Identificación y análisis funcional de una bifavona como nuevo inhibidor de los procesos aterogénicos dependientes de vaniloide 4 de potencial receptor transitorio

Por favor contactaroscar.xiao@wecistanche.compara saber mas

Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei y Shaik O. Rahaman

La aterosclerosis, una enfermedad inflamatoria progresiva de las grandes arterias, constituye el factor que más contribuye a la creciente carga de morbilidad y mortalidad relacionadas con las enfermedades cardiovasculares en todo el mundo1. El evento inicial fundamental que conduce a la aterosclerosis implica la retención de partículas de lipoproteínas de baja densidad modificadas (LDLox) en los espacios de la íntima aórtica subendotelial, principalmente en los puntos de ramificación arterial2. Durante la aterogénesis temprana, después de la disfunción endotelial, los monocitos sanguíneos circulantes transmigran a las áreas íntimas y se diferencian en macrófagos tisulares3. En los espacios de la íntima aórtica, la unión y captación de oxLDL por parte de los macrófagos con la ayuda de receptores depuradores como SRA y CD36 crea un bucle ateroinflamatorio de avance que da como resultado el desarrollo de células espumosas cargadas de lípidos, un proceso crítico en la aterosclerosis2–8. Las cascadas de eventos inflamatorios provocadas por las células espumosas conducen a la formación de una estría grasa temprana y eventualmente a la aparición de lesiones de aterosclerosis avanzada caracterizadas por la presencia de capa fibrosa, tejido calcificado, células inmunes, proteínas de matriz y lípidos2–10. El potencial de receptor transitorio Vanilloid 4 (TRPV4) de la subfamilia TRPV, un canal catiónico polimodal no selectivo permeable a Ca2 plus, se expresa de manera ubicua en varios tipos de células, incluidos los macrófagos11–24. Anteriormente conocido como osmosensor, ahora se sabe que TRPV4 responde a diversos estímulos bioquímicos y biomecánicos, incluidos el calor, la rigidez de la matriz, la osmolaridad, los factores de crecimiento, el pH y los ésteres de 4 forboles11–24. Se informa que TRPV4 media varias funciones fisiológicas, como la sensación de dolor en la inflamación y las neuropatías18,22,23, la diferenciación y migración de miofibroblastos17,25,26 y la diferenciación de osteoclastos en el hueso27. Las mutaciones de TRPV4 se han asociado con varias canalopatías28–31. Estudios recientes de nuestro grupo y otros han implicado un posible papel de este canal en innumerables condiciones patológicas como lesiones pulmonares22,32, formación de células espumosas14,16, fbrosis tisular17,33, respuesta a cuerpos extraños13 y cáncer34,35. Previamente, se demostró una función ateroprotectora de TRPV4, en la que la función de TRPV4 inducida por agonistas químicos en células endoteliales se asoció con la activación de eNOS y la inhibición de la adhesión de monocitos a células endoteliales36. Por el contrario, las deficiencias en las funciones de TRPV4 se han relacionado con numerosas respuestas ateroinflamatorias que incluyen disfunción endotelial, generación reducida de células espumosas de macrófagos y enfermedades vasculares14,16,37–39. Nuestro laboratorio ha identificado recientemente un papel proaterogénico de TRPV4 mediante el cual regula la formación de células espumosas de macrófagos inducida por oxLDL. Mecánicamente, demostramos que TRPV4 afecta la absorción pero no la unión de oxLDL en macrófagos de una manera independiente de CD36-14. En otro estudio, informamos una exacerbación dependiente de TRPV4-de la formación de células espumosas inducida por LDLox en presencia de lipopolisacárido y aumento de la rigidez de la matriz, lo que proporciona un vínculo entre la detección mecánica y el riesgo de aterosclerosis16. Considerados en conjunto, estos hallazgos sugieren que TRPV4 es un objetivo atractivo en la aterosclerosis y otras enfermedades, lo que incentiva el descubrimiento de inhibidores de molécula pequeña de TRPV4 que pueden traducirse en terapias clínicamente efectivas. Los usos de compuestos naturales en la terapéutica han ganado protagonismo, impulsados ​​principalmente por la necesidad de compuestos rentables y biocompatibles en comparación con las drogas sintéticas existentes en la actualidad. Compuestos naturales comoflavonoides, alcaloides,polifenoles, y los curcuminoides, afectan las enfermedades cardiovasculares a través de diversos mecanismos, como la inhibición deproinflamatorioseñales, sensibilización a la insulina y mejora de los perfiles de lípidos en sangre al dirigirse a las vías AMPK, COX1/2, eNOS y Nrf240–45. Estudios recientes de varios grupos han identificado dos flavonoides, la berberina y la apigenina, como moduladores potenciales de la actividad de TRPV446,47. Hemos desarrollado y utilizado un método de detección de rendimiento semialto para identificar antagonistas potenciales de TRPV4 de una biblioteca de compuestos naturales utilizando un ensayo de entrada de Ca2 basado en un lector de placas de imágenes fluorométricas (FLIPR). En este documento, informamos sobre la identificación y el análisis funcional de Linkedin, una flavona, como un nuevo inhibidor de los procesos aterogénicos dependientes de TRPV4-en los macrófagos, lo que sienta las bases para futuros estudios de este compuesto natural como un pequeño antiaterosclerótico natural. compuesto molecular. Se ha informado que Linkedin muestra neuroprotectores,anticancerígeno, yantiinflamatoriopapeles48,49. Presentamos el mecanismo de acción de Linkedin contra TRPV4 en el marco de la formación de células espumosas de macrófagos utilizando numerosos ensayos bioquímicos y celulares.

