecanismo para la liberación de IL-1 no convencional por parte de las células TH17 humanas.

Figura 4|La calpaína es un requisito previo para la liberación de IL-1 escindida por las células TH17 humanas

Figura 5|La activación no convencional del inflamasoma NLRP3 regula la producción de IL-1 por las células TH17 humanas

La cascada de escisión caspasa-8/3 GSDME permite la secreción de IL-1 dependiente de NLRP3-

A continuación, exploramos la posibilidad de una interferencia mecanística entre la activación del inflamasoma NLRP3 y la escisión de GSDME en células TH17 humanas. Recientemente se ha demostrado que la caspasa -3 escinde GSDME, que a su vez es un objetivo de la caspasa interactora del inflamasoma NLRP3 -8 (refs. 34,35). De hecho, se detectaron tanto procaspasa-8 como procaspasa-3 en células TH17. Descubrimos que la escisión de ambas caspasas se produjo con la estimulación de TCR y precedió a la escisión de GSDME (Fig. 6e). Por el contrario, no se detectaron productos escindidos de caspasa -8 y caspasa -3 en monocitos estimulados con nigericina y LPS (Fig. 6e). Para establecer un papel causal de estas caspasas en la escisión de GSDME y la secreción de IL-1 por las células T, bloqueamos farmacológicamente la actividad de caspasa-3 o caspasa-8 con el inhibidor Z-DEVD. -FMK o Z-IETD-FMK, respectivamente. La inhibición de la actividad de la caspasa-8 con Z-IETD-FMK anuló la escisión de la caspasa objetivo descendente-3, en línea con informes anteriores sobre otros tipos de células36. Ambos tratamientos redujeron la escisión de GSDME y al mismo tiempo anularon la secreción de IL -1 (Fig. 6f – i y Datos ampliados Fig. 9a, b). En cambio, la inhibición de caspasa-1 no afectó la caspasa-3 ni la escisión de GSDME (Figura complementaria 9). Estos datos demostraron claramente que el eje caspasa-8-caspasa-3-GSDME estaba operando en células TH17 humanas en la activación de TCR y que regulaba la secreción de IL-1 en estas células. Para finalmente establecer el vínculo entre esta cascada de escisión proteolítica y el inflamasoma NLRP3, aplicamos MCC950 a las células TH17 estimuladas, lo que, de hecho, produjo una reducción significativa en la escisión de caspasa -3 y GSDME el día 5 (Fig. 6f, g y Datos ampliados Fig. 9c). Sin embargo, una reducción en la escisión de caspasa -8 fue menos pronunciada en el mismo momento del análisis, lo que estaba en línea con su ventana de tiempo de activación anterior (Fig. 6e, f). En resumen, la inhibición dirigida de cada actor molecular individual estableció la cascada NLRP3 inflamasoma-caspasa-8-caspasa-3-GSDME como la vía proteolítica implicada en la liberación extracelular de IL bioactiva-1 por parte del ser humano. Células TH17.

Figura 6|La cascada de escisión NLRP3-casp8/3 conduce a poros GSDME para la liberación de IL-1

