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Parte 2: La regulación a la baja de Hsa-miR renal-127-3p contribuye a la sobreactivación de la vía de señalización del interferón tipo I en el riñón de la nefritis lúpica

May 09, 2022

Para más información. contactotina.xiang@wecistanche.com

lossistema inmunitarioes el "guardián" de nuestro cuerpo y es el arma más eficaz contra la invasión de patógenos. Las personas con baja inmunidad innata tienen más probabilidades de enfermarse. Los resultados experimentales muestran que los ingredientes activos de Cistanche pueden mejorar la inmunidad del cuerpo.

Miremos más de cerca.

1. Glucósidos totales de Cistanchetubulosa

Los glucósidos totales de Cistanche tubulosa mejoraron significativamente la producción de anticuerpos, el número de linfocitos T en sangre periférica, la función fagocítica de los macrófagos peritoneales y las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado en ratones lesionados por rayos Co. El índice, el índice de bazo y la tasa de supervivencia mostraron que los glucósidos totales de Cistanchetubulosatuvo un fuerte efecto protector sobre la función inmune de los ratones lesionados por radiación.

2. Polisacáridos de Cistanche

CistanchetubulosaLos polisacáridos en Cistanche pueden reducir el contenido de MDA en el cerebro, el corazón y el hígado de modelos animales inmunocomprometidos, aumentar la actividad de la telomerasa en el corazón y el tejido cerebral, la función fagocítica de los macrófagos peritoneales, la proliferación de linfocitos, los linfocitos T del bazo El contenido de IL{ {0}} y la concentración de iones de calcio en los timocitos mostraron que el polisacárido de Cistanche deserticola podría mejorar la función inmunológica del cuerpo.

3. Verbascum

El ingrediente activo en Cistanchetubulosa, Xinjiang, hizo que la D-galactosa redujera significativamente el contenido de MDA en el corazón, el hígado y el tejido cerebral de los ratones modelo de envejecimiento subagudo, y aumentara significativamente la actividad de la telomerasa en el corazón y el tejido cerebral. Se mejoró la función fagocítica de los fagocitos y se incrementó significativamente la proliferación de linfocitos y el contenido de IL-2 en la sangre periférica. Se muestra que Verbascum puede mejorar la función inmunológica del cuerpo.

Resumen: ya sea que tenga una inmunidad innata baja o una inmunidad adquirida deficiente, puede comer alimentos relacionados con la cistanche para regular su propia inmunidad.

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RESULTADOS

Hsa-miR-127-3p es un regulador negativo de la vía de señalización de IFN-I

En nuestro esfuerzo anterior para estudiar los miARN renales en LN, comparamos los perfiles de miARN deriñónbiopsias de pacientes con NL y un grupo de control normal (descrito en MATERIALES Y MÉTODOS). Hubo un patrón de expresión de miARN distinto en los tejidos renales de pacientes con LN (Figura S1). Entre los miARN expresados ​​diferencialmente, seleccionamos 9 miARN que estaban regulados a la baja (al menos en un 50 por ciento) y conservados (entre humanos y ratones) y probamos sus funciones en la vía de señalización de IFN-I mediante el ensayo informador ISRE-luciferasa. Teniendo en cuenta la fuente limitada de células renales humanas primarias y su limitada capacidad de proliferación in vitro, examinamos y verificamos la función reguladora de los miARN y estudiamos los mecanismos moleculares asociados utilizando células Hela. En comparación con los otros 8 miARN, la sobreexpresión de hsa-miR-127-3p inhibió significativamente la inducción de actividad de luciferasa mediada por ISRE en células Hela estimuladas por IFN- (Figuras 1A y Figura S2). Por lo tanto, decidimos estudiar más a fondo hsa-miR-127-3p. Además de IFN-, la inducción estimulada por IFN- (otro miembro de IFN-I) de la actividad ISRE-luciferasa también podría inhibirse mediante hsa-miR-127-3p (Figura S3). IFN-I también puede inducir la expresión génica mediada por el elemento GAS (3). Como era de esperar, la sobreexpresión de hsa-miR-127-3p inhibió la inducción de la actividad de luciferasa mediada por GAS estimulada por IFN- (Figura 1A). Dado que los miARN reconocen sus objetivos mediante el emparejamiento de bases complementarias de sus secuencias semilla con los sitios objetivo en los ARNm objetivo (6). Esta función inhibitoria de hsa-miR-127-3p en la vía de señalización de IFN-I fue eliminada por la mutación de su secuencia semilla (Figuras 1A). De acuerdo con estos resultados, la sobreexpresión de hsa-miR-127-3p inhibió la fosforilación de STAT1 y STAT2 estimulada por IFN, con un efecto mucho más fuerte sobre STAT2, en células Hela (Figuras 1B y S4). Para demostrar que este efecto inhibidor de hsa-miR-127-3p no estaba restringida a las células Hela, verificamos además que la sobreexpresión de hsa-miR-127-3p inhibía la fosforilación de STAT2 estimulada por IFN en dos tipos de células adicionales (Figura S5).

