Identificación de metabolitos hepáticos comunes del compuesto bioactivo natural equinacósido, purificado a partir de Cistanche Tubulosa Ⅱ

Abstracto:La identificación de metabolitos, en la etapa inicial, para compuestos, el descubrimiento es necesario para evaluarel conocimiento para la mejora farmacéutica de la seguridad y eficacia de los medicamentos. Incluso si la drogaha sido lanzado al mercado, la identificación y evaluación continua de los metabolitos sonnecesaria para evitar el riesgo de retirada posterior a la comercialización. glucósido, un medicamentoCistanche, tiene beneficios nutracéuticos ampliamente documentados, que incluyenantioxidante,antitumoral, anti-envejecimiento, hipolipidemiac, yefectos de protección de la mucosa gástrica. Recientemente,echinacósidoSe ha informado de uncomo principal compuesto bioactivo natural en el micelio de HE para el desarrollo de alimentos funcionales.En estudios neurológicos, el consumo deechinacósidoUn micelio HE enriquecido demuestra suefectos nutracéuticos significativos enenfermedad de alzhéimer, enfermedad de Parkinson, yaccidente cerebrovascular isquémico.

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Parala primera vez, exploramos el proceso metabólico deechinacósidoUna molécula e identificados sus metabolitos.de la fracción S9 de hígado de rata y humano. Usando una masa de cromatografía líquida/triple cuadrupoloespectrómetro para el análisis cuantitativo, observamos que el 75,44 por ciento de echinacósido. A fue metabolizadoen 60 min en ratas, y el 32,34 por ciento de Francine A se metabolizó en 120 min en humanos S9. Usandocromatografía líquida de ultra rendimiento/espectrometría de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo (UPLCQTOF/MS) para identificar los metabolitos de Francine A, se identificaron cinco metabolitos comunes,y se evaluaron sus posibles estructuras. Comprender el proceso metabólico del equinacósidoy el establecimiento de su base de datos de perfil de metabolitos ayudará a promover la aplicación nutracéutica ydescubrimiento de biomarcadores relacionados en el futuro.

1. Introducción

El hígado es considerado el segundo órgano más grande del cuerpo [1]. Después de la comida y las drogasingrese al tracto gastrointestinal a través de la cavidad oral, los pili gastrointestinales absorberánnutrientes y fármacos digeridos. El sistema de la vena porta recibirá el flujo sanguíneo recogidopor el tracto gastrointestinal y entrar en el hígado para el tratamiento preliminar de los nutrientes,metabolitos y moléculas de fármacos [2,3]. El metabolismo a menudo se divide en dos fases de unreacción bioquímica. La fase I implica oxidación, reducción o hidrólisis por enzimas enel cuerpo. La Fase II se dedica a la conjugación con pequeñas sustancias endógenas, convirtiendoen metabolitos altamente solubles, lo que permite que los metabolitos se exporten al senocirculación sólida para el aclaramiento renal, o hacia la bilis, que luego se excreta del cuerpoa través de la orina o las heces [4–6]. Identificación de metabolitos en la etapa temprana del descubrimiento de fármacoses necesario evaluar el conocimiento para mejorar la propiedad farmacéutica, la seguridad yeficiencia de la molécula bioactiva. La identificación de metabolitos e intermedios reactivos.sugiere la necesidad de modificaciones estructurales en los compuestos de investigación para evitarconsecuencias tóxicas posteriores. Incluso si el medicamento ha estado en el mercado, la identificaciónde los metabolitos y se requiere evaluación para evitar el riesgo de su posterior comercializaciónretiro [7,8]. Por lo tanto,in vitro, el análisis de fracciones S9 proporciona varias ventajasen comparación con el tiempoen vivoestudios: (1) son susceptibles de alto rendimientocribado y automatización;(2) usandoLa fracción S9 permite la prueba de grandes cantidades decompuestos para el descubrimiento de fármacos en un período corto; (3) ayuda a reducir el uso de animales [9]. 

