Efectos hipoglucémicos e hipolipidémicos de las antocianinas de arándanos por activación de AMPK: estudios in vitro e in vivo, parte 1

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Resumen:Los arándanos son ricos en antocianinas bioactivas, con un alto nivel de malvidina, que se asocia con beneficios antioxidantes que contribuyen a reducir el riesgo de diabetes. El objetivo de este estudio fue investigar los efectos hipoglucemiantes e hipolipidémicos del extracto de antocianina de arándano (BAE),malvidina(Mv), malvidina-3-glucósido (Mv-3-GLC) y malvidina-3-galactósido (Mv-3-gal) tanto en la línea celular de hepatocarcinoma humano HepG2 como en una dieta rica en grasas que combina ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina. El tratamiento con glucosa alta aumentó significativamente el estrés oxidativo hepático hasta 6-veces y disminuyó la viabilidad de las células HepG2. El pretratamiento con BAE, Mv, Mv-3-glc y Mlv-3-gal mitigó significativamente estos daños al reducir las especies reactivas de oxígeno (ROS) en un 87, 80, 76 y 91 por ciento y aumentar la viabilidad celular en un 88, 79, 73 y 98 por ciento, respectivamente. Estos pretratamientos también inhibieron eficazmente la hiperglucemia y la hiperlipidemia, respectivamente al reducir los niveles de expresión de las enzimas que participan en la gluconeogénesis y la lipogénesis y mejorar las involucradas en la glucogenólisis y la lipólisis, a través de la vía de señalización de la proteína quinasa activada por adenosina monofosfato (AMPK) en las células HepG2. Para determinar el papel de AMPK en la reacción inducida por BAE del metabolismo de la glucosa y los lípidos in vivo, dosis de 100 mg/kg (extractos de antocianina de arándano-baja concentración, BAE-L) y 400 mg/kg (extractos de antocianina de arándano-alta concentración , BAE-H) se administraron por día a ratones diabéticos durante 5 semanas. Los tratamientos BAE tuvieron un efecto significativo (P<0.05) effect="" on="" body="" weight="" and="" increased="" the="" ampk="" activity,="" achieving="" the="" decrease="" of="" blood="" and="" urine-glucose,="" as="" well="" as="" triglyceride="" and="" total="" cholesterol.="" this="" research="" suggested="" that="">antocianinascontribuyó a la inducida por extracto de arándanohipoglucemiay los efectos hipolipidémicos en la diabetes y BAE podrían ser un alimento o medicamento funcional prometedor para el tratamiento de la diabetes.

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1. Introducción

La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad bien conocida caracterizada típicamente por una incapacidad para mantener niveles normales de glucosa en sangre. Este trastorno metabólico crónico causa graves daños a la salud humana e impone una pesada carga financiera a los sistemas de atención de la salud en todo el mundo [1]. Esta enfermedad se clasifica en dos tipos principales según la causa de la desregulación de la glucosa en sangre. La DM tipo 1 está causada por la destrucción autoinmune de las células beta que conduce a la incapacidad de producir insulina, mientras que la diabetes tipo 2 se caracteriza por la resistencia a la insulina. Los receptores de insulina, que tienen una función reducida, no permiten que las células respondan adecuadamente al aumento de la glucosa en sangre.

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Además de la hiperglucemia, los diabéticos tienden a tenerhiperlipidemiaambas condiciones pueden resultar en daños a órganos y tejidos a través de un mayor estrés glucoxidativo [2]. La producción de insulina y el daño del receptor de insulina se encuentran entre los factores que causan la hiperglucemia en los diabéticos. En el hígado, la sobreexpresión de la gluconeogénesis y la glucogenólisis libera glucosa al torrente sanguíneo [3] mientras que, en el intestino delgado, la sobreexpresión del transportador de glucosa 2 (GLUT2) provoca un aumento en el transporte de glucosa [4]. La hiperlipidemia causada por la sobreexpresión de la lipogénesis en el tejido adiposo [5] también puede causar una alteración en la captación de glucosa estimulada por la insulina y la síntesis de glucógeno que conduce a la resistencia a la insulina y, por lo tanto, contribuye a la progresión de la diabetes 6]. Las complicaciones a largo plazo relacionadas con la diabetes afectan a varios órganos e incluyen hipertensión, aterosclerosis, retinopatía, nefropatía, úlceras en los pies y neuropatía periférica [7].