Por favor haga clic aquí para saber más

Materiales y métodos Cultivo animal y celular.

Compramos ratones congénicos C57BL/6 de tipo salvaje (WT) de Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, EE. UU.). Se siguieron las pautas del Comité de uso y cuidado de animales de la Universidad de Maryland para todos los experimentos con animales y los autores cumplieron con las pautas de ARRIVE. Para el aislamiento de macrófagos residentes murinos inducidos por tioglicolato (MRM), se recogió lavado peritoneal después de 4 días de inyección intraperitoneal de tioglicolato, y las células se mantuvieron en suero fetal bovino (FBS) al 10 % que contenía DMEM7,14,16. Se adquirieron una línea celular de macrófagos murinos (RAW264.7) y fibroblastos dérmicos humanos (HDF) de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron, respectivamente, con DMEM o MEM (Gibco, Waltham, MA). Se recolectaron macrófagos derivados de médula ósea murina (BMDM) de ratones de 6- a 7-semanas de edad, como se describió anteriormente14,50,51. Brevemente, se recolectaron fémures de ratones WT y TRPV4 KO, y se lavó la médula ósea de los fémures con medio DMEM completo con FBS al 10 por ciento. Las células de médula ósea suspendidas se filtraron a través de un filtro de 70 µm (BD bioscience), se centrifugaron y se mantuvieron en medio DMEM suplementado con M-CSF (25 ng/mL) durante 7–8 días a 37 grados para permitir la diferenciación en macrófagos.

reactivos

Linkedin y GSK1016790A (GSK101) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), y el kit de ensayo FLIPR Calcium 6 se obtuvo de Molecular Device (Sunnyvale, CA). La LDL nativa humana (VLDL) se adquirió de Stemcell Technologies (Vancouver, Canadá). Incubamos LDL con CuSO4 5 µM durante 12 h a 37 grados para preparar LDL oxidada con cobre (oxLDL)7,14,16. La DiI-oxLDL marcada con colorante fluorescente se adquirió de Invitrogen (Carlsbad, CA) y la MCSF de R&D (Minneapolis, MN). Los anticuerpos para el análisis FACS fueron: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 y TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). Los anticuerpos secundarios conjugados con PE procedían de R&D (Minneapolis, MN), y los controles de isotipo conjugados con PE eran de BD (Franklin Lake, NJ). Para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qRT-PCR), utilizamos el kit RNeasy de QIAGEN (Redwood City, CA). Todos los cebadores se adquirieron de Bio-Rad (Hercules, CA). Los medios de cultivo celular, los productos relacionados con el cultivo celular y los reactivos de transferencia Western se obtuvieron de Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).

