Respuestas inmunes al trasplante binocular secuencial de células progenitoras de retina alogénicas a la cavidad vítrea en ratones

Abstracto:

El trasplante intravítreo de células progenitoras de la retina humana (RPC) alogénicas es prometedor como tratamiento para la degeneración cegadora de la retina. Trabajos anteriores han demostrado que los progenitores neurales se toleran bien como aloinjertos después de inyecciones únicas; sin embargo, la administración secuencial de células alogénicas aumenta el riesgo potencial de sensibilización del huésped con el posterior rechazo inmunológico de los injertos. El estudio actual fue diseñado para evaluar si se induciría una respuesta inmune mediante trasplantes intravítreos repetidos de RPC alogénicos utilizando el modelo animal de ratón. Inyectamos células progenitoras de retina murina (gmRPC), originalmente derivadas de donantes con antecedentes genéticos C57BL/6, en ratones receptores BALB/c para proporcionar datos de seguridad sobre lo que se podría esperar después del tratamiento repetido de pacientes con un producto de células humanas alogénicas. . Las respuestas inmunes a las gmRPC fueron leves y consistieron en células T, células B, neutrófilos y células asesinas naturales, con un claro predominio de los macrófagos. Los animales tratados con dosis repetidas de gmRPC no mostraron evidencia de sensibilización ni hubo destrucción de los injertos mediada por el sistema inmunológico. A pesar de la ausencia de tratamientos inmunosupresores, los injertos alogénicos de gmRPC sobrevivieron después de dosis repetidas, lo que respalda la observación preliminar de que la inyección repetida de RPC alogénicos en la cavidad vítrea es tolerada en pacientes con retinitis pigmentosa.

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Palabras clave: células madre; tolerancia inmune; privilegio inmunológico; rechazo del injerto; inyección intravítrea

1. Introducción

La retinitis pigmentosa (RP) abarca una clase de degeneración genética de conos y bastones y produce una discapacidad visual progresiva y, finalmente, ceguera. Para la gran mayoría de los casos, no existen medidas terapéuticas comprobadas disponibles para preservar o restaurar la visión; sin embargo, una estrategia para abordar esta necesidad médica insatisfecha es el trasplante de células madre. Nuestro grupo de investigación ha explorado la inyección intravítrea de células progenitoras de retina (RPC) humanas cultivadas como una forma de intervenir en la RP con el objetivo terapéutico de estabilizar la progresión o quizás revertir el curso de la enfermedad. Los RPG pueden derivarse de retinas inmaduras mediante donación de tejido o, más recientemente, de líneas celulares pluripotentes. Los estudios en modelos animales han demostrado que estas células son capaces de rescatar a los fotorreceptores de la degeneración después de la inyección en el ojo y también son capaces de diferenciarse en fotorreceptores de bastón en el ojo huésped. Existe cierta evidencia de estudios en animales de que las hRPC inyectadas pueden convertirse en fotorreceptores integrados y funcionales y, por lo tanto, estabilizar potencialmente la retina al reemplazar directamente las células moribundas. Por lo tanto, las hRPC inyectadas podrían tratar la RP tanto de forma neurotrófica como mediante un mecanismo de reemplazo celular. De cualquier manera, este enfoque basado en células ofrece una estrategia racional para el tratamiento de pacientes que padecen RP y, potencialmente, otras enfermedades de la retina.