Actualmente no existe una cura para la diabetes, sin embargo, sus efectos pueden aliviarse [8]. Para las personas diagnosticadas con diabetes tipo 1, el tratamiento común es una combinación de regulación de la dieta y una ingesta adecuada de insulina de acuerdo con los carbohidratos consumidos. Los desafíos actuales para los diabéticos tipo 1 incluyen la incapacidad o las dificultades para estimar los carbohidratos totales y la dosis adecuada de insulina; sin embargo, casi idealglucémiconiveles son posibles dado el progreso tecnológico, incluidas las bombas de insulina [9]. Para los pacientes que sufren de diabetes tipo 2, el tratamiento puede ser más complejo e incluye combinaciones de regulación de la dieta, ejercicio, insulina y otros medicamentos con una variedad de mecanismos de acción que trabajan para reducir la glucosa en sangre[10]. La recomendación dietética común es seguir una dieta baja en carbohidratos [11,12].

El arándano es una de las frutas que pueden consumir los pacientes diabéticos y podría disminuir el riesgo de diabetes mellitus tipo 2 (DM2)[13,14]. Los arándanos son ricos en una amplia variedad de compuestos beneficiosos para la salud humana, incluidos minerales, ácidos orgánicos de fibra, ácidos fenólicos y flavonoides, incluidos flavonoles y antocianinas [15,16]. Sin embargo, los perfiles típicos de antocianinas incluyen los galactósidos, glucósidos y arabinósidos de delfinidina, malvidina, cianidina, petunidina y peonidina [17], siendo la malvidina y las delfinidinas los principales contribuyentes al contenido total de antocianinas [18,19]. En nuestro estudio anterior [20], la malvidina fue la antocianidina más abundante encontrada en el extracto de frutos de arándanos ojos de conejo junto con la delfinidina, la cianidina, la petunidina y la peonidina, lo que está de acuerdo con otros autores que también encontraron que la malvidina contribuye de manera importante al contenido total de antocianinas. en diferentes tipos de arándanos [17,21].

Las antocianinas de arándanos pueden mejorar la sensibilidad a la insulina a través de la capacidad antioxidante y otras interacciones reguladoras, ya que sus efectos no pueden explicarse por completo por la primera [13,22]. Los estudios también han encontrado los beneficios de las antocianinas de arándanos para otras preocupaciones relacionadas con la diabetes. En un estudio in vitro, Huang et al. [23] encontraron que las antocianinas de los arándanos tenían efectos antiinflamatorios y antioxidantes en las células de la retina humana en condiciones de glucosa alta. Las células expuestas a niveles altos de glucosa tuvieron una viabilidad del 64 %, mientras que cuando se expusieron al extracto de antocianina de arándano, malvidina, malvidina-glucósido o malvidina-galactósido, su viabilidad fue de 7-9 %, 83 %, 91- % o { {11}} por ciento, respectivamente. Por otro lado, Song et al. [24] encontraron que las antocianinas de arándanos reducían el estrés oxidativo y la inflamación en la retina de ratas diabéticas. Las ratas diabéticas recibieron 20, 40 y 80 mg/kg de antocianinas de arándanos por vía oral durante 12 semanas. Las ratas con altas dosis de antocianinas de arándanos tenían glucosa en sangre más baja, mayor capacidad antioxidante y menor inflamación en la retina, y especies reactivas de oxígeno más bajas en comparación con las que no tenían antocianinas de arándanos.

Aunque las antocianinas de arándano brindan beneficios para la salud del hígado y otros órganos para los diabéticos, las acciones hipoglucémicas e hipolipidémicas del extracto de antocianina de arándano (BAE) en las células hepáticas humanas no están claras. En el presente estudio, se especuló que BAE, así como Mv, Mv-3-glc y Mv-3-gal, tienen actividades hipoglucémicas e hipolipidémicas en células de hepatocarcinoma humano (HepG2) y ratones y que podría mantener la homeostasis de los glucolípidos, aliviando así el desarrollo de la diabetes.