Tovalidatehsa-miR-127-3p funciona como un regulador negativo intrínseco de la vía de señalización de IFN-I en células residentes renales, realizamos ensayos de indicadores ISRE y GAS-luciferasa utilizando HRMC primarios, que pueden responder a estímulos inmunitarios innatos y participar en la patogenia de la NL como se indica en estudios previos(12-15). Encontramos que hsa-miR-127-3p antagomir mejoraba la inducción de actividad de luciferasa mediada por ISREorGAS estimulada por IFN- en HRMC primarias (Figura 1C). Además, hsa-miR-127-3p antagomir mejoró la fosforilación de STAT2 estimulada por IFN- en HRMC primarias (Figuras 1D y S6).

Hsa-miR-127-3p negatively regulates IFN-I signaling pathway. (A) Hela cells transfected with ISRE-luciferase reporter (left) or GAS-luciferase reporter (right) and pRL-TK vectors together with negative control mimics (NC), hsa-miR-127-3p mimics, or hsa-miR-127-3p mutants (mut) were stimulated with universal type I interferon for 8 h. Firefly (F) and renilla (R) luciferase activities were measured. (B) Hela cells transfected with negative control mimics (-) or hsa-miR-127-3p mimics (+) were stimulated with universal type I interferon for 0- or 10-min. Western blot for STAT-1 and STAT-2, and phosphorylated STAT-1(pY701) and STAT-2 (pY690). (C) Primary HRMCs transfected with ISRE-luciferase reporter (left) or GAS-luciferase reporter (right) and pRL-TK vectors together with negative control antagomiR (antagomiR-NC), or hsa-miR-127-3p antagomiR (antagomiR-127-3p) were stimulated with universal type I interferon for 8 h. F and R luciferase activities were measured. (D) Primary HRMCs transfected with negative control antagomiR (-), or hsa-miR-127-3p antagomiR (+) were stimulated with universal type I interferon for 0- or 15-min. Western blot for STAT-2 and STAT-2(pY690). (A, C) The induction fold was calculated by dividing the F/R ratio of a sample in experimental groups by the F/R ratio of an unstimulated control sample. (B, D) Representative pictures from at least 3 independent experiments. (A, C) Data from at least 3 independent experiments are plotted and presented as mean ± SEM. P values were determined by Mann-Whitney U-test

A continuación, realizamos microarrays para analizar el efecto inhibidor de hsa-miR-127-3p en la expresión de genes utilizando muestras de ARN.