Otro atributo favorable de las RPC, y quizás de los progenitores neurales en general, es la relativa tolerancia que ofrecen estas células después del trasplante como aloinjertos, particularmente cuando se entregan en un lugar que exhibe privilegios inmunológicos, como la retina [1,2]. Dicho esto, revisiones recientes de ensayos clínicos realizados en el campo de la medicina regenerativa continúan informando desafíos generalizados e importantes relacionados con la inflamación y el rechazo inmunológico [3,4], incluso para intervenciones dirigidas al ojo como las terapias génicas de la retina [5], como así como algunas, pero no todas, las terapias celulares [6]. Aunque es un tipo de célula local, la célula epitelial pigmentaria de la retina (EPR) no está exenta de problemas de rechazo [7–9]; por lo tanto, la supresión inmune de los receptores es actualmente una práctica estándar [10,11]. Las RPC humanas, por otro lado, parecen ser notablemente bien toleradas como aloinjertos [6,12-16], aunque esto no se extiende a su uso como xenoinjertos, donde se requiere supresión inmune [17]. Es probable que la base para la supervivencia sostenida de las RPC alogénicas en el ojo implique una serie de factores relacionados con las células utilizadas y el sitio receptor [1,8,18,19]. En trabajos anteriores que utilizaron citometría de flujo, hemos demostrado que los progenitores neuronales humanos, tanto derivados del cerebro como de la retina, expresan antígenos de histocompatibilidad mayor (MHC) de clase I, pero no de clase II [20, 21]. El mecanismo clásico de rechazo del injerto implica el reconocimiento no específico de moléculas extrañas del MHC de clase II por parte de los linfocitos CD4+ del huésped [20-25]. De esa manera, la ausencia de moléculas de clase II podría permitir que las células progenitoras injertadas evadan el rechazo inmunológico mediado por este mecanismo. Sin embargo, el aparente estado de "privilegio inmunológico" de las hRPC inyectadas por vía intravítrea no es necesariamente absoluto. Si bien los progenitores del sistema nervioso central (SNC) murino no expresan moléculas MHC detectables de clase I o clase II al inicio del estudio y exhiben un aparente privilegio inmunológico como aloinjertos [1,2,20], estas células pueden sufrir un rechazo inmunológico bajo ciertas circunstancias. Los estudios han demostrado que los antígenos del MHC pueden inducirse mediante la estimulación de los progenitores del SNC con interferón gamma (IFN) [1,26]. Los progenitores del SNC pueden rechazarse tras la sensibilización de un huésped previamente injertado. Por lo tanto, las células progenitoras del SNC (incluidas las RPC) expresan aloantígenos que son detectados por el sistema inmunológico del huésped. En conjunto, esto implica que el estado inmunológico privilegiado de las células progenitoras injertadas es provisional y está sujeto a modulación, por ejemplo, por citocinas presentes en el microambiente local, y que pueden sufrir cambios durante el curso de degeneraciones como la RP. Por todas estas razones, la respuesta inmune a múltiples inyecciones intravítreas de RPC es difícil de predecir y debe examinarse específicamente.

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Si el tratamiento con RPC demuestra ser clínicamente exitoso en la RP, habrá fuertes incentivos para el tratamiento de ambos ojos en esta enfermedad que causa ceguera bilateral. Al menos por razones de seguridad, los tratamientos binoculares normalmente se realizarían de forma secuencial, con un retraso significativo entre las dos inyecciones. Es de destacar que esta administración secuencial de células alogénicas podría provocar una sensibilización del huésped en respuesta a la primera inyección, lo que podría desencadenar un rechazo inmunológico en respuesta a la segunda inyección. Esto podría provocar la pérdida de los injertos en ambos ojos. Informes anteriores que examinaron la dosificación subretiniana única con hRPC en RP [27] o la redosificación con progenitores neurales humanos en animales [28,29] incorporaron supresión inmune. Por lo tanto, el siguiente estudio se diseñó como una investigación traslacional de RPC murinos como aloinjertos secuenciales en una cepa de ratón inmunocompetente con antecedentes genéticos dispares. Si bien no incluye productos RPC humanos, este trabajo se realizó como parte de estudios que habilitan IND para proporcionar datos en animales que aborden la seguridad, es decir, si la supresión inmune sería necesaria para los pacientes que reciben tratamientos repetidos con aloinjertos de RPC en ensayos registrados por la FDA.

2. Resultados

Para estudiar las consecuencias inmunológicas de la inyección bilateral de RPC en ratones alogénicos, se inyectaron gmRPC (antecedentes genéticos C57BL/6) por vía intravítrea en un ojo de receptores BALB/c y se inyectó una segunda dosis de RPC en el otro ojo 2 semanas después. Se eligió el intervalo de tiempo de 2-semanas para que fuera suficiente para permitir que el primer injerto indujera respuestas inmunitarias tanto innatas como adaptativas. Ninguno de los animales de experimentación recibió ningún tratamiento con fármacos inmunosupresores para que se pudieran observar las respuestas inmunitarias fisiológicas naturales.