2. Materiales y métodos

2.1. Químicos y reactivos

Arándanos ojo de conejo Brightwell (Vaccinium ashei se cosecharon de Fujiabian Orchard Picking (Nanjing, China) y sus extractos de antocianina se obtuvieron y almacenaron en la oscuridad a {{0}} grados. El reactivo 3- (4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil-2H-tetrazolio bromuro (MTT) y los estándares malvidina (Mv), malvidina-3-glucosa (Mv{ {11}}glc) y malvidina-3-galactosa (Mv-3-gal) se adquirieron de Sigma Aldrich (Shanghai, China). Células primarias HepG2, kit de ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA) y Los reactivos de detección de transferencia Western de quimioluminiscencia (ECL) se adquirieron de CW Biotechnology (Beijing, China), el suero bovino fetal (FBS), el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y la penicilina-estreptomicina se adquirieron de Gibco (Auckland, Nueva Zelanda). BioFroxx La estreptozotocina (STZ) se compró a Saiguo Biotech (Guangzhou, China) El kit de detección de diacetato de dicloro-dihidro-fluoresceína (DCFH-DA) se compró al Beyo-time Institute of Technology (Shan Ghai, China). La albúmina de suero bovino (BSA) se adquirió de Shyuanye (Shanghai, China). El alimento alto en grasa y azúcar (35,5 por ciento de grasa, 20 por ciento de proteína, 36,4 por ciento de carbohidratos, 0,1 por ciento de celulosa) y el alimento normal (4,5 por ciento de grasa, 23 por ciento de proteína, 31,9 por ciento de carbohidratos, 3,7 por ciento de fructosa y 5,3 por ciento de celulosa) para ratones se obtuvieron de Xietong Bioengineering Co., Ltd (Nanjing, China). Los kits de ensayo de insulina, triglicéridos (TG), colesterol total (TCHD, glutatión peroxidasa (GSH-Px) y superóxido dismutasa (SOD) se compraron al Instituto de Investigación de Bioingeniería de Jiancheng (Nanjing, China). AndyGene human Forkhead Box O1 (FOXO1) , glucosa-6-fosfatasa (G6Pase), glucógeno sintasa-fosforilación (p-GS), glucógeno sintasa quinasa-3 beta-fosforilación (p-GSK3), transportador de glucosa 2 (GLUT2), acetil coenzima A carboxilasa (ACC), triglicérido lipasa sensible a hormonas (HSL),3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima reductasa (HMGCR) y kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de insulina en ayunas de ratón se compraron a Bluegene Biotech (Shanghai, China) Los productos químicos y reactivos utilizados en este estudio fueron todos de grado analítico puro.

2.2. anticuerpos

Los anticuerpos primarios contra GS, p-GS (Ser641), proteína de unión a elementos reguladores de esteroles-1c(SREBP-1c) y fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) se adquirieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido) . Anticuerpos primarios contra la proteína quinasa alfa activada por monofosfato de adenosina (AMPKa), p-AMPK a (Thr172), receptor-y-coactivador activado por proliferador de peroxisomas-1 (PGC-1 ), ACC, p- Los anticuerpos secundarios conjugados con ACC (Ser79) y peroxidasa de rábano picante (HRP) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EE. UU.). El anticuerpo contra la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se adquirió de Nanjing Beidi Biomed Technology (Nanjing, China), mientras que el anticuerpo contra actina se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Los anticuerpos primarios se usaron en diluciones 1:1000 mientras que los anticuerpos secundarios se usaron diluciones 1:4000.

2.3. Preparación de extracto de antocianina de arándano (BAE)

La extracción de antocianinas de arándanos se realizó utilizando nuestro método anterior de Huang et al. [25]. Los arándanos ojo de conejo congelados se mantuvieron a temperatura ambiente hasta que se descongelaron. Luego, se batieron a 10 000 rpm durante 30 s utilizando un homogeneizador ULTRA-TURRAX básico T18 (IKA Works Guangzhou, China). Luego se remojó una cantidad de 250 g de arándanos en una solución de 1000 mL de metanol que contenía HCl al 1 por ciento durante 24 h. Luego, el extracto se recogió después de la centrifugación a 5000 × g durante 15 min. Después de la evaporación del disolvente a 40 grados en vacío, el residuo se extrajo tres veces con acetato de etilo 1:1 (v/v). La fase acuosa que contenía antocianinas se recogió y se concentró mediante evaporación al vacío para obtener el extracto bruto de antocianinas. El extracto se purificó adicionalmente con resina macroporosa AB-8 (Sigma Aldrich, Shanghai, China). Para eliminar la fructosa y la proteína, el extracto se sometió a cromatografía en columna sobre 1000 g de resina macroporosa AB-8 durante 24 horas y luego se eluyó con agua bidestilada. La fracción de antocianina se eluyó con etanol al 80 por ciento que contenía una solución de HCl al 1 por ciento, se concentró al vacío y luego se secó usando un secador por congelación Eyela FDU-1200 (Tokyo Rikakikai, Japón) para obtener un extracto de antocianina de arándano (BAE) polvo.