de células Hela tratadas con IFN que se transfectaron previamente con hsa-miR-127-3p o varios controles (transfección simulada, imitadores de control negativo, imitadores mutantes de hsa-miR-127-3p). Calculamos la superposición de genes expresados ​​diferencialmente en células Hela tratadas con IFN-o (reguladas al alza o a la baja en 1.5-veces) entre diferentes pares de comparación (hsa-miR-127-3p imita frente a simulacro, hsa-miR{ {11}}p mimics vs. control negativo mimics, y hsa-miR-127-3p mimics vs hsa-miR-127-3p mimics mutantes), recuperó todos los genes que fueron inhibidos por hsa-miR{{17 }}p y realizó un análisis para identificar motivos reguladores cis enriquecidos de los genes inhibidos hsa-miR-127-3p utilizando el complemento iRegulon en la plataforma Cytoscape (10). Descubrimos que el motivo regulador en cis que utilizan los TF aguas abajo de IFN-I (como las proteínas STAT-1, STAT-2 e IRF) dominaba los principales motivos enriquecidos (9 de los 10 motivos principales) (Figura 2A). Esto demuestra además que hsa-miR-127-3p inhibe principalmente la señalización aguas abajo de IFN-I. Además, a partir de los datos de la micromatriz, encontramos que la sobreexpresión de hsa-miR-127-3p inhibía la inducción de muchos ISG, incluidos aquellos que constituyen la firma del 21-gen IFN que se usa para evaluar la eficacia de anifrolumab en el bloqueo de IFN -Señalización I(8)(Figura 2B). De acuerdo con los resultados anteriores, los imitadores mutantes de hsa-miR-127-3p no pudieron inhibir esos ISG (Figura 2B). Verificamos la inhibición de hsa-miR-127-3p en dos ISG representativos (IFIT3 y CXCL10) mediante experimentos independientes adicionales (Figura 2C). Mientras que hsa-miR-127-3p antagomir mejoró la inducción de IFIT3 y CXCL10 por IFN- en HRMC primarias (Figura 2D). Por lo tanto, hsa-miR-127-3p funciona como un regulador negativo de la vía de señalización de IFN-I.

Hsa-miR-127-3p inhibits the induction of IFN stimulated genes. (A) Hsa-miR-127-3p inhibited genes as compared with the controls (mock transfection, negative control mimics and hsa-miR-127-3p mutant mimics) in IFN-a treated Hela cells were used for the enrichment analysis of cis-regulatory motif using iRegulon plugin on Cytoscape platform. Big dots with deeper green color represent the motifs with higher normalized enrichment scores. (B) Heatmaps show the expression of the ISGs that constitute a 21-gene IFN signature (YAO score) (left) and additional top 21 IFN induced genes (right) in Hela cells that were transfected and stimulated as indicated in the pictures. Mock transfected Hela cells without IFN stimulation was used as baseline control. Red = upregulated; White = no change; Blue = downregulated. (C) qPCR analysis was performed for IFIT3 and CXCL10 in Hela cells transfected with negative control mimics (NC) or hsa-miR-127-3p mimics and stimulated with universal type I interferon for 8 h. (D) qPCR analysis was performed for IFIT3 and CXCL10 in primary HRMCs transfected with antagomiR-NC or antagomiR-127-3p and stimulated with universal type I interferon for 8 h. (C, D) The induction fold was calculated by dividing the relative expression of IFIT3 (or CXCL10) of a sample in experimental groups by the relative expression of IFIT3 (or CXCL10) of an unstimulated control sample. Data from at least 3 independent experiments are plotted and presented as mean ± SEM. P values were determined by Mann-Whitney U-test.

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JAK1 es un gen diana de buena fe de Hsa-miR-127-3p

Dado que hsa-miR-127-3p inhibe la fosforilación de tirosina de STAT1 y STAT2 y la inducción de la mayoría de los ISG estimulados por IFN-I, planteamos la hipótesis de que hsa-miR-127-3p puede apuntar a moléculas clave de transducción de señales aguas arriba de Vía de señalización de IFN-I, como JAK1 y TYK2. Por lo tanto, examinamos los niveles de proteína de JAK1 y TYK2 en las células transfectadas con hsa-miR-127-3p o controles mímicos. Encontramos que la sobreexpresión de hsa-miR-127-3p redujo la expresión de JAK1 tanto a nivel de proteína como a nivel de ARNm, pero no de TYK2 (Figuras 3A y S7, S8). Por lo tanto, decidimos probar si JAK1 era un objetivo de hsa-miR-127-3p.