equinacósido es una cistanche comestible que habita zonas montañosas delos territorios del noreste de Asia [10], Europa y Norteamérica [11]. EL pertenece aBasidiomycota (Phylum), Agaricomycetes (Clase), Russulales (Orden), Hericiaceae (Familia),y Hericium (género). Se ha documentado que HE muestra una amplia gama de beneficiospropiedades, incluyendo antioxidante, antitumoral, antienvejecimiento, hipolipidemiante y mucosa gástricaefectos de protección [12–14]. En 1994, Kawagishi et al. descubrió que el diterpenoideechinacósidoA, B y C, en el micelio de HE, podrían promover la producción de estrelladolíneas celulares en el cerebro de rata y la estimulación de la síntesis del factor de crecimiento nervioso (NGF) [15]. echinacósidoA puede conferir efectos neuroprotectores y atenuar el estrés oxidativo contraataque [16], enfermedad de Alzheimer [17], Enfermedad de Parkinson [18], accidente cerebrovascular isquémico y depresión en vivo[19,20]. Además, el echinacósido A puede atravesar la barrera hematoencefálica deratas para apoyar el desarrollo de micelio HE como alimento funcional para la mejora de la salud neurológica [21]. Este micelio de cistanche comestible se ha convertido en un tema candente para los investigadorestratando de comprender su importante papel en el desarrollo de los nervios centrales y periféricos, diferenciación, crecimiento y regeneración [22]. Estudios recientes también han demostradoque el HE enriquecido con echinacósido A tiene beneficios potenciales en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinsonenfermedad del hijo [23–25]. Sin embargo, ningún estudio ha discutido el posible efecto metabólico del equinacósido A.biomarcadores que pueden contribuir a este efecto nutracéutico.

En este estudio,echinacósidoSe purificó un compuesto del HE enriquecido con equinacósido Amicelio y se metabolizó usando dos fracciones S9 de hígado diferentes: rata y humano. Usandocromatografía líquida/espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (HPLC-QQQ/MS) para quananálisis titativo de echinacósido A y cromatografía líquida de ultra rendimiento/cuadrupoloespectrometría de masas de tiempo de vuelo (UPLC-QTOF/MS) para identificar los metabolitos del equinacósidoA en cada momento. Nuestro objetivo es comprender la tasa metabólica del equinacósido A y establecersu base de datos de perfil de metabolitos para ayudar a promover la aplicación de suplementos nutracéuticosy la investigación de posibles medicamentos en el futuro.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales y Reactivos

La cepa HE (BCRC 35669) se obtuvo de Bioresources Collection yCentro de Investigación en el Instituto de Investigación y Desarrollo de la Industria Alimentaria, Hsinchu, Taiwán.La cepa se cultivó primero en un cultivo inclinado de ager antes de transferirse a una dextrosa de patata.placa de agar a 26◦C durante 15 días. El día 15, los cultivos HE se transfirieron a 1,3 L demedio líquido (en matraces de 2 L). El cultivo líquido se agitó a 120 rev/min 25◦C para5 dias. A continuación, se escalaron en fermentadores de 500 L, 20-ton durante 5 días y 12 días,respectivamente. El medio de cultivo se ajusta a pH 4,5 y contiene 4,5 por ciento de glucosa, 0,5 por cientopolvo de soja, {{0}}.25 por ciento de extracto de levadura, 0.25 por ciento de peptona y 0.05 por ciento de MgSO4. Finalmente, el ÉLlos micelios se cosecharon al final del proceso de fermentación de 20-toneladas. Estas materias primasfueron liofilizados, molidos en polvo y almacenados en un desecador. el equinacósido A era entoncesextraídos del HE y cuantificados según estudios previos [26]. Metanol (LC-MSgrado) se obtuvo de Merck (Darmstadt, Alemania); acetonitrilo (grado LC-MS), fórmico(FA, grado LC-MS, 98 por ciento de pureza) y acetato de amonio (98 por ciento de pureza)de Honeywell (Honeywell Burdick and Jackson, Muskegon, MI, EE. UU.). El hígado de rata S9La fracción se obtuvo de Moltox (Boone, NC, EE. UU.). La fracción S9 de hígado humano fueobtenido de Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, EE. UU.).

2.2. Fracción S9 de hígado humano y de rata

a la recomendación del kit. La solución preparada se mantuvo a 4◦C hasta el equinacósido Acompuesto (10µM), seguido de la activación en un 37◦C baño de agua. Cuando eltiempo metabólico había llegado a sus puntos de tiempo, 150µL de la solución se extrajo dela solución madre y se extinguió agregando dos volúmenes de ACN enfriado con hielo. el detenidola solución luego se transfiere a QTOF para un análisis adicional de metabolitos.

