El echinacósido Rb1 atenúa el deterioro vascular asociado con la edad mediante la modulación de la vía Gas6
Apr 04, 2023
ABSTRACTO
Contexto:echinacósidoRb1 (Rb1) ejerce muchos efectos beneficiosos y protege contra las enfermedades cardiovasculares.
Objetivo: investigar si Rb1 podría atenuar el deterioro vascular relacionado con la edad e identificar el mecanismo. Materiales y métodos: ratones hembra C57BL/6J de 2 y 18 meses de edad, asignados aleatoriamente a los grupos Young, Young þ 20 mg/kg Rb1, Oldþ vehículo, Old þ 10 mg/kg Rb1 y Old þ 20 mg/kg Rb1, fueron tratados diariamente inyección intraperitoneal con vehículo o Rb1 durante 3 meses. Los segmentos de la aorta torácica se utilizaron para inspeccionar la vasorrelajación dependiente del endotelio. Se recolectaron tejidos de la aorta torácica izquierda para análisis de expresión histológica o molecular, incluidas proteínas relacionadas con el envejecimiento, marcadores relevantes para la calcificación y la fibrosis, y la expresión de Gas6/Axl.
Resultados: Encontramos que en el grupo del vehículo Oldþ, la expresión de proteínas de senescencia y moléculas de adhesión celular aumentó significativamente, con una peor relajación de la aorta torácica dependiente del endotelio (58,35 por ciento ± 2,50 por ciento) que en el grupo de Young (88,84 por ciento ± 1,20 por ciento). ). Sin embargo, el tratamiento con Rb1 disminuyó significativamente los niveles de expresión de estas proteínas y conservó la relajación dependiente del endotelio en ratones de edad avanzada. Además, el tratamiento con Rb1 también redujo la deposición de calcio, la deposición de colágeno y los niveles de expresión de proteínas de colágeno I y colágeno III en ratones de edad avanzada. Además, encontramos que el tratamiento con Rb1 anuló la regulación negativa de la expresión de la proteína Gas6 en un 41,72 por ciento y la expresión de ARNm en un 52,73 por ciento en ratones viejos en comparación con ratones jóvenes. Pero no hubo diferencias significativas en la expresión de Axl entre los grupos.
Conclusiones: Nuestro estudio confirma que Rb1 podría mejorar la lesión vascular, lo que sugiere que Rb1 podría ser un potencialagente de deterioro vascular relacionado con el envejecimiento.
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Introducción
Durante los próximos 30 años en China, se estima un aumento del 12,6 % al 26 % de adultos de 65 años o más (Zhou y Walker 2021). Aunque la vida humana está aumentando, las enfermedades relacionadas con la edad continúan siendo un tema de preocupación.Enfermedades cardiovascularesson losenfermedades mas comunesque afectan a las personas mayores.Envejecimiento vascularacompañado de cambios estructurales y funcionales vasculares es un importante factor de riesgo independiente paraenfermedades cardiovasculares(Lakatta y Levy 2003). Las encuestas epidemiológicas han demostrado que el 82 por ciento de los pacientes que mueren por enfermedades cardiovasculares tienen 65 años o más (Moslehi et al. 2012). Por lo tanto, explorar el mecanismo del deterioro vascular asociado con la edad y encontrar agentes que puedan proteger la función vascular contra el deterioro relacionado con la edad podría desempeñar un papel importante en la reducción de la incidencia y la prevalencia de los trastornos cardiovasculares asociados con la edad en personas de edad avanzada.
