La pinocembrina mejora la insuficiencia cardíaca posterior al infarto mediante la activación de la vía de señalización Nrf2/HO-1, parte 2

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análisis estadístico

las variables se representaron como media ± error estándar mientras que las variables proporcionales se mostraron como porcentaje. Las comparaciones en todos los grupos se realizaron mediante el uso de un análisis de varianza (ANOVA) de una vía corregido por una prueba post hoc de Tukey, excepto en los datos de ecocardiografía que se analizaron mediante ANOVA de dos vías corregido por la prueba de diferencia mínima significativa de Fisher. un valor p<0.5 was="" defined="" as="" statistical="">

Resultados Pino mejoró el deterioro de las funciones cardíacas inducido por la IC En primer lugar, implementamos la ecocardiografía para determinar el establecimiento del fenotipo de la IC inducido por la ligadura de la DA y los efectos ejercidos por Pino sobre las funciones cardíacas. Los ecocardiogramas bidimensionales en modo M representativos de todos los grupos se ilustraron en la figura 2A. 6-semanas de alimentación sin desechos después de la ligadura de la DA produjeron manifestaciones significativas de IC, evidenciadas por una reducción de la FEVI y la FS, y un aumento de los LVID, LVIDd, LVESV, LVEDV en la semana 6 y 8 versus el grupo simulado, respectivamente, además del aumento de la concentración sérica de BNP y el peso del corazón/longitud de la tibia en la semana 8 que demostraron disfunción cardíaca e hipertrofia (Fig. 2B, C), con los parámetros específicos , se ilustran en la Tabla 1). Sin embargo, todas las manifestaciones se revirtieron parcialmente con la aplicación de Pino frente al grupo HF en la octava semana, lo que sugiere el papel saludable de Pino en las funciones cardíacas.

después de PIHF. Además, se notó que aunque Pino alteró las funciones cardíacas basales en la sexta semana hacia una dirección de mejoría, las alteraciones no alcanzaron significación. Por lo tanto, se planteó la suposición de que si la aplicación a largo plazo de Pino podía conducir a mejoras importantes, se necesitaba más investigación.

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Pino atenuó la remodelación de PIHF Dado que la capacidad regenerativa de los cardiomiocitos era escasa o nula, las mejoras de las funciones cardíacas se atribuyeron más a la mejora de los cardiomiocitos y tejidos vivos por parte de Pino que a la regeneración de los cardiomiocitos. Por lo tanto, evaluamos además 3 factores clave en la remodelación de PIHF: fibrosis, neovascularización y apoptosis, como se sugirió anteriormente (Wang et al 2010). Pino disminuyó drásticamente la deposición de fibras de colágeno en la zona del borde MI en aproximadamente 2 pliegues (Fig. 3A). Además, para evitar el sesgo artificial en el juicio de la zona del borde del infarto, establecimos un modelo idéntico como control positivo, en el que Pino fue reemplazado por enalapril, un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) conocido por revertir la remodelación de la IC. Observamos la extensión de la fibrosis en los grupos IC e IECA.

alcanzó porcentaje aproximado versus modelos preestablecidos. También marcamos la región del infarto donde el gran colágeno depositado sustituyó al miocardio (Archivo adicional 1: Figura S1). Además, Pino compensó la rarefacción crónica inducida por HF de la distribución y expresión de VEGFR2 (Fig. 3B). Estudios previos han revelado que la proteína p53, que podría activar una diversidad de genes proapoptóticos, desempeñó un papel clave en la antiangiogénesis a través de la inhibición del factor 1 inducible por hipoxia (HIF-la)(Gogirajuet al.2019; Guo et al. .2015). Luego observamos la sobreexpresión de la proteína p53 en el grupo HF, que fue contrarrestada por Pino (Fig. 3C), lo que explica en parte la alteración de VEGFR2. También realizamos un experimento de transferencia Western en el que la administración de Pino reguló al alza la expresión de la proteína antiapoptótica BCL-2 y, por el contrario, reguló a la baja las proteínas proapoptóticas, incluidas p53, Bax y la caspasa escindida-3, junto con un aumento de la relación bcl-2/bax frente al grupo HF, lo que indica la activación del procedimiento de apoptosis, que también fue confirmado por el ensayo TUNEL, donde Pino demostró un efecto inverso en la tasa de apoptosis (Fig. 3D). En conclusión, Pino mejoró la remodelación post-IM por sus conocidos efectos que incluyen antifibrosis, angiogénesis y antiapoptosis.