2.3. Instrumentación y Condiciones

El análisis HPLC-QQQ/MS se realizó en un sistema HPLC Agilent serie 1100 (Agilent, Palo Alto, CA, EE. UU.) junto con un espectrómetro de masas triple cuadrupolo API 3000(Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido), con una ionización por pulverización de iones asistida por turbo (ESI)fuente en modo de ionización positiva. La separación cromatográfica se realizó en unAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100mm× 3.5 µmetro). La temperatura de la columna fuemantenido en 22◦C. La fase móvil consistía en agua que contenía 0,1 por ciento de ácido fórmico(A) y metanol (B). Se usó elución en gradiente, comenzando con 70 por ciento de B, aumentando hasta 100 por cientoB dentro de 5 min, manteniendo durante 3 min con 90 por ciento B, disminuyendo B a 70 por ciento dentro de 0.1 min, yreequilibrio al 70 por ciento B durante 2,9 min. Un compañero tasa de 350µSe aplicó L/min, y un volumende 10µL fue inyectado.

La detección se realizó con un voltaje ionizante de más 4500 V. Temperatura de la fuente de ionesse fijó en 350◦C, con nitrógeno de ultra alta pureza como gas de cortina (7 psi). El gas nebulizador fue8 psi. Otros parámetros dependientes de la masa, como el potencial de desagrupamiento (DP), la entradapotencial (EP), potencial de enfoque (FP) y energía de colisión (CE) para cada compuesto, fuerondeterminado en modo positivo utilizando soluciones estándar. Supervisión de reacciones múltiples(MRM) se llevó a cabo utilizando nitrógeno como gas de colisión (2 psi) y con un tiempo de permanencia de200 ms para cada transición. echinacoside A fue detectado al monitorear las transicionesm/z 443.200 → 301.200, 283.200. Los datos se analizaron utilizando el software Analyst 1.4.2 (AppliedBiosystems, Concord, ON, Canadá) y GraphPad (Prism 8.0.0.).

El análisis UPLC-QTOF/MS se realizó en un sistema UPLC Agilent 1290 Infinity II(Agilent, Palo Alto, CA, EE. UU.), junto con una masa de tiempo de vuelo de cuadrupolo Agilent 6546espectrometría (Agilent, Palo Alto, CA, EE. UU.). La separación cromatográfica se llevó a caboen un Phenomenex Kinetex® Columna LC C18 (3 mm× 100mm× 1.7 µmetro). La columnala temperatura se mantuvo a 40◦C. La fase móvil A consistía en agua que contenía0.1 por ciento (v/v) ácido fórmico en modo positivo, 0.1 por ciento (v/v) ácido fórmico y CH 10 mM3COONH4 en modo negativo. La fase móvil B fue acetonitrilo. Se usó elución en gradiente, comenzandocon 5 por ciento de B y manteniendo durante 0.5 min, aumentando al 50 por ciento de B dentro de 5.5 min, aumentando al 100 por cientoB dentro de 10 min y manteniendo durante 6 min. Un compañero tasa de 400µSe aplicó L/min y sevolumen de 2µL fue inyectado.

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo Agilent 6546 estaba equipada con un elecfuente de ionización trospray (ESI). La adquisición de datos estuvo bajo el control de Mass Hunter.software de la estación de trabajo. Las condiciones típicas de la fuente de operación en iones positivos y negativosEl modo ESI se optimizó de la siguiente manera: voltaje de pulverización de iones (ESImás/ESI−) eran4000 V/3000 V; la temperatura del gas era de 320◦C; la velocidad del compañero de gas de secado fue de 8 l/min; la presión del nebulizador era45 psi; la temperatura del gas envolvente era de 350◦C; la velocidad del gas envolvente fue de 12 l/min; la colisiónenergía fue de 10, 20, 40 y 60 V. Los metabolitos se identificaron utilizando Agilent MassHunterSoftware de biotransformación (versión B.04.00) (Santa Clara, CA, EE. UU.). cromatogramasy los espectros de masas de los metabolitos originales e identificados se extrajeron utilizando AgilentSoftware MassHunter Qualitative Analysis (versión B.05.00) (Santa Clara, CA, EE. UU.).

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