Mediante 2 algoritmos diferentes (16,17), predijimos 3 posibles sitios de unión de hsa-miR-127-3p en el ARNm de JAK1, con un sitio de unión en 3'UTR y los otros dos en la secuencia de codificación (CDS) (Figura S9) . Aunque débiles, los imitadores de hsa-miR-127-3p inhibieron la expresión del gen de la luciferasa fusionado con JAK13'UTR de tipo salvaje, mientras que la mutación de la secuencia diana en JAK1 3'UTR eliminó la inhibición (Figura 3B). Además, clonamos una región de codificación JAK1 truncada que contiene los 2 sitios de destino hsa-miR-127-3p en el vector pCDNA3.1. Luego, creamos una forma mutante del plásmido de expresión de truncamiento de JAK1 al interrumpir los 2 sitios objetivo de hsa-miR-127-3p. Descubrimos que hsa-miR-127-3p también podría inhibir la expresión de JAK1 truncado del plásmido de tipo salvaje pero no del mutante (Figuras 3C y S10). Teniendo en cuenta que el efecto inhibitorio independiente de hsa-miR-127-3p sobre JAK1-3'UTRor JAK1-CDS fue débil, proponemos que hsa-miR-127-3p actúe en estos sitios de unión juntos para lograr una inhibición significativa de la expresión de JAK1. Para verificar aún más esta relación de orientación entre hsa-miR-127-3p y JAK1, mostramos que el ARNm de JAK1 se enriqueció en el complejo Ago2 en las células donde se sobreexpresó hsa-miR-127-3p, pero no en las células sobreexpresando la forma mutante de hsa-miR-127-3p (Figura 3D).

JAK1 is a bona fide target gene of hsa-miR-127-3p. (A) Hela cells were transfected with negative control mimics (NC) or hsa-miR-127-3p mimics and then cultured for 24 h. Whole cell lysates were prepared, and Western blot was performed for JAK1, TYK2, and b-Tubulin. (B) Hela cells were transfected with psiCHECK2, psiCHECK2-JAK1-3'UTR, or psiCHECK2-JAK1-3'UTR-mutant plasmids together with hsa-miR-127-3p mimics and then cultured for 24 h. Cell lysates were prepared, and firefly and renilla luciferase activities were measured. The ratio of renilla to firefly luciferase activity was calculated for each sample. (C) U4A cells were transfected with pcDNA3.1-JAK1t, or pcDNA3.1-JAK1t-mutant plasmids together with negative control mimics (NC) or hsa-miR-127-3p mimics and then cultured for 24 h. Whole cell lysates were prepared, and Western blot was performed for wild type HA-tagged JAK1 truncates (JAK1CDS), mutated HA-tagged JAK1 truncates (JAK1CDSmut), and b-Tubulin. (D) Hela cells were transfected with hsa-miR-127-3p mimics or hsa-miR-127-3p mutant mimics (mut) and then cultured for 12 h. Cell lysates were prepared, and RNA immunoprecipitation was performed. The levels of JAK1 mRNA were quantified for each sample. And the enrichment fold of JAK1 mRNA in anti-Ago2 antibody pull-down products compared to IgG was calculated. (A, C) Representative pictures from at least 3 independent experiments. (B, D) Data from at least 3 independent experiments are plotted and presented as mean ± SEM. P values were determined by MannWhitney U-test.

Además, encontramos que los niveles de hsa-miR-127-3p en biopsias renales de pacientes con NL fueron significativamente más bajos que los de los controles normales (Figura 4A), mientras que los niveles de JAK1 e IFIT3 en biopsias renales de pacientes con LN fueron significativamente más altos que los de los controles normales (Figuras 4B, C). Además, hubo una correlación negativa entre los niveles de hsa-miR-127-3p y JAK1 (o IFIT3) en biopsias renales de pacientes con NL (Figuras 4D, E). Por lo tanto, JAK1 es un gen diana de buena fe de hsa-miR-127-3p.