Cistanche para antifatiga

Cribado de rendimiento semialto

Realizamos un cribado de semi alto rendimiento para antagonistas de Trpv4 de una biblioteca de 2000 compuestos naturales (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) utilizando un ensayo de flujo de calcio basado en un lector de placas de imágenes fluorométricas (FLIPR)14,17. Identificamos a la ginkgetina (GGT), como un nuevo antagonista de TRPV4. El cribado primario y secundario se realizó con RAW264.7, HDF y BMDM para evaluar la capacidad de Linkedin y otros candidatos para inhibir la entrada de Ca2+ provocada por TRPV4-14,17. Como controles, utilizamos A23187, un ionóforo de calcio, BMDM nulos para TRPV4 y GSK219, un antagonista selectivo de TRPV417. Después de la selección secundaria, identificamos seis compuestos que mostraban una inhibición de más del triple de la entrada de Ca2 mediada por TRPV4-en comparación con el control del vehículo. Linkedin fue identificado como el inhibidor más potente de la actividad de TRPV4. Se sembraron BMDM (5 × 104 células/pocillo) en placas negras de fondo transparente 96-bien recubiertas con colágeno (10 µg/ml) y se incubaron a 37 grados, 5 por ciento de CO2. El día del experimento, las células se cargaron con tinte de calcio 6 en HBSS, HEPES 20 mM, probenecid 2,5 mM y se incubaron durante 45 min a 37 grados. Después de la incubación, se añadieron los compuestos de la biblioteca a cada pocillo hasta una concentración final de 2 µM. Las placas se incubaron durante otros 45 min a 37 grados. La entrada de Ca2 más se indujo mediante la adición de 10 nM de agonista de TRPV4 GSK1016790A en células pretratadas con vehículo o compuesto y se registró midiendo ΔF/F (Máx.-Mín.), como se describió previamente17. Los datos se muestran como unidades relativas de fluorescencia (RFU).

inmunotransferencias

Se sembraron macrófagos peritoneales provocados por tioglicolato en FBS al 10 por ciento que contenía DMEM y se incubaron durante la noche. Se lavaron las células no adheridas y se añadió a la placa un 1 por ciento de albúmina de suero bovino (BSA) que contenía DMEM y se incubó durante 3 h antes del tratamiento con Linkedin. Para determinar la expresión de las proteínas CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 y GAPDH, se prepararon lisados ​​de células completas a partir de células tratadas durante la noche con Linkedin (1 y 5 µM) o vehículo en presencia o ausencia de oxLDL (25 µg/ml). ). Para determinar los niveles de expresión de p-JNK y JNK activados por LPS, las células se pretrataron con Linkedin (5 y 10 µM) durante 3 h y luego se estimularon con E. coli LPS durante 30 min. Se prepararon lisados ​​de células enteras a partir de células lavadas dos veces (PBS enfriado con hielo) utilizando tampón RIPA con cóctel de inhibidor de proteasa añadido (Thermo Scientific, MA). Las transferencias se analizaron con anti-TRPV4 de conejo (Alomone Lab, Jerusalén, Israel), anti-CD36 de ratón (R&D, Minneapolis, MN), anti-TLR4 de conejo, anti-TLR6 de conejo, anti-JNK de conejo y anti-p-de conejo. Anticuerpos primarios JNK (Cell Signaling, Danvers, MA) seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con HRP anti-conejo y anti-ratón (R&D, Minneapolis, MN). Se extrajeron transferencias y se volvieron a sondear con anti-GAPDH IgG (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) para el control de la carga.

Formación de células espumosas.Se sembraron MRM activados con tioglicolato en cubreobjetos de vidrio en una placa de 12 pozos con DMEM, 10 por ciento de FBS y se incubaron a 37 grados, 5 por ciento de CO2 durante 2 h. Se añadió GGT (1 o 10 µM) a las células y, después de 3 h de incubación, se añadió oxLDL (50 µg/ml) y los cultivos se incubaron durante la noche a 37 grados. Se añadió LDL nativa (50 ug/ml) a los pocillos del grupo de control y se incubó durante la noche. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento seguido de tinción con Oil Red O para cuantificar la generación de células espumosas.