2.1.La observación clínica y el examen oftálmico no revelaron anomalías

Los pesos de los animales de experimentación se midieron en el momento de cada inyección de gmRPC. Todos los animales de experimentación mostraron un aumento de peso entre la primera y la segunda inyección, lo que corresponde a una buena salud general. Los animales que finalizaron el día 14 y el día 28 ± 1 después de la segunda inyección de gmRPC se examinaron a través del microscopio quirúrgico. Se consideró que tanto el segmento anterior como el posterior de la mayoría de los ojos examinados estaban "dentro de los límites normales" (WNL). No hubo signos de inflamación u otras anomalías visibles en los grupos no tratados, tratados de forma simulada y tratados con gmRPC, lo que indica que la inyección intravítrea de gmRPC no provocó respuestas inflamatorias ni daños físicos en los tejidos detectables mediante este método. Los grupos de células que componen el injerto fueron visibles en el vítreo tanto el día 14 como el día 28 ± 1 después de la segunda inyección de gmRPC (Figura 1). La inyección repetida de gmRPC no indujo cambios notables en el tamaño de los grupos de células, lo que es compatible con la supervivencia sostenida de las células del donante. También se evaluó la patología macroscópica en el criterio de valoración terminal y no se observaron globos oculares agrandados (indicativo de formación de tumores) ni otras anomalías.

Figura 1. GmRPC trasplantadas visualizadas in vivo mediante fotografía del fondo de ojo a través de un microscopio quirúrgico (todo=ojo izquierdo, OS). (A, B), animales tratados de forma simulada (simulado/simulado, S/S); (C, D), los animales de control con el ojo derecho tratado de forma simulada seguido del ojo izquierdo tratado con gmRPC (simulado/célula, S/C), y los animales con ambos ojos tratados secuencialmente con gmRPC (célula/célula, C/C) fueron observado y fotografiado a través del microscopio quirúrgico. El panel superior (A, C, E) muestra imágenes de OS tomadas el día 14 después de la segunda inyección; el panel inferior (B, D, F) muestra imágenes de OS tomadas el día 28 después de la segunda inyección. Los aloinjertos se observaron como grupos de células de color pálido (flechas) visibles en el vítreo de los ojos izquierdos inyectados con células (S/C, C/C) en ambos momentos (Día 14: (C, D); y Día 28: ( mi, f)). Aparte de los injertos, no se observó inflamación evidente ni anomalía adicional en los segmentos anterior y posterior, vistos axialmente de esta manera.

2.2. El etiquetado inmunofluorescente mostró células inmunes en el vítreo

Se realizó un marcaje inmunofluorescente para cinco tipos principales de células inmunitarias (macrófagos, neutrófilos, células asesinas naturales, células T y células B) en las criosecciones oculares y reveló una infiltración positiva de células inmunitarias en el ojo después de la inyección de gmRPC (Figura 2A-F). Las células T (CD3), las células B (CD45R), los neutrófilos (Ly-6G) y las células asesinas naturales (CD49b) exhibieron una presencia limitada en los ojos inyectados con gmRPC, mientras que los macrófagos activados (Iba-1 ) fueron las principales células inmunes que respondieron a los injertos intravítreos. El tejido comparable de animales no tratados y tratados de forma simulada no mostró células inmunitarias en criosecciones oculares, lo que sugiere que la infiltración de células inmunitarias observada fue una respuesta a los injertos de gmRPC. De acuerdo con esta observación, las células inmunes se ubicaron en el área que rodea los injertos de gmRPC o dentro de los propios grupos de gmRPC.

Figura 2. Inmunomarcaje de células inmunes infiltradas por grupo de tratamiento. Imágenes inmunofluorescentes de (A) secciones de control (anticuerpo secundario solo), (B) anti-Iba-1 (marcador de microglia y macrófagos activados), (C) anti-Ly-6G (marcador de neutrófilos), (D) anti-CD49b (marcador de células asesinas naturales), (E) anticuerpos anti-CD3 (marcador de células T) y (F) anti-CD45R (marcador de células B) se muestran en la figura. Las señales rojas limitadas presentes indican un etiquetado de anticuerpos positivo para los marcadores de leucocitos, las señales verdes indican los injertos de gmRPC y las señales azules indican el etiquetado nuclear DAPI. El amarillo es una superposición inespecífica de señales, más obvia en los segmentos externos de los fotorreceptores que exhiben autofluorescencia. Grupos de tratamiento: sin tratamiento (UT), ambos ojos sin tratamiento; S/S, ambos ojos tratados de forma simulada (secuencialmente) con vehículo; S/C, ojo derecho inyectado con vehículo seguido por ojo izquierdo con 50,000 gmRPC y; C/C, en ambos ojos se inyectan 50000 g de RPC (secuencialmente) según el programa de la Sección 4