Negatve association of the expression levels of JAK1 or IFIT3 with hsa-miR-127-3p in renal tissues of LN patients. Total RNAs were extracted from kidney biopsies of normal controls (n=11) and LN patients (n=14) and subjected to qPCR analysis for hsa-miR-127-3p (A), JAK1 (B) and IFIT3 (C). (D, E) Correlation between the levels of hsa-miR-127-3p and JAK1 (D), or IFIT3 (E) in kidney biopsies from LN patients (n=14). (A-C) Data from each subject of the normal and LN groups are plotted and presented as mean ± SEM. P values were determined by Mann-Whitney U-test. (D, E) Each dot represents individual LN patients. P values were determined by Spearman's correlation test

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DISCUSIÓN

En el presente estudio, continuamos nuestro esfuerzo anterior para explorar las funciones de los miARN renales desregulados en LN. Aquí, nos enfocamos en miRNAs regulados a la baja en biopsias renales de pacientes con LN. Elegimos 9 de ellos para el análisis en base a 2 criterios: la conservación y el grado de regulación a la baja (detallado en RESULTADOS). Dado que IFN-I es fundamental para el desarrollo de SLE y LN (3), seleccionamos los 9 miRNA para reguladores potenciales de la vía de señalización de IFN-I. Identificamos hsa-miR-127-3p como un regulador negativo de la vía de señalización de IFN-I al demostrar que podría inhibir la fosforilación de proteínas STAT y la inducción mediada por ISRE (o GAS) de la expresión génica estimulada por IFN-. Descubrimos que este efecto inhibitorio existía en múltiples tipos de células distintas. Además, la sobreexpresión de hsa-miR-127-3p podría reducir considerablemente la inducción de ISG. Además, existe una superposición considerable entre los ISG inhibidos por hsa-miR-127-3p y la firma de IFN suprimida por anifrolumab: 17 de los 21 genes característicos de IFN podrían inhibirse por hsa-miR-127-3p, que se usa para evaluar la eficacia inhibitoria de anifrolumab (18). Cabe destacar que un reciente ensayo clínico de fase 3 sugirió que la administración mensual de nivolumab beneficia a los pacientes con LES en comparación con el placebo(2). Por lo tanto, nuestros hallazgos indican que hsa-miR-127-3p puede servir como una enfermedad de bloqueo de IFN-I (20). Esto refuerza aún más el potencial terapéutico de hsa-miR-127-3p en el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Hay preguntas sin resolver para futuros estudios. Una es que aún no conocemos el mecanismo exacto para la regulación a la baja de hsa-miR-127-3p en el riñón de la NL, lo que nos ayudará a comprender la patogénesis de la NL. Nuestros datos preliminares no publicados indican que la activación a largo plazo de la vía de señalización de IFN-I suprimió la expresión de hsa-miR-127-3p. Por lo tanto, puede haber un bucle de retroalimentación formado por el exceso de IFN-I y la disminución de hsa-miR-127-3p intracelular, que amplifica la señalización de IFN-I. La otra es que, hasta ahora, no pudimos examinar los efectos inhibidores in vivo de hsa-miR-127-3p en JAK1 porque las secuencias de unión de hsa-miR-127-3p del gen JAK1 humano no existen en ratones. . En el futuro, los ratones modificados genéticamente que expresen el gen JAK1 humano podrían ayudar a aclarar la eficacia in vivo de hsa-miR-127-3p para inhibir JAK1 y su señalización de citoquinas asociada.

Para resumir, mostramos que JAK1 es un objetivo de buena fe de hsa-miR-127-3p y la regulación negativa anormal de hsa-miR-127-3p renal contribuye a la patogénesis de la NL al mejorar la expresión de JAK1 y la activación posterior de la vía de señalización de IFN-I en el riñón. Dado que las vías de señalización de citoquinas inflamatorias asociadas a JAK1-son críticas para el desarrollo de muchas enfermedades autoinmunes(4), se justifican estudios futuros para explorar los efectos terapéuticos de hsa-miR-127-3p en LN u otras enfermedades autoinmunes relacionadas daños en órganos con regulación positiva anormal de JAK1.

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