El envejecimiento arterial se ha implicado en la patogenia de la disfunción vascular y diversas enfermedades cardiovasculares y es un sello distintivo del envejecimiento (Minamino y Komuro 2007). Las alteraciones vasculares resultantes del envejecimiento varían e incluyen disfunción endotelial, hipertrofia de las células musculares lisas vasculares (CMLV), dilatación arterial, reorganización de la matriz extracelular (MEC), calcificación vascular y aumento de la relación colágeno-elastina con fragmentación. y rigidez vascular (Tolle et al. 2015). Brande et al. (2005) informaron que la disfunción endotelial relacionada con la edad se caracterizaba comúnmente por un desequilibrio en la relajación y los factores contráctiles derivados del endotelio. Un estudio adicional de Herrera et al. (2010) también demostraron que la disfunción endotelial estaba estrechamente relacionada con una disminución progresiva de la vasodilatación dependiente del endotelio. Sin embargo, aún no está claro cómo el envejecimiento afecta la vasodilatación o desencadena desequilibrios en los factores relacionados y, en última instancia, conduce a la disfunción vascular. Acosta et al. (2008) demostraron que las células vasculares en proceso de senescencia podían producir moléculas de adhesión, incluido el inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1), una proteína de adhesión de células vasculares 1 (VCAM-1) y una molécula de adhesión de células intercelulares{{ 14}} (ICAM-1). Se pensó que todas estas moléculas de adhesión desempeñaban un papel importante en el reclutamiento de monocitos a los sitios ateroscleróticos y luego iniciaban la remodelación vascular, lo que en última instancia resultaba en una reducción de la distensibilidad y un aumento de la rigidez (Acosta et al. 2008; Kovacic et al. 2011). La rigidez vascular es la manifestación más importante del envejecimiento vascular. Se atribuye a la remodelación de la ECM y contribuye a una disminución de la vasodilatación. Estudios previos han demostrado que la rigidez vascular y la senescencia de las VSMC se atribuyen a la calcificación medial y al depósito de colágeno (Mauriello et al. 1992; McClelland et al. 2006; Nakano-Kurimoto et al. 2009; Wendorff et al. 2015; Kim et al. 2018). ). Por lo tanto, la disfunción de la vasodilatación podría deberse a la calcificación y la fibrosis. La reducción de la deposición de calcio o colágeno puede retrasar el deterioro arterial relacionado con el envejecimiento.
echinacósidoRb1 (Rb1) es uno de los componentes activos que se encuentran en el ginseng. La investigación ha informado que Rb1 ejerce muchos efectos beneficiosos de antisenescencia y antiapoptóticos, particularmente en la protección del miocardio y el endotelio (Zheng et al. 2017; Zhou et al. 2017; Zheng et al. 2020). Estudios recientes han demostrado que Rb1 puede reducir la calcificación vascular asociada a la enfermedad renal crónica y la expresión de colágeno tipo I en ratas (Zhou et al. 2019b). Los hallazgos también han sugerido que Rb1 reduce la expresión de colágeno tipo I (Kwok et al. 2012). Sin embargo, no se han investigado los efectos de Rb1 sobre el deterioro vascular asociado con la edad.
Se ha informado que Rb1 inhibe la calcificación vascular a través de la transactivación in vitro del gen 6 (Gas6) específico de la detención del crecimiento (Nanao-Hamai et al. 2019). Gas6, un miembro de la familia de proteínas dependientes de la vitamina K, está implicado en la regulación de múltiples funciones celulares después de unirse a su receptor Axl, un receptor de membrana tirosina quinasa (Nakano et al. 1997; Fridell et al. 1998; Yanagita et al. . 2001). Algunos estudios han indicado que la vía Gas6/Axl desempeña un papel fundamental en la biología vascular y en enfermedades como la calcificación vascular, la remodelación vascular y la aterosclerosis (Korshunov et al. 2006; Hurtado et al. 2010; Son et al. 2010). Presumimos que Rb1 puede atenuar el deterioro vascular relacionado con la edad mediante la supresión de la calcificación y la fibrosis, lo que está potencialmente asociado con la regulación de la vía Gas6/Axl.
Materiales y métodos
reactivos experimentales
Rb1 (pureza superior al 98 por ciento) se obtuvo de Victory (Sichuan, China). Los anticuerpos contra p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) y GAPDH (ab181603) se adquirieron de Abcam. (MA, EE. UU.). Los anticuerpos contra colágeno I (14695), colágeno III (22734) y Axl (13196) se adquirieron de Proteintech Group (MA, EE. UU.). Los anticuerpos contra Gas6 (A8545) y p16INK4a (A0262) se adquirieron de ABclonal Technology (Hubei, China). El tampón de Krebs-Henseleit (KH) modificado, la fenilefrina (un potente vasoconstrictor) y la acetilcolina (Ach, un donante de NO dependiente del endotelio) se adquirieron de Sigma-Aldrich (MO, EE. UU.). Todos los demás reactivos utilizados fueron de grado analítico.