Las células TH17 son resistentes a la piroptosis a pesar de los poros GSDME

La formación de poros de gasdermina se ha asociado previamente con la muerte celular piroptótica en una variedad de tipos de células13,14,37. Encontramos expresión de la unidad N-GSDME formadora de poros escindida en la membrana plasmática, pero no en el citosol, lo que respalda la función de formación de poros de GSDME en las células T (Fig. 7a). Sorprendentemente, una comparación transcriptómica de células TH17 humanas en masa deficientes en GSDME y editadas con el gen CRISPR-Cas9 intactas por GSDME realizada por GSEA excluyó diferencias en diversas formas de muerte celular; sin embargo, en particular, reveló que los procesos y vías afectados en las células TH17 deficientes en GSDME estaban relacionados principalmente con genes que controlan el transporte transmembrana, en línea con los conductos formadores de poros formados por N-GSDME (Fig. 7b y Fig. 10 complementaria). . Una comparación transcriptómica unicelular de células TH17 individuales seleccionadas por la presencia versus ausencia de expresión de GSDME respaldó la viabilidad de las células TH17 que expresan GSDME mediante el enriquecimiento de su conjunto de genes para la proliferación (Fig. 7c). Finalmente validamos la resistencia de las células TH17 humanas que expresan GSDME a la piroptosis al demostrar la ausencia de cualquier diferencia en la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) entre las células TH17 editadas con el gen CRISPR-Cas9, deficientes en GSDME y intactas con GSDME en estimulación con TCR (Fig. .7d). Luego comparamos las células IL-1 + e IL-1 - TH17 con respecto a su viabilidad y potencial de proliferación, porque las células TH17 no mostraron ninguna expresión superficial de IL-1 en contraste con IL{{36 }}células productoras de otros linajes celulares, como los monocitos (Datos ampliados, Fig. 5d). Esta comparación de IL-1 + e IL-1-células TH17 requirió el establecimiento de un ensayo de secreción de IL-1 -hecho en casa, que permitió el aislamiento de células TH17 IL-1 + -viables mediante la captura de células TH17 secretadas. IL-1 autocrina a la superficie celular después de la estimulación con forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) y ionomicina. No se observó ninguna diferencia en la eficiencia de clonación de las células TH17 que se depositaron como células individuales después de clasificarlas por la presencia o ausencia de IL-1 de superficie (Figura 11 complementaria). Este hallazgo excluyó diferencias en la viabilidad y expansión de las células IL-1 + e IL-1 – TH17 a nivel unicelular. Además, reclonamos clones de TH17 que fueron seleccionados, en función de diversos grados de expresión de IL-1 intracelular, y monitoreamos su respectiva eficiencia de clonación. Si la liberación de IL-1 habilitada por GSDME se asoció con la muerte celular piroptótica, entonces una correlación inversa entre la expresión de IL-1 en clones de células T y la frecuencia de clones en crecimiento en su reclonación individual (eficiencia de clonación) fue esperarse. Sin embargo, la eficacia de la reclonación de células T fue independiente de los niveles de expresión de IL-1 en los clones de células TH17 y, en cambio, fue similar a la de los clones de células T de control, seleccionados sobre la base de niveles variables de expresión de IFN- en ausencia de Coexpresión IL-1 (Fig. 7e). Es importante destacar que los clones de células IL-1 + TH17 continuaron reexpresando IL-1 en ciclos repetitivos de reestimulación de TCR (Fig. 7f). Por lo tanto, se excluyó una pérdida asociada a la muerte celular de células productoras de IL-1 - de su respectiva población de células T clonales en la reestimulación. En particular, este hallazgo indica una memoria de citoquinas de células T para IL-1 inducible. Realizamos una comparación transcriptómica entre IL-1 + e IL-1 - células TH17 en masa y observamos un enriquecimiento aún mayor para los conjuntos de genes de proliferación en IL-1 + en comparación con IL-1 - células TH17. clones (Fig. 7g). La comparación transcriptómica unicelular de células IL1A+ versus IL1A-TH17 corroboró el enriquecimiento transcriptómico para la proliferación. Este también fue el caso de la comparación del grupo 1 de Leiden, que estaba enriquecido en células TH17 que expresan IL1A y firmas inflamatorias, con todos los demás grupos (Fig. 7h). Las células IL-1 + TH17 mostraron una mayor expresión de Ki67 según el análisis de citometría de flujo que sus contrapartes IL-1 después de 5 días de estimulación policlonal (Fig. 7i), lo que respalda nuevamente la idea de que en las células TH17 humanas IL{ La salida de {96}} no está asociada con la muerte celular, a diferencia de las células innatas. En conjunto, estos datos excluyen una asociación de la producción de IL-1 con la muerte celular (piroptótica) incluso a nivel unicelular y demuestran que las células T humanas tienen una memoria de citoquinas para la producción de IL-1 en la reestimulación repetitiva de TCR. .