Los números máximos de cada célula inmune en el ojo variaron según el tipo de célula (Figura 3A-E). Por el contrario, el ANOVA de dos vías no reveló diferencias en la infiltración de células inmunitarias al comparar los animales que recibieron inyecciones únicas de gmRPC (simulado/células) con aquellos que recibieron inyecciones bilaterales (células/células). Este fue el caso de la infiltración de macrófagos (tinción anti-Iba-1) (Figura 3A), neutrófilos (tinción anti-Ly-6G) (Figura 3B), células asesinas naturales (tinción CD49b) ( Figura 3C), células T (tinción de CD3) (Figura 3D) y células B (tinción de CD45R) (Figura 3E).

2.3. ELISPOT no mostró respuestas de recuperación de antígenos

ELISPOT es una forma de analizar la activación de células T que produce IFN específico de antígeno. El tratamiento con 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) fue un control positivo que imitaba al segundo mensajero, DAG, para activar la vía del receptor de células T y, a su vez, provocar la activación de las células T. En la Figura 4A-D, los grupos tratados con PMA mostraron recuentos puntuales de IFN mucho más altos en comparación con los grupos de control con células respondedoras solas (es decir, linfocitos de CLN, esplenocitos de bazo). Cuando las células respondedoras se cultivaron conjuntamente con esplenocitos C57BL/6 (B6 SPL), las muestras del día 14 fueron comparables a los grupos de células respondedoras solas, con recuentos de manchas de IFN solo ligeramente superiores, lo que indica una falta de activación de células T (Figura 4A, B).

Figura 3. Cuantificación de la infiltración de células inmunes después del trasplante de gmRPC. Las células inmunes infiltradas se visualizaron como señales fluorescentes rojas dentro del campo de imágenes después de la inyección de gmRPC para cada condición experimental, se contaron usando ImageJ y se representaron en gráficos de barras. Datos de Iba-1 (marcador de microglia y macrófagos activados) (A), anti-Ly-6G (marcador de neutrófilos) (B), anti-CD49b (marcador de células asesinas naturales) (C), anticuerpos En la figura se muestran anti-CD3 (marcador de células T) (D) y anti CD45R (marcador de células B) (E). Se utilizaron pruebas ANOVA de dos vías para probar la significancia entre los grupos simulado/célula y célula/célula; Los valores de p fueron: (A) p < {{10}}.4492, (B) p < 0.9376, (C) p < 0.119{{18 }}, (D) p < 0,6411 y (E) p < 0,7201 (ninguno fue significativo).

Cuando se probaron células de donantes alogénicos usando este ensayo, las células respondedoras de los animales inyectados intraperitonealmente con gmRPC (grupo IP) no tuvieron respuestas de recuperación de antígeno ya que las muestras no mostraron más activación de células T mediante recuentos puntuales de IFN en comparación con los animales simulados nunca expuestos. a gmRPC (sham/sham). Los animales a los que se les inyectaron intravítreamente gmRPC, ya sea una vez (simulado/célula) o repetidamente (célula/célula), tampoco mostraron respuestas de recuperación de antígeno. En un caso, las respuestas a la dosificación repetida de gmRPC parecieron más apagadas (Figura 4B). En conjunto, estos resultados indicaron que las gmRPC exhiben una antigenicidad muy baja. Tenga en cuenta que los esplenocitos C57BL/6 coincidieron con los antecedentes genéticos de los gmRPC. Inesperadamente, las células estimuladoras alternativas, gmRPC, aumentaron el recuento de manchas de IFN en todos los grupos experimentales en comparación con los grupos de control negativo (Figura 4A-D). Una posible explicación podría ser que los gmRPC provocan un fondo elevado en este ensayo. Es importante destacar que no hubo diferencias entre los grupos de inyección única de gmRPC, no tratados, tratados de forma simulada y de inyección repetida de gmRPC, lo que nuevamente indicó una ausencia de respuestas de recuperación de antígeno.