animales y manejo
Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Sun Yat-Sen. La mayoría de los estudios de longevidad han mostrado efectos en las hembras (Hsu et al. 2018; Qin et al. 2018); por lo tanto, realizamos nuestro estudio a largo plazo utilizando ratones hembra. Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6J de 2 y 18 meses de edad del Centro de Animales Experimentales de la Universidad Sun Yat-Sen. Los ratones fueron alimentados con una dieta normal y alojados en condiciones controladas (24 ± 2 C y 50 ± 5 por ciento de humedad) con fotoperíodos de 12 h de luz/oscuridad en condiciones libres de patógenos específicos. Se asignaron aleatoriamente 40 ratones C57BL/6J hembra jóvenes de 2 meses de edad a los grupos Young y Young þ 20 mg/kg Rb1 (Young þ Rb1-20) (n=20 cada uno). Estos ratones fueron tratados con una inyección intraperitoneal diaria de vehículo (solución salina estéril) o 20 mg/kg de Rb1 disueltos en el vehículo durante 3 meses antes de la eutanasia por asfixia con CO2 a los 5 meses de edad. Se asignaron aleatoriamente 60 ratones hembra C57BL/6J de 18 meses de edad al vehículo Old þ, Old þ 10 mg/kg Rb1 (Old þ Rb1-10) y Old þ 20 mg/kg Rb1 (Old þ Rb 1-20) grupos (n=20 cada uno). Los ratones que sobrevivieron hasta el final de este experimento recibieron inyecciones intraperitoneales diarias del vehículo solo o Rb1 (10 o 20 mg/kg) durante 3 meses, después de lo cual los ratones fueron sacrificados a los 21 meses de edad. Los experimentos se repitieron al menos tres veces con 4-5 ratones por grupo.
Materiales y métodos Reactivos experimentales
Rb1 (pureza superior al 98 por ciento) se obtuvo de Victory (Sichuan, China). Los anticuerpos contra p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) y GAPDH (ab181603) se adquirieron de Abcam. (MA, EE. UU.). Los anticuerpos contra colágeno I (14695), colágeno III (22734) y Axl (13196) se adquirieron de Proteintech Group (MA, EE. UU.). Los anticuerpos contra Gas6 (A8545) y p16INK4a (A0262) se adquirieron de ABclonal Technology (Hubei, China). El tampón de Krebs-Henseleit (KH) modificado, la fenilefrina (un potente vasoconstrictor) y la acetilcolina (Ach, un donante de NO dependiente del endotelio) se adquirieron de Sigma-Aldrich (MO, EE. UU.). Todos los demás reactivos utilizados fueron de grado analítico.
animales y manejo
Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Sun Yat-Sen. La mayoría de los estudios de longevidad han mostrado efectos en las hembras (Hsu et al. 2018; Qin et al. 2018); por lo tanto, realizamos nuestro estudio a largo plazo utilizando ratones hembra. Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6J de 2 y 18 meses de edad del Centro de Animales Experimentales de la Universidad Sun Yat-Sen. Los ratones fueron alimentados con una dieta normal y alojados en condiciones controladas (24 ± 2 C y 50 ± 5 por ciento de humedad) con fotoperíodos de 12 h de luz/oscuridad en condiciones libres de patógenos específicos. Se asignaron aleatoriamente 40 ratones C57BL/6J hembra jóvenes de 2 meses de edad a los grupos Young y Young þ 20 mg/kg Rb1 (Young þ Rb1-20) (n=20 cada uno). Estos ratones fueron tratados con una inyección intraperitoneal diaria de vehículo (solución salina estéril) o 20 mg/kg de Rb1 disueltos en el vehículo durante 3 meses antes de la eutanasia por asfixia con CO2 a los 5 meses de edad. Se asignaron aleatoriamente 60 ratones hembra C57BL/6J de 18 meses de edad al vehículo Old þ, Old þ 10 mg/kg Rb1 (Old þ Rb1-10) y Old þ 20 mg/kg Rb1 (Old þ Rb 1-20) grupos (n=20 cada uno). Los ratones que sobrevivieron hasta el final de este experimento recibieron inyecciones intraperitoneales diarias del vehículo solo o Rb1 (10 o 20 mg/kg) durante 3 meses, después de lo cual los ratones fueron sacrificados a los 21 meses de edad. Los experimentos se repitieron al menos tres veces con 4-5 ratones por grupo.