La IL-1 derivada de células T contribuye a la defensa antifúngica del huésped

Nuestro hallazgo de que las células TH17 humanas producen la señal de peligro innata IL-1 y reutilizan la maquinaria de señalización innata para su liberación extracelular desdibuja la distinción entre respuestas inmunes adaptativas versus innatas y, por lo tanto, extiende el repertorio funcional general de las células T. Una característica crítica que sigue siendo característica de las respuestas de memoria adaptativa es la especificidad del antígeno dotado de TCR. Por lo tanto, investigamos si la capacidad de las células TH17 humanas para producir IL-1 está restringida a especificidades de antígenos específicos. Anteriormente se ha demostrado que las células TH17 están altamente enriquecidas dentro de células específicas para los antígenos de C. albicans y Staphylococcus aureus15. Es interesante que observamos una expresión y secreción de IL -1 significativamente mayor por clones de células TH17 específicos de C. albicans que de S. aureus (Fig. 8a). A continuación, investigamos si las células T vírgenes que reconocen C. albicans en lugar de S. aureus serían preparadas por su antígeno afín para producir selectivamente IL-1. Se cocultivaron células TH vírgenes (CD45RA+ CCR7+ ) con monocitos autólogos pulsados ​​con antígenos de C. albicans o S. aureus inactivados por calor o se estimularon policlonalmente con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28, y luego se clonaron el día 7. con células alimentadoras alogénicas. Todos los clones fueron reestimulados el día 14 con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 5 días para ELISA de sus sobrenadantes. Sorprendentemente, encontramos que C. albicans, pero no S. aureus o la activación policlonal de TCR, indujeron la producción de novo de IL-1 en células TH17 diferenciadoras humanas (Fig. 8b). Por lo tanto, nuestro enfoque combinado de recuperación ex vivo y cebado in vitro establece que la capacidad de producir IL-1 se limita a las células T con especificidad de TCR para C. albicans. Finalmente probamos si la capacidad distintiva de las células TH17 específicas de C. albicans para producir IL-1 está asociada con un papel fisiológico en la defensa antifúngica del huésped. Para ello, cocultivamos monocitos humanos con sobrenadantes de células TH17 humanas después de su reestimulación policlonal con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 5 días. Observamos un aumento significativo de la fagocitosis de C. albicans marcado con FITC por parte de monocitos mediante citometría de flujo. Es importante destacar que el aumento de la fagocitosis de C. albicans por los sobrenadantes de células TH17 dependía de IL-1, como lo demuestra la anulación significativa de la fagocitosis de C. albicans si los sobrenadantes de células TH17 carecían de IL-1 después de la inmunoabsorción o CRISPR-Cas{. {46}}Agotamiento dirigido de IL-1 en células TH17 (Fig. 8c). Las imágenes in vitro de células vivas corroboraron aún más la mayor captación y eliminación de C. albicans por parte de los monocitos en presencia de sobrenadantes de células TH17 que contienen IL-1 - (Fig. 8d, datos de video). En conjunto, estos hallazgos sugieren firmemente que las células TH17 eliminan las infecciones por C. albicans no sólo a través de su producción de IL-17, como se pensaba anteriormente38, sino también, en gran medida, a través de la capacidad de un subconjunto único de células TH17 para producir IL-1 . En conjunto, los hallazgos que identifican la formación de poros de GSDME en las células T como una estrategia de salida para la IL-1 proinflamatoria y la regulación de GSDME por el eje NLRP3 inflamasoma-caspasa-8-caspasa-3 revelan una nueva modo de secreción de citocinas de células T que se asocia con un subconjunto proinflamatorio de células TH17 con especificidades antifúngicas de TCR. Esto proporciona nuevos objetivos terapéuticos para la modulación de las células TH17 humanas que son relevantes para la defensa antifúngica del huésped y también podrían participar en la patogénesis de enfermedades inflamatorias crónicas.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

