El hiperósido atenúa la inflamación en las células HT22 a través de la regulación positiva de SIRT1 a las actividades Wnt/-Catenin y Sonic Hedgehog Pathways Parte 1

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La neuroinflamación juega un papel importante en la patogenia y progresión del neurodesarrollo alterado, la pérdida auditiva neurosensorial y ciertas enfermedades neurodegenerativas. El hiperósido (quercetina-3-O- -D-galactósido) es un compuesto activo aislado de las plantas de Hypericum. En este estudio, investigamos el efecto protector del peróxido sobre la neuroinflamación y su posible mecanismo molecular. Se utilizaron lipopolisacáridos (LPS) e hiperósidos para tratar las células HT22. La viabilidad celular se midió mediante ensayo MTT. La tasa de apoptosis celular se midió mediante un ensayo de citometría de flujo. Los niveles de expresión de ARNm de interleucina-1 (IL-1 ), interleucina-6(IL-6), interleucina-8(IL-8), y el factor de necrosis tumoral (TNF-a) se determinaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa. Los kits midieron los niveles de los índices de estrés oxidativo superóxido dismutasa (SOD), especies reactivas de oxígeno (ROS), catalasa (CAT), glutatión (GSH) y malondialdehído (MDA). La expresión del factor neurotrófico y la relación entre el hiperósido, el homólogo 2 de la regulación de la información del tipo de apareamiento silencioso-1(SIRT1) y Wnt/ -catenina, y el erizo sónico se examinó mediante transferencia Western. En las células HT22 inducidas por LPS, el hiperósido promueve la supervivencia celular; alivia el nivel de IL-1, IL-6, IL-8, TNF-, ROS, MDA, Bax y caspasa-3; y aumenta la expresión de CAT, SOD, GSH, Bcl-2, BDNF, TrkB y NGF. Además, hvperoside aumentó la expresión de SIRT1. La investigación mecanicista adicional mostró que el hiperósido aliviaba la inflamación, el estrés oxidativo y la apoptosis inducidos por LPS mediante la regulación positiva de SIRT1 para activar las vías Wnt/-catenina y sonic hedgehog. En conjunto, nuestros datos sugirieron que el hiperósido actúa como protector en la neuroinflamación.

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1. Introducción

La neuroinflamación es una inflamación crónica del tejido cerebral, que juega un papel importante en la patogenia y la progresión del neurodesarrollo alterado, la pérdida auditiva neurosensorial y ciertas enfermedades neurodegenerativas[1-5]. En las primeras etapas de la vía auditiva central, la pérdida auditiva inducida por ruido y la pérdida auditiva conductiva están relacionadas con la neuroinflamación [6]. Además, la neuroinflamación contribuye a la muerte neuronal y al deterioro neurológico al aumentar la producción de factores proinflamatorios y el estrés oxidativo[7]. Numerosos estudios han demostrado que las neuronas del hipocampo son susceptibles a la neuroinflamación y causan complicaciones neurológicas [8]. Sin embargo, todavía no existen agentes o métodos efectivos para restaurar y prevenir el daño neuronal causado por la neuroinflamación. Por lo tanto, la identificación de agentes candidatos protectores inflamatorios efectivos es crucial.

El hiperósido (quercetina3-O- -D-galactósido) es un compuesto activo aislado de las plantas de Hypericum. Tiene actividades antioxidantes y antiinflamatorias, disminuyendo la sobrecarga de calcio e inhibiendo la apoptosis [9, 10]. Estudios previos han confirmado que el hiperósido previene eficazmente las complicaciones neurológicas causadas por la neuroinflamación. En el modelo de diabetes aguda de inflamación y estrés oxidativo inducido por hiperglucemia, la administración de hiperósido previno la disfunción cognitiva, la neuroinflamación y el estrés oxidativo causados ​​por la DM a través de la vía de señalización TNF-/NF-Bx/caspasa-3 [11]. En enfermedades como la enfermedad de Parkinson, el hiperósido actúa como un agente protector al atenuar la activación de la microglía inducida por LPS [12]. Hasta el momento, hay pocos estudios sobre el efecto protector del hiperósido sobre la neuroinflamación y el mecanismo no se ha dilucidado por completo.

El lipopolisacárido (LPS) se usa ampliamente para activar el sistema inmunológico innato. Estudios previos han demostrado que el LPS se usa generalmente para preparar modelos de neuroinflamación inducidos por respuestas inflamatorias [13,14]. En este estudio, expusimos células HT22 a LPS para imitar un modelo celular de neuroinflamación. Simultáneamente, a través de este modelo se estudió el efecto protector del hiperósido sobre la neuroinflamación y su posible mecanismo molecular. Descubrimos que el hiperósido protege a las células HT22 de la inflamación inducida por LPS; el estrés oxidativo y la apoptosis están estrechamente relacionados con los niveles de SIRT1. Un análisis posterior mostró que el hiperósido aliviaba la inflamación inducida por LPS, el estrés oxidativo y la apoptosis mediante la regulación positiva de SIRT1 para activar las vías Wnt/-catenina y sonic hedgehog.