Transducción del vector de adenovirus.Recolectamos construcciones de adenovirus para expresar Ad(RGD)-TRPV4 de ratón (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml), y vector en blanco de adenovirus, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), de Vector Biolabs, Malvern, Pensilvania. Usamos 1 × 108 pfu/ml para todos los experimentos. Para los estudios de generación de células espumosas, se incubaron macrófagos peritoneales de ratón con Ade-TRPV4 o Ade-Vec en medio DMEM durante 72 h antes de la adición de oxLDL para generar células espumosas de macrófagos.

Unión y captación de ox-LDL.Para evaluar la unión, los macrófagos peritoneales se trataron con dos dosis (1 o 10 µM) de Linkedin o vehículo durante 3 hy se incubaron con DiI-oxLDL a 4 grados durante una hora. Después del pretratamiento con Linkedin o vehículo, las células se incubaron con DiI-oxLDL a 37 grados durante 30 minutos para evaluar la captación. Las imágenes se capturaron mediante microscopía de fluorescencia (63x) y se utilizó la Imagen J para cuantificar los resultados.

Análisis de citometría de flujo.Los macrófagos peritoneales provocados por tioglicolato se cultivaron en DMEM, FBS al 10 por ciento durante 24 h. Las células no adheridas se eliminaron por lavado, se añadió medio sin suero y las células se incubaron durante 2 h seguido de la adición de GGT 5 µM o vehículo, y la incubación continuó durante 3 h. Las células tratadas se rasparon de la placa y se resuspendieron en PBS, BSA al 2 por ciento. Las células se incubaron con anticuerpos primarios durante 45 min seguidos de 30 min de incubación con anticuerpo secundario conjugado con PE. Se usó un citómetro de flujo FACSCantoII (BD Bioscience, Ontario, Canadá) para adquirir datos. Todos los datos fueron procesados ​​utilizando el software FlowJo.

qRT‑PCR.Los macrófagos inducidos por tioglicolato se trataron con Linkedin 5 µM o vehículo durante 3 h; Se añadieron 25 µg/ml de oxLDL al vehículo oa las células tratadas con Linkedin y se continuó la incubación durante la noche. Se usó el kit RNeasy Micro (#74,004) de QIAGEN para extraer el ARN total, y se usó un kit Universal SYBR Green One-Step de Bio-Rad para transcribir de forma inversa el ARN. Se usó un termociclador C1000 Touch (Bio-Rad) para adquirir los datos. La expresión de un gen se determinó como la cantidad de ARNm específico del gen en relación con el ARNm de GAPDH utilizando el método CT comparativo descrito en el boletín de usuario del sistema Bio-Rad qRT-PCR.

Análisis estadístico.Los datos se presentan como media ± SEM de triplicados biológicos. Se usó el software GraphPad Prism 7.0 y los cálculos se realizaron usando la prueba t de Student para dos grupos o ANOVA unidireccional para grupos múltiples.

Aprobación ética.Todos los experimentos en ratones se realizaron de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y fueron aprobados por el Comité de Revisión de la Universidad de Maryland‐College Park.

Resultados in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>triple; pags<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Figura 1. Identificación basada en cribado de rendimiento semialto de Linkedin como un nuevo inhibidor de TRPV4 de una biblioteca de compuestos naturales. (A) Diagrama de flujo que muestra el flujo de trabajo que da como resultado la identificación de la ginkgetina como un posible inhibidor de TRPV4 de una biblioteca de 2000 compuestos naturales. (B) Grabación representativa de FlexStation 3 que muestra el efecto inhibitorio de 6 compuestos naturales sobre el Ca2 inducido por el agonista TRPV4 (GSK1016790A) más la entrada en BMDM cargados con colorante de calcio 6 durante la selección secundaria. El pretratamiento con los 6 compuestos mostró efectos inhibitorios sobre la entrada de Ca2 más dependiente de TRPV4- en comparación con las células pretratadas con vehículo (control negativo; vehículo más GSK1016790A (10 nM)) o ionóforo de calcio (A23187, 2 μM). Utilizamos antagonista selectivo de TRPV4, GSK2193874 (10 nM), como control negativo. Todos los experimentos se repitieron tres veces por cuadruplicado. RFU: unidad de fluorescencia relativa.