Discusión

En resumen, nuestros hallazgos revelan una vía biológica y una modalidad de secreción de citoquinas previamente desconocidas en las células T humanas que diversifican la funcionalidad general de la población de células T. Descubrimos que la expresión de IL-1 se limitaba únicamente al destino de las células TH17, como lo demuestra su coexpresión con IL-17A, la regulación por ROR-t y la inducción por las citocinas IL{{ 6}} y TGF- y por su perfil de expresión del receptor de quimiocinas asociado a células TH17. Estos hallazgos son consistentes con la existencia de sitios de unión para ROR-t y ROR- en las regiones potenciadoras y promotoras de IL1Α como se describe en el presente estudio y con los sitios de unión de ROR-t informados previamente en la región promotora de NLRP339. Además, observamos que las citoquinas cebadoras de células TH17 aumentaron la expresión de NLRP3 y GSDME. En consecuencia, los reguladores maestros del destino de las células TH17, como ROR y BATF, así como múltiples factores de transcripción inducibles por TCR, mostraron supuestos sitios de unión en las regiones potenciadoras de GSDME. Por lo tanto, la polarización de las células TH17 promovió no solo la expresión de IL-1 sino también su salida extracelular (Datos ampliados, figura 10, resumen gráfico). Inesperadamente, encontramos que el inflamasoma NLRP3 estaba activo y reutilizado para la liberación de IL-1 en lugar de IL-1 en células TH17 activadas por TCR. A diferencia de las células innatas, las células T no están especializadas en la detección innata de peligro, que se sabe que desencadena el ensamblaje de los componentes del inflamasoma NLRP3. Sin embargo, se ha demostrado previamente que la elevación del Ca2+ citoplasmático evita la señalización de peligro innata para la activación del inflamasoma NLRP316,40. Esto es consistente con nuestro hallazgo de que la activación de TCR, que está acompañada por el flujo de calcio, es un requisito para la liberación de IL-1 por parte de las células TH17 humanas. Observamos que las células TH17 activaron una cascada de señalización descendente alternativa de NLRP3 mediante la activación de caspasa-8. Esto podría haberse visto facilitado por la ausencia de escisión de caspasa-1 porque previamente se ha demostrado el reclutamiento competitivo de caspasa-1 versus caspasa-8 inflamasoma34,41. También encontramos procaspasa-1 y GSDMD sin escindir en células TH17 humanas, pero no hay evidencia de su escisión regulada por el inflamasoma NLRP3 ni de la producción de IL-1. La expresión de sus precursores plantea la cuestión de si la señalización clásica del inflamasoma NLRP3 y la liberación de IL-1 también podrían funcionar en las células TH17 humanas si se aplican estímulos alternativos aún por identificar. Esto implica que los mecanismos contrarreguladores dependientes de caspasa-8- versus caspasa-1-podrían controlar una dicotomía entre la producción de IL-1 versus IL-1 por parte de las células T, consolidando las funciones previamente sugeridas para el inflamasoma NLRP3. en la liberación de IL-1 en células TH1 humanas42 y células TH17 murinas43. Una observación intrigante de nuestro estudio fue la identificación de la expresión y escisión de GSDME en las células T. Esto reveló que en las células T puede producirse una secreción de citocinas no convencional a través de los poros de la membrana. Varias de las funciones asignadas recientemente a GSDME se han asociado con piroptosis y la posterior mejora de la muerte de las células tumorales y un microambiente inflamatorio 32,44. Sorprendentemente, descubrimos que las células TH17 que expresan GSDME mostraban una viabilidad preservada y una proliferación continua con estimulación repetitiva de TCR en comparación con las células T deficientes en GSDME. Se observaron los mismos resultados para IL-1 + en comparación con IL-1 – células T. Estos hallazgos fueron inesperados, considerando que la producción de IL-1 hasta ahora se ha considerado un sello distintivo de la senescencia y, por lo tanto, de las células muertas o detenidas en la replicación45. Esto evoca la idea de que la señal de peligro IL-1 puede ser parte de una memoria de citoquinas asociada a células T que es reexcitable mediante el reconocimiento de antígenos afines46. Además, los poros de GSDME podrían cumplir una función fisiológica para permitir que las células TH17 liberen moléculas adicionales aún no identificadas más allá de IL-1 que se definen por su tamaño o carga47. Esto sería