Determinación de la vasorrelajación en anillos aórticos torácicos
Después de sacrificar a los animales, se extrajeron rápidamente los anillos de la aorta torácica y se colocaron en una solución tampón de KH fría (118 mmol/L de NaCl, 4,75 mmol/L de KCl, 25 mmol/L de NaHCO3, 1,18 mmol/L de MgSO4 1). 18 mmol/L de KH2PO4, 2,54 mmol/L de CaCl2 y 11,1 mmol/L de glucosa), y se desbridaron cuidadosamente la grasa y el tejido circundantes. La longitud de los anillos aórticos era de aproximadamente 3 mm. Los segmentos aórticos se suspendieron en ganchos de acero inoxidable, se airearon en tampón KH y se oxigenaron continuamente con O2 al 95 % a 37 °C. Luego, los anillos aórticos se conectaron a transductores de fuerza FORT-10 para la adquisición de datos de MacLab. Se fijó una tensión pasiva inicial en los anillos aórticos de 3 mN durante 30 min para lograr la estabilidad del anillo del vaso antes de continuar con la experimentación. El tampón KH se reemplazó cada 10 min. Se añadió fenilefrina al baño de tejido a una concentración de 105 mol/l para inducir la vasoconstricción. Después de lograr la estabilidad del anillo del vaso, se agregó el vasorelajante Ach (10 9 -10 5 mol/L) al baño de tejido en sucesión inmediata para obtener la curva de dosis-respuesta. Se midió la relajación en cada concentración y se expresa como el porcentaje de fuerza generada en respuesta a la fenilefrina.
inmunohistoquímica
Los tejidos de la aorta torácica se fijaron en formalina, se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones transversales de 4 µm. Estas secciones se incubaron en tampón de citrato (pH 6.0) y se sometieron a microondas durante 10 min dos veces después de someterse a desparafinización y rehidratación. Se usó suero de cabra (10 por ciento) (Gibco, BRL, NY, EE. UU.) para bloquear la unión no específica durante 1 hora a 37 °C, seguido de una incubación durante la noche con anticuerpos primarios contra p21Cip1 (1:1000) y p16INK4a (1:200). ) a 4 C en caja húmeda. Después de tres lavados en PBS, se añadieron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Abcam) y se incubaron durante 60 min a 37 C, seguido de tinción con diaminobencidina (1:100, Abcam). Se aplicó hematoxilina para contrateñir los núcleos celulares. Las secciones se cubrieron con goma neutra y se fotografiaron bajo un microscopio Zeiss.
Tinción con hematoxilina-eosina (HE)
Las secciones de la aorta torácica incluidas en parafina se tiñeron con hematoxilina durante 2 min. Después de lavar y tratar con alcohol ácido al 1 por ciento, las secciones se trataron con tinción con eosina durante 3 min. Posteriormente, las secciones fueron lavadas, deshidratadas y tratadas con xileno antes de la observación microscópica. Las secciones de la aorta torácica se fotografiaron con un microscopio Zeiss.
Tinción tricrómica de Masson
Las secciones de la aorta torácica incluidas en parafina se tiñeron con hematoxilina férrica de Weigert durante 10 minutos después de someterse a desparafinización y rehidratación y luego se lavaron con PBS durante 5 minutos. A continuación, los tejidos se tiñeron con solución de fucsina ácida escarlata de Biebrich durante 5 minutos y se lavaron con agua destilada. Luego, las secciones se diferenciaron y deshidrataron en alcohol al 75 por ciento y al 90 por ciento varias veces, y luego se enjuagaron con agua del grifo. Finalmente, las secciones se aclararon en xileno y se montaron con un medio de montaje. Las secciones se visualizaron con un microscopio. La deposición de colágeno intersticial se indicó mediante tinción azul-verde.