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Pino alivió OS mediante la modulación de las vías Nrf2/HO-1 Sin embargo, los mecanismos por los cuales Pino resultó en tales alteraciones permanecieron sin definir. La acumulación de estudios ha demostrado que la OS que modificó una amplia variedad de moléculas y desencadenó vías de señalización de remodelación adversas pudo conducir a la apoptosis y la fibrosis en modelos de IC (Dubois-Deruy et al.2020; Bubb et al.2017; Wang et al.2010 ; Chen et al.2020b), por lo tanto, planteamos la hipótesis de que Pino mejoró PIHF a través de la mitigación de OS. En primer lugar, investigamos la generación de ROS en los tejidos cardíacos, así como la SOD y la MDA en el suero mediante pruebas bioquímicas y de fluorescencia, respectivamente, para determinar las funciones antioxidantes de Pino en la insuficiencia cardíaca. A la expectativa, Pino eliminó parcialmente las ROS generadas por enfermedades crónicas.

HF, manifestada por una reducción de la intensidad de fluorescencia de DHE (Fig. 4A, B). Además, la enzima antioxidante, SOD, aumentó mediante la aplicación de Pino, mientras que la MDA, que sugiere peroxidación lipídica, disminuyó (Fig. 4B). Los datos anteriores testificaron el papel antioxidante de Pino en un modelo de PIHF en roedores.

Si bien el efecto depurador de ROS de Pino era seguro, los mecanismos subyacentes a la mejora de la defensa antioxidante aún necesitaban aclaración. Nrf2 es un componente dominante de la defensa antioxidante endógena que se disocia con su inhibidor de la proteína 1 asociada a ECH Kelch-lick (Keapl) ante el estrés/estímulos y se traslada al núcleo para unirse a la región promotora del elemento de respuesta antioxidante (ARE), facilitando la expresión de una plétora de genes y enzimas antioxidantes, entre los cuales el HO-1 fue la enzima representativa y tiene un papel vital (Ma et al. 2019; Bubb et al. 2017; Habtemariam 2019; Velusamy et al. 2020 ;Tian et al.2019). HO-1, codificado por HMOX1, cataliza el hemo para que se descomponga en 3 moléculas antioxidantes, incluidas biliverdina, bilirrubina y monóxido de carbono (CO) (Wang et al.2010; Kishimoto et al.2019). Estudios previos han demostrado que la activación específica o la sobreexpresión de Nrf2 o HO-1 mejoró PIHF (Ma et al.2019; Bubb et al.2017; Wang et al.2010), y por otro lado, Pino podría centrarse en la vía Nrf2/ARE para ejercer efectos protectores sobre la depresión (Wang et al.2020), la neurotoxicidad (Jin et al. 2015), etc., con la interacción indefinida en un modelo PIHF. Investigamos más a fondo esta interacción por western blot. PIHF contribuyó a la reducción de la expresión general de Nrf2 y HO-1 frente al grupo simulado. Y Pino revirtió significativamente este efecto pernicioso mediante la regulación positiva de Nrf2 además de una capacidad para aumentar la expresión de HO-1 en una fuerte predisposición aunque la diferencia no alcanzó una significación (p=0.0845; Fig.4C ). Los resultados indicaron un papel para Pino en la activación de la vía Nrf2/HO-1 responsable de la mejora de las funciones cardíacas y la remodelación en PIHF.

El bloqueo in vitro de Nrf2 eliminó los efectos de Pino en cardiomiocitos H9c2

Para testificar aún más que los efectos de Pino eran dependientes de la vía Nrf2/HO-1 en lugar de una mejora integral del estado patológico de la insuficiencia cardíaca, cultivamos cardiomiocitos H9c2 como los métodos informados anteriormente y utilizamos un inhibidor específico de Nrf2, ML385 in vitro. Pino atenuó la acumulación de ROS inducida por ISO junto con un aumento de SOD y una disminución de MDA en el medio en un patrón de respuesta similar al in vivo (Fig. 5). Sin embargo, todos los efectos fueron casi anulados por la administración de ML385, lo que sugiere que el efecto antioxidante de Pino se presentó predominantemente por la activación de Nrf2. Además, esta ruta dependiente de Nrf2/HO-1

el efecto se determinó aún más debido a la reducción de la expresión de Nrf2 y HO-1 en el grupo ISO más Pino más ML385 (Fig. 6). También fue notable que la capacidad de eliminación de ROS de Pino disminuyó ya que las eficacias de Nrf2 se presentaron principalmente por defensa oxidante. Una posible explicación de este fenómeno fue que un desequilibrio de la homeostasis redox generó un exceso de ROS más allá de la capacidad máxima de eliminación de 25 uM de Pino.