consistente con los resultados de nuestra comparación transcriptómica imparcial de células TH17 deficientes en GSDME intactas o diseñadas con CRISPR-Cas9-, que revelaron múltiples funciones para GSDME en el transporte transmembrana pero no en la muerte celular. El mecanismo por el cual se preserva la viabilidad y la memoria a largo plazo de las citocinas IL-1 en las células T con poros de GSDME aún está por explorarse en el futuro. La disponibilidad de IL-1 de diferentes fuentes celulares, particularmente de APC innatas, plantea la pregunta sobre la contribución relativa de la IL-1 derivada de células T a la salud y las enfermedades humanas. Aunque las células T IL-1 + constituyen sólo un pequeño subconjunto dentro del linaje de células T, su capacidad para producir IL-1 fue cuantitativamente comparable a la de los monocitos estimulados por LPS, lo que respalda el nuevo concepto de que las células T pueden servir como fuente relevante de IL inflamatoria-1 . Nuestros hallazgos de los análisis transcriptómicos y funcionales revelan que la IL-1 está asociada con el destino proinflamatorio de las células TH17. La subpoblación IL-1 + de células TH17 humanas mostró firmas transcriptómicas de patogenicidad inflamatoria mejorada y asociaciones con enfermedades inflamatorias crónicas. La expresión significativamente mejorada de IL-1 por las células TH17 circulantes de pacientes con AIJ y su abundante localización en el líquido sinovial inflamado respalda este potencial patogénico del subconjunto IL-1 + de células TH17. Aún queda por establecer una relación causal rigurosa entre las células TH17 productoras de IL-1 - y la patogénesis de la AIJ y el impacto relativo de las células TH17 de IL-1 + se validará en futuros ensayos clínicos. Una observación sorprendente fue que la producción de IL-1 por parte de las células T está ligada a su especificidad por TCR. Aunque la producción de IL-1 por fuentes celulares innatas se desencadena por estímulos de estrés no específicos16, encontramos que la producción de IL-1 por células TH17 humanas está asociada con una especificidad de TCR para C. albicans. En cambio, las células TH17 específicas de S. aureus mostraron una producción de IL-1 significativamente reducida. Estos hallazgos son consistentes con el requerimiento diferencial de IL-1 para la generación de células TH17 específicas de C. albicans, pero no de S. aureus, como se informó anteriormente4 y, en consecuencia, con el papel crítico de IL{{126} } para la inducción de la expresión IL-1, como se informa aquí. Además, encontramos que la secreción de IL-1 depende de la estimulación del TCR y de las señales de calcio, destacando su estrecha asociación con la señalización inmunitaria adaptativa específica a través del TCR. Se sabe que las células TH17 son las protagonistas en la eliminación de las infecciones por C. albicans a través de su secreción de IL-17, ejemplificada por la disbiosis de C. albicans en entornos de deficiencias genéticas o terapéuticas de IL-1738. Descubrimos que el producto de células TH17 IL-1 está involucrado en la eliminación de C. albicans porque su ausencia en los sobrenadantes de células TH17 redujo significativamente la fagocitosis de C. albicans por parte de los monocitos. Esto sugiere que las funciones efectoras antifúngicas de las células TH17 se ejercen no solo a través de IL-17A/F, como se sugirió anteriormente, sino también a través de IL-1 de una manera específica de TCR. Por lo tanto, en el futuro será necesario probar si la regulación aberrante de la vía molecular que conduce a la producción de IL-1 por las células TH17 podría predisponer a una defensa antifúngica comprometida del huésped. En conjunto, nuestros hallazgos allanaron el camino para una investigación sistemática de las contribuciones de las células TH17 productoras de IL-1 -en diversas enfermedades inflamatorias y en la defensa antifúngica del huésped. El eje TCR-NLRP3 inflamasoma-caspasa-8-caspasa-3-GSDME no solo representa un modo previamente pasado por alto de señalización inmune e instrucción de destino en las células TH, sino que también proporciona objetivos moleculares para alterar una célula TH17 patógena identidad o aprovecharla para la defensa del anfitrión.

Figura 7|Las células TH17 son resistentes a la piroptosis a pesar de los poros de la membrana plasmática GSDME.

Figura 8|La especificidad de TCR controla la producción de IL-1 y contribuye a la eliminación de C. albicans

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