La inhibición de TRPV4 por GGT anula la formación de células espumosas de macrófagos inducida por oxLDL.Nuestros estudios anteriores demostraron que la entrada de Ca2 más provocada por TRPV4- está involucrada en la formación de células espumosas mediada por oxLDL 14,16. Por lo tanto, evaluamos la posibilidad de que la formación de células espumosas fuera inhibida por la antagonización de la actividad TRPV4 mediada por GGT. Los macrófagos peritoneales murinos de tipo salvaje se incubaron con oxLDL para inducir la formación de células espumosas en presencia o ausencia de GGT y se analizaron mediante tinción con Oil Red O. Como era de esperar, encontramos que la generación de células espumosas aumentó cinco veces en los macrófagos tratados con oxLDL en comparación con las LDL nativas (Fig. 2A, B). Sin embargo, el tratamiento de los macrófagos con GGT (1 o 10 µM) antes de la estimulación con oxLDL disminuyó significativamente el porcentaje de células espumosas (Fig. 2A, B). En conjunto, estos hallazgos sugieren un efecto inhibitorio de la GGT sobre la formación de células espumosas de macrófagos que posiblemente se dirijan a la entrada de Ca2 más provocada por TRPV4-. Además, sobreexpresamos TRPV4 en macrófagos nulos de TRPV4 mediante el uso de una construcción de adenovirus y luego inducimos la formación de células espumosas mediante el uso de oxLDL en presencia de GGT. Encontramos que la sobreexpresión de TRPV4 aumentó la formación de células espumosas que se bloqueó cuando pretratamos la célula con GGT, lo que sugiere que la inhibición de la formación de células espumosas proaterogénicas por GGT depende de TRPV4 (Fig. 2C, D).

GGT no bloquea el nivel basal de expresión de TRPV4 y los receptores inflamatorios.El receptor Scavenger CD36 juega un papel importante en la captación y unión de oxLDL y la formación de células espumosas, procesos críticos en la aterosclerosis4–7,54,55. Recientemente, un creciente cuerpo de evidencia sugiere la participación de los receptores tipo toll en la aterosclerosis2,4,56. Para investigar si la GGT bloqueaba la formación de células espumosas al afectar la expresión de CD36, TLR4, TLR6 y TRPV4, realizamos un análisis de inmunotransferencia a dos concentraciones de GGT (1 o 5 µM). Encontramos niveles de expresión similares de CD36, TRPV4, TLR6 y TLR4 en comparación con el control no tratado (Fig. 3A-D). El análisis de citometría de flujo tampoco reveló diferencias significativas en la expresión de las proteínas en la superficie celular con o sin tratamiento con GGT (Fig. 3E-H, I-L). En conjunto, estos resultados sugieren que la GGT bloquea la formación de células espumosas de macrófagos sin inhibir los niveles basales de expresión superficial de TRPV4, CD36, TLR4 y TLR6.

Figura 2. La inhibición de TRPV4 por Linkedin anula la formación de células espumosas de macrófagos inducida por oxLDL. (A) Los macrófagos peritoneales murinos inducidos por tioglicolato se trataron durante la noche con 50 µg/ml de oxLDL, seguido de una preincubación de 3 h con vehículo o Linkedin 1 o 10 µM. Las células se trataron con 50 µg/ml de LDL nativa (VLDL) como control. Aumento original: 40x. (B) La cuantificación de los resultados se muestra en (A). n=500 celdas/condición. prueba t de Student; ***pags<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

Absorción de oxLDL, pero la GGT suprime la unión de los macrófagos. Debido a que se ha demostrado previamente que TRPV4 tiene un papel en la absorción de oxLDL y la formación de células espumosas14,16, evaluamos si el tratamiento con GGT causaba un deterioro en la unión de oxLDL en la superficie de los macrófagos. Los macrófagos peritoneales WT se trataron con GGT antes de la incubación con DiI-oxLDL a 4 grados y se evaluó la unión. Los resultados indican que el tratamiento con GGT (1 o 10 µM) no impidió significativamente la unión de oxLDL en la superficie del macrófago en comparación con el control del vehículo (Fig. 5A-C). Habiendo establecido que la GGT no inhibe la unión de oxLDL, el siguiente objetivo fue determinar si la captación de oxLDL en los macrófagos se vio afectada por el tratamiento con GGT. Curiosamente, nuestros resultados indicaron que hubo una inhibición significativa en la captación de oxLDL en macrófagos en células pretratadas con GGT en comparación con el grupo tratado con vehículo (Fig. 6A, B). Considerando todos juntos, estos resultados sugieren que la GGT bloquea la captación de oxLDL, pero no se une, en los macrófagos.