Posteriormente, realizamos un western blot de cardiomiocitos H9c2 para investigar el desequilibrio de redox.

la homeostasis resultante de ML385 fue responsable de una susceptibilidad aumentada para la remodelación. La administración de Pino mostró efectos paralelos en la antifibrosis, antiapoptosis, evidenciados por una disminución de colágeno I, p53, Bax, caspasa escindida-3 así como un aumento de BCL-2 (Fig. 6A , B). Además, la CCK-8 sugirió la inhibición de la actividad de los CMF por parte de Pino, sobreviniendo la reducción de la secreción de colágeno que se probó mediante el western blot de CMF. Además, la reversión de todas estas presentaciones por ML385 in vitro demostró aún más que Nrf2/HO-1 era el objetivo principal de Pino en la mejora de PIHE.

Discusión

En el presente estudio, determinamos que el tratamiento con Pino fue beneficioso para PIHF a través de los efectos antioxidantes. Pino mejoró las funciones cardíacas y la remodelación resultante de PIHF mediante la eliminación de ROS y la activación de la vía Nrf2/HO-1 que atenuó aún más los factores clave de la remodelación ventricular, incluida la deposición de fibras de colágeno y la apoptosis, y facilitó la neovascularización en una regulación negativa de la proteína p53. manera dependiente.

Antioxidantes Y HF

Se presenta un consenso de que la OS agravó la disfunción y la remodelación en la IC (Galli y Lombardi 2016; Dubois-Deruy et al. 2020; Velusamy et al, 2020; Tian et al. 2019; Kishimoto et al. 2019), también hay una serie de experimentos y ensayos realizados para los efectos de los antioxidantes con los que se han descubierto y estudiado cada vez más dianas moleculares y nuevos fármacos. Sin embargo, además de varios antioxidantes probados en ensayos clínicos que predispusieron a mostrar invalidez o incluso un mayor riesgo de IC (Lee et al. 2005; Made et al. 2015; Olesen et al.2014; Lonn et al. 2005), numerosos objetivos moleculares, como las quinasas, los microARN (Tian et al.2020; Vagnozziet al.2013; Pfister et al. 2014), etc., tienen muchas dificultades para transferirse de experimentos básicos a ensayos, e incluso aplicación clínica debido a la fabricación y seguridad.

En contraste, Pino tiene las siguientes ventajas que prometen ser un antioxidante auxiliar en la terapia de HF: (i) eficacia antioxidante significativa que ha sido testificada en estudios previos y en nuestra investigación actual; (ii) Pino podría extraerse de una serie de fuentes naturales plantas, miel y propóleos o ser sintetizados artificialmente, lo que aseguró la suficiencia para la producción y un precio relativamente barato; (ii) la riqueza de Pino en miel y propóleos indicó una ingesta dietética por conveniencia. De hecho, se realizó un ensayo clínico de fase I reciente para proporcionar Pino a sujetos sanos en el que Pino mostró buena tolerancia y seguridad (Cao et al. 2015). Además, Pino ha sido aprobado en la terapia del accidente cerebrovascular isquémico por la Administración de Drogas y Alimentos de China con un ensayo clínico de fase II en ejecución (Shen et al. 2019). Estos avances logrados nos hacen esperar una mayor aplicación de Pinon en más y más enfermedades con la participación de PIHF.