Figura 4. Cuantificación de ELISPOT después del trasplante de gmRPC. Los ensayos ELISPOT se establecieron en los siguientes grupos: control, células respondedoras solas (linfocitos o esplenocitos que contienen células T aisladas de ganglios linfáticos cervicales (CLN) o bazos (SPL) de los animales experimentales; PMA, células respondedoras tratadas con forbol {{1} }miristato 13-acetato (PMA) e ionóforo de Ca; B6 SPL, células respondedoras mezcladas con esplenocitos aislados de animales C57BL/6; gmRPC, las mismas células respondedoras mezcladas con gmRPC. (A), las células respondedoras fueron los esplenocitos de los animales experimentales que fueron sacrificados el día 14 después de la segunda inyección de gmRPCs. (B) Las células respondedoras fueron los linfocitos de los CLN de los animales experimentales que fueron sacrificados el día 14 después de la segunda inyección de gmRPCs. (C) Las células respondedoras fueron los esplenocitos de los animales experimentales que se sacrificaron el día 29 después de la segunda inyección de gmRPC. (D) Las células respondedoras fueron los linfocitos de los CLN de los animales experimentales que se sacrificaron el día 29 después de la segunda inyección de gmRPC. Se utilizaron pruebas ANOVA de dos factores para probar la significancia (*) entre los grupos simulado/célula y célula/célula; Los valores de p fueron: (A) p < 0.5332, (B) p < 0.0001 (significativo), (C) p < 0,0207 ( significativo), y (D) p < 0,3355.

3. Discusión 

Ha habido un interés considerable en la tecnología de células madre como medio para tratar enfermedades degenerativas de la retina y nuestro grupo ha estado explorando el uso de hRPC alogénicas en la RP. Para recopilar datos que aborden las posibles consecuencias inmunes cuando se administra más de una dosis de producto alogénico de RPC humano mediante inyección intravítrea, llevamos a cabo el presente estudio en animales utilizando gmRPC de un entorno C57BL/6 como injertos y ratones BALB/c como huéspedes. Estos antecedentes genéticos dispares se utilizaron para modelar el tratamiento secuencial con hRPC alogénicas y proporcionar datos de seguridad preliminares antes de realizar pruebas en humanos.

Para evaluar completamente las respuestas, los animales huéspedes no recibieron ningún tratamiento inmunosupresor. Comparamos las respuestas inmunes generadas por una única inyección de gmRPC con una dosificación bilateral secuencial de acuerdo con el programa de inyección descrito. Los exámenes oftálmicos no revelaron inflamación ni ninguna otra diferencia notable entre los grupos de animales que recibieron 1 dosis de gmRPC o 2 dosis de gmRPC, lo que sugiere que los receptores no estaban sensibilizados por los tratamientos iniciales de gmRPC o que la sensibilización fue sutil. Los resultados del inmunomarcaje revelaron que los cinco tipos de células inmunes examinados, a saber, células T (CD3), células B (CD45R), macrófagos (Iba-1), neutrófilos (Ly-6G) y células asesinas naturales ( CD49b), se había infiltrado en el ojo y se había dirigido a los injertos de RPC después del trasplante. Sin embargo, esta infiltración fue relativamente moderada y, aunque se detectaron otros tipos de células, estaba compuesta predominantemente por macrófagos positivos para Iba-1. Estaba presente un número muy limitado de células T, células B, neutrófilos y células asesinas naturales. Curiosamente, la supervivencia demostrada por los injertos únicos y repetidos de RPC fue equivalente, sin pérdida de injertos en ninguno de los casos, a pesar de la presencia de macrófagos. En general, esto sugiere que las respuestas inmunes tanto innatas como adaptativas a RPC genéticamente dispares fueron moderadas, aunque no se empleó la supresión inmune. Además, los resultados del ensayo ELISPOT no mostraron respuestas de recuperación de antígeno en los grupos tratados con gmRPC, lo que coincide con la afirmación de que las células T no desempeñan un papel importante en el rechazo de los injertos de gmRPC de ratones C57BL/6. Nuevamente, se observó infiltración de macrófagos en injertos de gmRPC, aunque esto no se asoció con una destrucción significativa del injerto del tipo asociado con el rechazo inmunológico clásico [22-24].