2.4. Cultivo celular y tratamientos.

Las líneas celulares HepG2, derivadas de un carcinoma hepatocelular humano específico y diferenciado, tienen una alta proporción de proteínas específicas del hígado. Por esta razón, se utilizan comúnmente como modelos de laboratorio para estudios de células hepáticas humanas [26]. Las células HepG2 se cultivaron en DMEM que contenía D-glucosa normal (5,5 mM) complementado con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de penicilina-estreptomicina y se mantuvieron a 37 grados C y 5 por ciento de incubadora con atmósfera de CO2 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Después de alcanzar el 70-80 por ciento de confluencia, se subcultivaron las células HepG2. Cuatro horas antes del experimento, las células HepG2 se inactivaron en un medio de suero reducido. Después del pretratamiento con 5 ug/ml de Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal o BAE durante 24 h, las células se expusieron a concentraciones de glucosa normales (5,5 mM) o altas (30 mM) para imitar condiciones normales y diabéticas. Las células se prepararon para análisis Western Blot y los sobrenadantes se recogieron para análisis ELISA.

2.5. Animales y diseño experimental

Ratones macho sanos C57BL/6J (20 ± 2 g) de GemPharmatech (Nanjing, Jiangsu, China) se mantuvieron en condiciones estándar de laboratorio, incluida una temperatura constante de 25 grados y una alternancia de día y noche 12-h. El Subcomité de Cuidado y Uso de Animales de Investigación de la Academia de Ciencias Agrícolas de Jiangsu había aprobado previamente todos los procedimientos experimentales con animales. Se utilizó una dieta rica en grasas y estreptozotocina (STZ) para inducir la DM2 en los modelos animales según el método utilizado por Islam y Loots [27]. Todos los ratones fueron alimentados con una dieta rica en grasas y azúcares excepto el grupo de control que consumió una dieta normal. Después de 4 semanas, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 12 horas y se les inyectó por vía intraperitoneal 100 mg/kg de STZ disueltos en solución tampón de citrato de sodio (pH 4,2-4,5). Una semana después de la inducción de STZ, se tomaron muestras de sangre de la vena de la cola de los ratones que habían ayunado durante la noche. Los ratones que presentaban síntomas diabéticos que incluían poliuria, polidipsia e hiperglucemia (nivel de glucosa en sangre en ayunas > 11,1 mmol/l) se reconocieron como DM2 y se usaron para estudios futuros. Para verificar la estabilidad de T2DM del modelo, todos los ratones fueron alimentados con una dieta normal durante una semana. Los ratones normales se usaron como grupo de control. Luego, los ratones diabéticos se dividieron aleatoriamente en tres grupos: modelo, BAE de dosis baja (100 mg/kg) y BAE de dosis alta (400 mg/kg). Durante 6 días consecutivos, se administró la administración intragástrica del mismo volumen de solvente (100 μL), 100 mg/kg o 400 mg/kg de BAE al grupo de control, al grupo modelo, al BAE de dosis baja y al BAE de dosis alta. respectivamente. En el séptimo día, se midieron el peso corporal y la glucosa en sangre en ayunas. La misma administración intragástrica continuó durante 5 semanas. Luego, los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche y se recolectaron muestras de sangre para la preparación de suero de la vena cava inferior y se almacenaron a -20 grados. Después del muestreo de sangre, todos los ratones fueron anestesiados y sacrificados. Los tejidos de hígado, bazo, riñón y timo de los ratones se extrajeron, pesaron y almacenaron a -80 grados para experimentos posteriores.

2.6. Detección de viabilidad celular

La viabilidad celular se determinó por el método MTT. Se usaron cinco ug/ml de Mv, Mv{{0}}glc, Mv-3-gal o BAE para el pretratamiento de las células durante 24 h. A continuación, las células se trataron con glucosa 5 mMo o 30 mM durante 24 h y se añadieron 10 μl al 0,5 por ciento (5 mg/ml) de MTT a las células que luego se cultivaron de nuevo. Después de 4 h, se eliminó la solución de MTT y se agregaron 100 μL de sulfóxido de dimetilo (DMSO) antes de agitar la mezcla lentamente durante 10 min para disolver el cristal celular. La absorbancia a 490 nm se midió en un lector de microplacas StatFax-2100 (Awareness Technology Inc., Plam, FL, EE. UU.) para obtener los valores de densidad óptica (DO). Las células cultivadas con niveles normales de glucosa (5,5 mmol/l) se utilizaron como grupo de control, mientras que los pocillos sin células se utilizaron como blanco. Se usó la siguiente fórmula para determinar la viabilidad celular: Viabilidad celular (porcentaje)=(valor de OD del grupo de muestra-valor de OD del grupo en blanco)/(valor de OD del grupo de control-valor de OD del grupo en blanco) x 100 por ciento.