Los papeles de Pino en HF

Hasta donde sabemos, este estudio actual fue la primera investigación para investigar los roles de Pino en un modelo de roedor de PIHF. Aunque los efectos de Pino se exploraron ampliamente en una plétora de modelos, solo unos pocos estudios pusieron énfasis en la asociación entre Pino y enfermedades cardiovasculares, incluido el infarto de miocardio, la lesión por isquemia/reperfusión y las arritmias (Ye et al. 2019; Zheng et al. 2020), lo que limitó nuestra comprensión de la protección al corazón conferida por Pino. Además, como se demostró anteriormente, Pino mostró eficacias antifibrosis, -apoptosis, inflamación y antioxidantes que también fueron objetivos vitales de la terapia en PIHF. Dado que una de las vías de inflamación, la vía del factor nuclear-kappa B/factor de necrosis tumoral- (NF-KB/TNF-) ha sido investigada en nuestro grupo (Ye et al.2019), por lo tanto, en este estudio, nos centramos en varios factores que deterioran las funciones cardíacas y la remodelación compuesta por apoptosis, estrés oxidativo, fibrosis y rarefacción de la neovascularización. Como era de esperar, el poscondicionamiento de Pino, que fue de gran importancia, mitigó la apoptosis y la fibrosis de una manera dependiente de los antioxidantes. También observamos angiogénesis dependiente de VEGFR2-que proporcionaba oxígeno y nutrientes a los cardiomiocitos para facilitar la supervivencia, análoga a la provocada por Pino en un modelo de la enfermedad de Alzheimer (Liu et al. 2014). Sin embargo, persistía la controversia de que Pino fue autenticado para suprimir la unión de VEGFR2, la migración de capilares y la germinación (Cuevas et al.2015; Tian et al.2014), por lo que Pino podría utilizarse para obstaculizar la proliferación del cáncer como un nuevo fármaco latente. Por lo tanto, la neovascularización en la zona del borde del infarto probablemente se debió a la recuperación de otros factores más que al impacto directo de Pino. La proteína P53 regulada positivamente en PIHF podría explicar la alteración en parte. También se desconocía si Pino afectaba a otros factores que podrían modular la angiogénesis, como la proteína quinasa B (AKT). Por lo tanto, los mecanismos subyacentes de neovascularización conferidos por Pino en PIHF necesitaban más investigación para ser aclarados.

Pino predominantemente modula la vía Nrf2/HO-1 en PIHF

La vía Nrf2/HO-1 fue un mecanismo dominante para soportar los daños causados ​​por el sistema operativo. Ha quedado bien establecido que Pino podría mejorar la OS al promover la expresión general de Nrf2 y HO-1 y la translocación de Nrf2 del plasma al núcleo, que también fue la razón por la que elegimos esta vía como candidata. Sin embargo, el efecto ejercido por Pino en la vía Nrf2/HO-1 se debió a la activación directa o a la modulación indirecta después de que la mejora del estado general permaneciera sin definir. Por lo tanto, en esta investigación, determinamos que Nrf es el objetivo principal de Pino a través de la inhibición de Nrf2 por ML385, lo que casi revierte los efectos saludables de Pino sobre la fibrosis, la apoptosis y la angiogénesis. Sin embargo, esta asociación realizada in vitro requirió más investigaciones donde el inhibidor de Nrf2 o siRNA o virus transfectados para silenciar genes fue necesario para ser aplicado in vivo. Además, también observamos que ML385 suprimió la eliminación de ROS, sobre lo cual presentamos la suposición de que la homeostasis redox desequilibrada provocó una generación excesiva de ROS más allá de la capacidad de Pino a una concentración de 25 μM. Para dar testimonio de esta suposición, se propuso organizar un gradiente de concentración para detectar si suficiente Pino podía contrarrestar la producción de ROS causada por el bloqueo de la vía Nrf2/HO-1. Dado que la generación de ROS generalmente se atribuye a la fuga electrónica de la mitocondrial, la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxigenasa activada, el desacoplamiento de la óxido nítrico sintasa y la acumulación de productos de glicosilación avanzada, se podrían realizar estudios más profundos para explorar los mecanismos detallados por los cuales Pino obstaculizó las ROS. generación y eliminó la acumulación de ROS.

Limitaciones de estudio

El presente estudio tiene varias limitaciones. Debemos reconocer que hubo un sesgo subjetivo de la definición de la zona límite del infarto que podría afectar intensamente la precisión de los resultados. Para solventar esta limitación, los tramos patológicos fueron elegidos por 3 personas que, sin embargo, no podían prescindir del todo del sesgo. Además, pocas imágenes de Western blot mostraron múltiples bandas atribuidas a los anticuerpos primarios policlonales que tuvieron un impacto negativo en la calidad de las figuras. También se notó que utilizamos el inhibidor de Nrf2, ML385, en lugar de la transfección de siRNA o adenovirus de Nrf2, lo que resultó en menos persuasión. Por último, pero no menos importante, los mecanismos antioxidantes de Pino eran complicados, lo que requería más investigación para dilucidar más.

Conclusión

En conclusión, la administración de Pino mejoró la insuficiencia cardíaca inducida por infarto de miocardio, evidenciada por la mejora de las funciones cardíacas y la remodelación estructural, incluida la fibrosis, la apoptosis y la neovascularización, en parte a través de la atenuación de OS, en una vía Nrf2/HO-1- manera dependiente.

Este artículo está extraído de Chen et al. Mol Med (2021) 27:100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7