GGT bloquea la expresión de TRPV4 inducida por oxLDL en macrófagos.

Como nuestros estudios publicados anteriormente mostraron que TRPV4-provocó Ca2 plus desempeña un papel en la formación de células espumosas de macrófagos mediada por oxLDL14,16, buscamos determinar si la GGT bloqueaba la formación de células espumosas mediante la supresión de la expresión de CD36 inducida por oxLDL, TLR2, TLR4, TLR6 o TRPV4. Descubrimos que la estimulación nocturna de los macrófagos con oxLDL resultó en una regulación positiva significativa de la expresión de proteínas TRPV4 en comparación con LDL, mientras que la expresión de otros receptores (CD36, TLR2, TLR4 y TLR6) permaneció sin cambios (Figs. 4A-F). El pretratamiento de las células con GGT antes de la estimulación con oxLDL disminuyó selectivamente el nivel de expresión de las proteínas TRPV4 en comparación con el tratamiento con vehículo (Fig. 4A-F). En conjunto, estos hallazgos sugieren un efecto inhibidor de la GGT sobre la expresión de la proteína TRPV4, que puede estar en parte implicada en la supresión de la formación de células espumosas por parte de la GGT.

Figura 3. El tratamiento con Linkedin no altera la proteína total ni la expresión superficial de TRPV4, CD36 y TLR en macrófagos. (A–D) Inmunotransferencias de lisados ​​de células completas de macrófagos después del tratamiento durante la noche con Linkedin 1 o 5 µM o vehículo. Las inmunotransferencias representativas muestran la expresión total de proteínas de CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) y TLR4 (D) en células tratadas y no tratadas con Linkedin. Se realizaron tres repeticiones biológicas independientes y 3 repeticiones experimentales para cada conjunto de experimentos. (E–H) Análisis de citometría de flujo de macrófagos tratados durante la noche con Linkedin 5 µM o sin tratar que muestran expresión superficial de TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) y TLR6 (G) en células no tratadas y tratadas con Linkedin. Se analizaron tres réplicas biológicas independientes y 30000 células por condición. (I–L) Análisis cuantitativo de los resultados de (E–H). Analizado por la prueba t de dos colas con un intervalo de confianza del 99 por ciento. Células contadas por experimento, 30,000; dos repeticiones experimentales.