Tinción con rojo de alizarina S
Para la tinción de la calcificación aórtica, las secciones de la aorta torácica se tiñeron con una solución de rojo S de alizarina al 2 por ciento durante 10 min y se lavaron con PBS. Luego, las secciones se sumergieron en acetona anhidra durante 30 s, una solución mixta de acetona anhidra y xileno (relación de volumen ¼ 1:1) durante 15 s y xileno anhidro durante 1 min. Las sales de fosfato de calcio intersticiales se indicaron mediante tinción roja.
transferencia occidental
Las aortas torácicas se colocaron en tampón de lisis RIPA (HaiGene, Haerbin, China) complementado con un inhibidor de proteasa (MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EE. UU.) y luego se homogeneizaron mediante ultrasonicación en hielo. El lisado de tejido se centrifugó a 12,000 ga 4 °C durante 15 min y el sobrenadante se recogió en un tubo nuevo. Posteriormente, se determinó la concentración de proteína en el sobrenadante utilizando un kit de ensayo de proteína BCA (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangsu, China). SDS PAGE se realizó con cantidades iguales de proteína de cada muestra como se describió anteriormente (Zheng et al. 2020), y luego las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). Las membranas se incubaron a 4 °C durante la noche con uno de los siguientes anticuerpos primarios después de bloquearse con albúmina de suero bovino al 5 % (Gibco) durante 1 hora a temperatura ambiente: p21Cip1 (1:1000), p16INK4a (1:1000), ICAM{ {16}} (1:1000), VCAM-1 (1:5000), PAI-1 (1:1000), colágeno I (1:1000), colágeno III (1:300), Gas6 (1:1000), Axl (1:500) y GAPDH (1:1000). Después de lavarlas, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (Boster, Wuhan, China) durante 1 hora a temperatura ambiente. La unión del anticuerpo secundario se analizó con un kit ECL (EMD Millipore) y las intensidades de las bandas se analizaron con el software ImageJ (versión 1.41; Institutos Nacionales de Salud, MD, EE. UU.). La expresión de GAPDH se utilizó como control interno.
RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)
En primer lugar, se aisló el ARN total de las aortas torácicas utilizando un kit de extracción de ARN universal TaKaRa MiniBEST (9767, TaKaRa) de acuerdo con los protocolos del fabricante. A continuación, se midió la concentración de ARN con un espectrofotómetro DS-11 FX (DeNovix). A continuación, el ARN extraído (1000 ng cada uno para un sistema de reacción de 20 ml) se transcribió inversamente en ADNc utilizando PrimeScriptTM RT Master Mix (RR360A, TaKaRa) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un sistema ProFlex PCR (Thermo Scientific ). Finalmente, los productos de transcripción inversa se usaron como moldes para una mayor amplificación por PCR con SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa). Se utilizaron las siguientes secuencias de cebadores: Gapdh: adelante 50 -CAGCAACTCCCA CTCTTCCAC-30 e inverso 50 - TGGTCCAGGGTTTCTTAC TC-30; y Axl: adelante 50 -GGAACCCAGGGAATATCACAGG- 30 y atrás 50 -AGTTCTAGGATCTGTCCATCTCG-30; y Gas6 adelante 50 -TGCTGGCTTCCCGAGTCTTC-30 y atrás 50 -CGGGGTCGTTCTCGAACAC-30. Cada pocillo de reacción en una placa transparente de 96-pocillos (Thermo Scientific) que contenía 0,4 pmol/l de cebadores directos e inversos, 1 SYBR Premix Ex Taq II (RR820A, TaKaRa) y 10 ng de ADNc. El volumen de reacción final fue de 20 ml y todas las muestras se analizaron por triplicado. La amplificación del cDNA se realizó de la siguiente manera: predesnaturalización a 95 C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 C durante 5 s y hibridación a 60 C durante 35 s en QuantStudio5 (Thermo Scientific). El método 2-DDCT se utilizó para el análisis cuantitativo relativo de los datos recopilados. El nivel relativo de expresión de ARNm de los genes diana se obtuvo comparando los datos del grupo experimental con los del grupo de control con referencia a Gapdh.
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