2.7. visualización de fluorescencia ROS

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células HepG2 se evaluaron utilizando el kit de detección DCFH-DA. Después de un tratamiento inicial con 5 ug/mL de Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal o BAE durante 24 h, que luego fue seguido por un tratamiento con 5 mM o 30 mM de glucosa durante 24 h, las células se lavaron con PBS y luego se añadió DCFH-DA 10 μM a cada pocillo y se dejó reaccionar durante 20 min a 37 grados. Las células se lavaron nuevamente a fondo con PBS y luego se observó inmediatamente un grupo de estas células bajo un microscopio fluorescente invertido IX53 (Olympus, Tokio, Japón) con filtros de emisión de 530 nm y excitación de 485 nm. Las imágenes se presentan con un aumento de 200×. Después de la disociación, se recolectó otro grupo de células y se registró su fluorescencia mediante un lector de microplacas multimodo Synergy H4 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, EE. UU.). Se anotó la intensidad de fluorescencia total de las células en cada pocillo y se midió la generación de ROS como un pliegue del control.

2.8. ELISA

Se utilizaron kits ELISA para cuantificar las proteínas implicadas en la gluconeogénesis (FOXO1, G6Pase, p-GS), la glucogenólisis (p-GSK3), el transportador de glucosa (GLUT2), la lipogénesis (ACC y HMGCR) y la lipólisis (HSL) en los sobrenadantes de HepG2 células. También se determinó la cantidad de GLUT2 en hígados de ratones. El kit de ensayo de proteínas BCA se utilizó para cuantificar la proteína celular total del sobrenadante. La absorbancia a 450 nm se midió a 37 grados en un lector de microplacas StatFax-2100 (Awareness Technology Inc., Plam, FL, EE. UU.) para determinar los niveles de proteína.

2.9. Análisis de transferencia Western

Se realizó transferencia de Western en lisados ​​de HepG2 para medir el nivel de proteína de AMPK, p-AMPK, gluconeogénesis (PGCl, PEPCK, glucogenólisis (GS, p-GS) y lipólisis (ACC, p-ACC, SREBP{{4} }c) en las células. También se realizó transferencia Western para determinar las cantidades de AMPK,p-AMPK en los hígados de ratones inducidos por diabetes. Se utilizó GAPDH o -Actina como control de carga. Imágenes LAS-3000 (Fuji, Tokio, Japón) para observar las bandas de proteínas, y su densidad se cuantificó utilizando el software Bio Profile 1D plus plus (Vilbert Lour-mat, Marne La Vallee, Francia) Todos los datos se expresaron como un cambio de pliegue a el control.

2.10. Ensayo de glucosa en sangre en ayunas y tolerancia a la glucosa

La glucemia en ayunas se midió una vez a la semana durante un período de 5 semanas después de un período de ayuno de 12- horas. Para el ensayo de tolerancia a la glucosa, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 16 h y se alimentaron con 2 g/kg de glucosa al 20 por ciento (200 μL) por vía intragástrica (ig) para determinar la glucosa en sangre a 0 ,0.5,1,1.5 y 2h. La sangre se recogió de la vena de la cola y los niveles de glucosa se midieron usando un glucómetro (Sinocare, Changsha, China). También se midió el nivel de glucosa en la orina de los ratones que recibieron ig durante un período de cinco semanas.

2.11.Estimación de índices bioquímicos séricos y actividad enzimática en hígado de ratón

Se midió la cantidad de insulina, triglicéridos y colesterol total en suero, mientras que la actividad enzimática SOD y GSH-PX se estimó utilizando los kits comerciales según el protocolo del fabricante. La absorbancia a 500 nm para los triglicéridos (TG) y el colesterol total (TCH), y a 450 nm para los demás (insulina, SOD y GSH-PX) se midió a 37 grados en un lector de microplacas StatFax-2100 (Awareness Technology Inc., Plam, FL, EE. UU.).

2.12. análisis estadístico

Todos los datos se presentan como el valor medio ± desviación estándar (DE) de al menos tres experimentos independientes. Las cifras se obtuvieron usando GraphPad Prism Versión 8 (GraphPad Software, Inc., CA, EE. UU.). Se realizaron análisis de varianza unidireccional (ANOVA), pruebas t o prueba de comparaciones múltiples de Sidak para determinar las diferencias estadísticas entre diferentes grupos. Las diferencias se consideraron significativas en P<>

Este artículo está extraído de https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.102100 Recibido el 21 de julio de 2021; Recibido en forma revisada el 9 de agosto de 2021; Aceptado el 11 de agosto de 2021