GGT bloquea la activación proaterogénica de JNK2 y la inflamación en macrófagos. Los informes publicados de nuestro laboratorio y otros han demostrado que la activación de JNK2 desempeña un papel fundamental en la formación de células espumosas y la aterosclerosis7,57. Para determinar si la GGT podía inhibir la activación de JNK1/2, se trataron los macrófagos con GGT seguido de estimulación con LPS o LDL ox. Los resultados del análisis de inmunotransferencia mostraron que el tratamiento con GGT suprimió significativamente la fosforilación de JNK1/2 inducida por oxLDL o LPS en comparación con el control no tratado o tratado con LDL nativa (Fig. 7A-D). Se ha demostrado que la activación de JNK en macrófagos induce la transcripción de mediadores proinflamatorios asociados a la aterosclerosis58–60. Para determinar si la GGT podría bloquear potencialmente la expresión de estos reguladores proinflamatorios en los macrófagos, las células pretratadas con GGT se estimularon con oxLDL y los niveles de expresión de ARNm de TNF, IL 6, IL12, IL1 y MCP1 se cuantificaron mediante análisis qRT-PCR. Detectamos una regulación a la baja significativa en los niveles de expresión inducidos por oxLDL de ARNm de TNF, IL12, IL1 y MCP1 en células tratadas con GGT en comparación con los controles tratados con vehículo (Fig. 7E–I). En conjunto, estos resultados sugieren que la GGT bloquea la activación proaterogénica de JNK2 y la expresión de genes inflamatorios en respuesta a la estimulación de oxLDL en macrófagos. Discusión Se sabe que los compuestos naturales como los flavonoides y los polifenoles modulan las respuestas cardiovasculares a través de diversos mecanismos, como la inhibición de las señales proinflamatorias, la sensibilización a la insulina, el estado oxidativo y la mejora de los perfiles de lípidos en sangre40–45. En este documento, informamos sobre la identificación basada en la detección de rendimiento semialto y la caracterización funcional de Linkedin, una flavona, como un nuevo inhibidor de los procesos proterogénicos/inflamatorios dependientes de TRPV4-en los macrófagos. Demostramos específicamente que i) la ginkgetina bloquea la entrada de Ca2 más mediada por TRPV4-en los macrófagos, ii) el bloqueo de la ginkgetina de la función TRPV4 disminuyó notablemente la formación de células espumosas inducida por oxLDL al suprimir la absorción de oxLDL en los macrófagos, y iii) bloquea la ginkgetina Fosforilación de JNK1/2 inducida por LPS y oxLDL, expresión de proteínas TRPV4 y expresión de genes inflamatorios. En conjunto, los resultados de nuestro estudio mostraron que la ginkgetina inhibe la función de los macrófagos proaterogénicos/inflamatorios de una manera dependiente de TRPV4-. La aterosclerosis, una enfermedad de la aorta, se alimenta inicialmente de la inflamación y la ingurgitación de los macrófagos con oxLDL, lo que induce la formación de células espumosas de macrófagos, que posteriormente progresan para formar ateroma2–10. Dado que la formación de células espumosas es un proceso crítico en la aterogénesis, comprender y manipular la formación de células espumosas puede tener un potencial terapéutico. Se sabe que los macrófagos expresan una variedad de bombas y canales iónicos que penetran en la membrana, incluido TRPV4, un canal iónico permeable al Ca2 polimodal mecanosensible, que se activa con estímulos tanto físicos como bioquímicos11–24. Los estudios publicados por nuestro laboratorio y otros han identificado el papel de TRPV4 en la inflamación de macrófagos y la formación de células espumosas inducida por oxLDL14–16,26. TRPV4 puede servir así como un objetivo viable para la atenuación de los procesos proaterogénicos.

Figura 5. Linkedin no suprime la unión de DiI-oxLDL a los macrófagos. Los macrófagos se pretrataron con vehículo o Linkedin (1 o 10 µM) durante 3 h seguido de incubación con oxLDL marcada con DiI (2,5 µg/mL) durante 1 ha 4 grados. (A) Imágenes microscópicas de fluorescencia representativas (ampliación original, 63x) de la unión de DiI-oxLDL en la superficie de la membrana del macrófago (n=20 células/condición). (B) Los resultados del experimento A se muestran como un perfil de trama utilizando el software NIH ImageJ. (C) Análisis cuantitativo de los resultados de A. n=20 células/condición. en la mejora de la aterosclerosis mediante la reducción de MMP-2 y MMP-9 y el aumento de los niveles de NO y NOS en aortas torácicas de rata52. En el presente estudio, demostramos que los bloques de ginkgetina TRPV4-provocaron la entrada de Ca2 más en los macrófagos. De manera mecánica, demostramos que la ginkgetina bloquea la absorción de oxLDL, pero no se une, en los macrófagos. Los estudios realizados in vivo e in vitro sugirieron un papel crítico de CD36 como el principal receptor depurador en la captación de oxLDL y la formación de células espumosas de macrófagos2–7. Se demostró que los ratones nulos para CD36 que carecen de ApoE o LDLR son menos propensos a desarrollar lesiones ateroscleróticas5,6. Estudios previos de nuestro grupo identificaron un papel esencial de la cascada de señalización de CD36-JNK en la formación de células espumosas de macrófagos7. Los receptores tipo Toll TLR2, TLR4 y TLR6 actúan como correceptores al interactuar con CD36 y se ha demostrado que están involucrados en la aterogénesis2,56,63. Examinamos la posibilidad de que la falta de formación de células espumosas observada en los macrófagos tratados con Linkedin se deba a la disminución de la expresión de las proteínas CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 o TLR6. Curiosamente, el tratamiento con Linkedin no disminuyó significativamente la expresión de las proteínas CD36, TLR2, TLR4 o TLR6 en niveles basales o bajo condiciones estimuladas por oxLDL. Sin embargo, Linkedin bloqueó específicamente la regulación positiva inducida por oxLDL de la expresión de proteínas TRPV4, mientras que su expresión en niveles basales permaneció sin cambios. En conjunto, estos resultados sugieren que la ginkgetina bloquea la formación de células espumosas inducida por oxLDL a través de un mecanismo independiente de la expresión de CD36 y TLR, pero dependiente de TRPV4. Estudios previos de nuestro grupo y otros demostraron que la activación de JNK2 está involucrada en la formación de células espumosas y el desarrollo de lesiones ateroscleróticas7,57. También se informó que JNK está involucrada en la modulación de MMP-9 y MMP-13, que se sobreexpresan en lesiones ateroscleróticas64–68. Dado el vínculo reconocido de JNK en los procesos aterogénicos, queríamos determinar si la ginkgetina podría inhibir la activación de JNK. De acuerdo con informes anteriores, nuestros resultados también mostraron que la ginkgetina bloquea la fosforilación de JNK2 inducida por estímulos inflamatorios en macrófagos. Este resultado sugiere un posible mecanismo por el cual Linkedin bloquea la formación de células espumosas. Además, encontramos una regulación a la baja significativa en la expresión inducida por oxLDL de ARNm de TNF, IL12, IL1 y MCP1 en células tratadas con ginkgetina en comparación con el control del vehículo, lo que destaca los posibles roles antiinflamatorios de la ginkgetina en respuesta a oxLDL. En resumen, nuestros resultados mostraron que la ginkgetina inhibe la función de los macrófagos proaterogénicos e inflamatorios de una manera dependiente de TRPV4-. Estos hallazgos refuerzan así la justificación del uso de compuestos naturales en el desarrollo de posibles reactivos terapéuticos y/o quimiopreventivos.