2. Materiales y métodos

2.1.Reactivos y Fármacos. LPS, hiperósido y 3-(4,5-bromuro de dimetil-2-tiazolilo)-2,5-difeniltetrazolio

(MTT) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El medio Eagle modificado de Dulbecco que contenía 10 por ciento de suero bovino fetal (FBS) se adquirió de Gibco (Carls-bad, EE. UU.). Se compraron 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). LiCl y el agonista sónico hedgehog SAg se adquirieron de Merck (San Diego, CA, EE. UU.). Los anticuerpos primarios contra Bcl-2,Bax, caspasa-3,BDNF,NGF, SIRT1,Wnt1, -catenina, Shh, Patch y GAPDH y los anticuerpos secundarios se adquirieron todos de Cell Signaling (Boston, MA, EE. EE.UU). 2.2. Cultivos celulares y tratamientos. La línea de células neuronales murinas HT22 se adquirió del Kunming Cell Bank de la Academia China de Ciencias (Kunming, China). Las células HT22 se sembraron a 2 × 104 células/pocillo en una placa de 6-pocillos y se cultivaron en DMEM con suero fetal bovino al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina a 37 °C en un 5 % de CO, humidificado. incubadora. Cuando HT22 alcanzó el 70 por ciento de confluencia después de 24 h, se realizó la transfección de células pretratadas con diferentes concentraciones de hiperósido y LPS (1 ug/ml).

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2.3.Viabilidad celular. La viabilidad celular se determinó mediante ensayo MTT.

Brevemente, las células HT22 se sembraron en 24-placas de pocillos a una densidad de 2x104 células/ml durante 24 h. Las células se privaron de alimento durante la noche y luego se pretrataron con diferentes concentraciones de hiperósido durante 24 horas, seguido de incubación con LPS (1 ug/ml) durante otras 24 horas. El medio se refrescó y se incubó con 50 ul de MTT (5 mg/ml preparado en solución salina tamponada con fosfato) durante 4 horas a 37ºC. A continuación, se retiró la solución y se añadió DMSO a las placas. La absorbancia a 570 nm se midió utilizando un lector de placas.

2.4.Western Blotting.

Se añadió tampón RIPA a las células HT22 (Invitrogen; EE. UU.) para recoger la proteína total; luego se determinaron las concentraciones de proteína evaluadas mediante el método BCA (Invitrogen, USA).

Las muestras de proteína se mezclaron con un tampón de carga 5x y se desnaturalizaron en ebullición. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE al 15 por ciento y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. A continuación, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios (Bcl-2, Bax, caspasa-3, BDNF, NGF, SIRT1, Wntl, -catenina, Shh, Patch y GAPDH) a las 4 de la noche. Luego, al día siguiente, las membranas se lavaron con PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios durante 1 h. Finalmente, las bandas de proteína se midieron utilizando el software ImageJ. Los datos se recogieron de al menos tres experimentos independientes.

2.5.qRT-PCR. El ARN total de las células HT22 se aisló utilizando el kit de extracción de ARN TRIzol (Invitrogen, Grand Island, NY, EE. UU.), y el ARN total aislado se transcribió inversamente a ADNc utilizando un kit de transcripción inversa (Takara, Kioto, Japón). A continuación, Se utilizó SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Kioto, Japón) para realizar la amplificación qRT-PCR. Los cebadores de amplificación IL-1 , I-6 y TNF- fueron los siguientes: IL-1 ,5'-GATGGTCGCATTAGCTCC-3' y 5'-GGCTGTAGCTGTAGCGTC{{15} }';IL-6,5'-ATTG CGGCGGCTGACGCGTAG-3'y 5'-GTCTGTTGCGC GAGCTGGTA-3';IL-8,5'-GTCGAGCTGCCGCGTAGCG T{{26} }'y 5'-CGCGATGCGTGCAGC-3'; y TNF-a,5'-CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3'and5'-CGGACTCCG CAAAGTCTAAG-3'. La expresión relativa de ARNm se analizó utilizando el método 2-Act.

2.6.Ensayo de SOD, GSH y MDA. Medimos la actividad de los niveles de especies de oxígeno (ROS), catalasa (CAT), superóxido dismutasa (SOD), glutatión (GSH) y malondialdehído (MDA) utilizando los kits de ensayo correspondientes (Nanjing Jian-cheng Bio Company, China).

2.7.Citometría de flujo.

El ensayo de citometría de flujo se utilizó para medir la tasa de apoptosis celular según un informe anterior [15]. Se recogieron y resuspendieron las células HT22 de cada grupo. Las células apoptóticas se marcaron doblemente con anexina V-FITC y PI utilizando un kit de detección de apoptosis de anexina V-FITC/PI (Beyotime Biotechnology, China) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, la intensidad de fluorescencia de las células se cuantificó mediante citometría de flujo.

2.8. Análisis estadístico.

En este estudio, la diferencia entre dos grupos se comparó mediante una prueba t, y la diferencia entre los grupos se analizó mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Todos los datos se presentaron como valores medios ±

figura 1: El hiperósido alivió la apoptosis y la inflamación en las células HT22 inducidas por LPS. La viabilidad de las células HT22 se midió mediante el ensayo MTT. La viabilidad celular se observó mediante un microscopio (100x)(a, b). La expresión de Bcl-2, Bax y caspasa-3 en células HT22 se midió mediante transferencia Western (c). La tasa de apoptosis de las células HT22 se midió mediante un ensayo de citometría de flujo (d). Los niveles de IL-1 ,IL-6. IL-8 y TNF-mRNA en células HT22 se midieron mediante art-PCR(e);* se consideró significativo en comparación con el control (*P<0.05);# was="" considered="" significant="" compared="" to="" lps="" ("p=""><>

Este artículo se extrajo de Hindawi Neural Plasticity Volumen 2021, artículo ID 8706400, 10 páginas https://doi.org/10.1155/2021/8706400