Referencias
1. Barquera, S. et al. Panorama mundial de la epidemiología de la enfermedad cardiovascular aterosclerótica. Arco. Medicina. Res. 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. La biología celular de los macrófagos en la aterosclerosis. Celda 145, 341–355 (2011).
3. Libby, P. Inflamación en la aterosclerosis. Naturaleza 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG y Ramji, DP Citoquinas, metabolismo de lípidos de macrófagos y células espumosas: implicaciones para la terapia de enfermedades cardiovasculares. prog. Res. de lípidos 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. et al. La interrupción dirigida del receptor eliminador de clase B CD36 protege contra el desarrollo de lesiones ateroscleróticas en ratones. J. Clin. Invertir. 105, 1049–1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV et al. Los receptores Scavenger de clase AI/II y CD36 son los principales receptores responsables de la captación de lipoproteínas de baja densidad modificadas que conducen a la carga de lípidos en los macrófagos. J. Biol. química 277, 49982–49988 (2002).
7. Rahaman, SO et al. Se necesita una cascada de señalización dependiente de CD36-para la formación de células espumosas de macrófagos. Metab. celular 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Aterosclerosis: una enfermedad inflamatoria. N Engl J Med. 340(2), 115–126 (1999).
9. Libby P. Te mecanismos moleculares de las complicaciones trombóticas de la aterosclerosis. J. Pasante. Medicina. 517–527, 2008.
10. Lusis, AJ Aterosclerosis. Naturaleza 407, 233–241 (2000).
11. Matthews, BD et al. Activación ultrarrápida de los canales iónicos TRPV4 mediante fuerzas mecánicas aplicadas a las integrinas beta1 de la superficie celular. Entero. Biol. (Camba). 2(9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. y Rahaman, SO Te TRPV4-Eje de señalización de mecanotransducción TAZ en la rigidez de la matriz y transición epitelial-mesenquimal inducida por TGF 1-. Mol celular. Bioeng.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. y Rahaman, SO Se requiere un receptor potencial transitorio vanilloid 4 para la respuesta a cuerpos extraños y la formación de células gigantes. Soy. J. Pathol. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. El canal permeable al calcio TRPV4 es un nuevo regulador de la formación de células espumosas de macrófagos inducidas por LDL oxidadas. Radico libre. Biol. Medicina. 110, 142–150 (2017).