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En conjunto, estas observaciones revelan una situación que difiere claramente de los mecanismos de rechazo de trasplantes alogénicos mediados por células T y B ampliamente reconocidos que se observan en otros tejidos. Múltiples factores podrían contribuir a esta situación. Por un lado, existe la noción del ojo como un sitio "inmunoprivilegiado", aunque el grado en que el vítreo comparte tales características con la córnea y la retina está menos estudiado y quizás sea más polémico. Por otro lado, las propias RPC parecen exhibir una inmunogenicidad reducida como aloinjertos, en comparación con los tipos de células estudiados con mayor frecuencia. Como hemos demostrado anteriormente, las RPC murinas carecen de expresión inicial de los antígenos MHC de clase I y clase II, aunque estos son inducibles mediante estimulación con citoquinas. Esta ausencia de expresión de MHC podría contribuir a la supervivencia de estas células tras el trasplante. Sin embargo, la presencia de células inmunes en los injertos respalda el concepto de que la tolerancia del injerto en este contexto no es pasiva y resulta de un fenómeno inmunorregulador activo. En este caso, se debe enfatizar que el mismo tipo de infiltración de células inmunes ya estaba presente después de inyecciones únicas y no fue exacerbada por dosis repetidas, lo que subraya nuestra conclusión de que la infiltración de células inmunes de los injertos, particularmente por macrófagos, no fue el resultado de una infiltración previa. sensibilización del huésped. Dentro de los parámetros de este experimento, la repetición de la dosis no pareció disminuir la viabilidad general del injerto, lo que fue consistente con la posibilidad de una eficacia sostenida en contextos terapéuticos. Parámetros alternativos, como diferentes intervalos entre inyecciones, podrían aumentar o disminuir la actividad de las células inmunitarias en un grado que sería relevante para la aplicación clínica. No está claro si los componentes celulares de los infiltrados, incluido el predominio de macrófagos, también se aplicarían a los humanos. Además, la supervivencia de estos aloinjertos podría no depender de una retina normal con una barrera hematorretiniana sana. Los receptores BALB/c utilizados aquí son albinos y susceptibles a daños leves [30]. Además, se ha observado repetidamente una supervivencia sostenida en trabajos anteriores con varios modelos de degeneración de la retina (p. ej., [31]).

En comparación con la supervivencia del injerto, la viabilidad de las células dentro de los injertos presenta una situación más compleja. Existe una pérdida conocida de células progenitoras del SNC que se produce rápidamente después del trasplante, probablemente debido a múltiples factores que podrían incluir la retirada abrupta del factor de crecimiento. Una vez asentadas dentro del ojo, las células disociadas se fusionan en agregados esféricos, cuyos centros parecen proporcionar un microambiente subóptimo para el crecimiento, tal vez debido a la falta de vascularización y a los desafíos a la difusión de nutrientes. El aparente tropismo de los macrófagos por los injertos de RPC podría ser una respuesta inespecífica a la presencia de estas células no viables en el interior de los injertos, funcionando los macrófagos en su papel de eliminadores de desechos celulares. Alternativamente, las RPC completamente viables podrían atraer activamente a los macrófagos, por ejemplo, mediante la expresión de citocinas quimioatractivas, tras lo cual las células huésped encontrarían secundariamente los restos de las células donantes no viables. Es importante destacar que el grado de infiltración de macrófagos observado en estos entornos particulares no parece tener consecuencias negativas para el injerto o la retina del huésped, a diferencia de las respuestas a los aloinjertos celulares en sitios no inmunes privilegiados [4]. Finalmente, vale la pena mencionar que los resultados aquí reportados, aunque restringidos a un modelo murino, pueden tener implicaciones para el trabajo en humanos. A diferencia del ratón, sabemos que las RPC humanas cultivadas expresan niveles elevados de antígenos MHC de clase I al inicio del estudio; por lo tanto, la comparación es ciertamente tentativa. Sin embargo, es interesante señalar que las pruebas clínicas de injertos de hRPC subretinales realizadas por un grupo en China [13], así como el trasplante intravítreo de hRPC realizado por nuestro grupo, han demostrado posteriormente una supervivencia sostenida de los aloinjertos en pacientes no inmunodeprimidos con RP (JC -01, [32], datos no publicados). Este también fue el caso después de la inyección secuencial de ambos ojos (Extensión JC-01, datos no publicados), análoga al trabajo presentado aquí. Además, la supervivencia del injerto se observó en un estudio de seguimiento en JC-02 [33], en el que se administraron dosis repetidas secuenciales en el mismo ojo [34]. En conjunto, estos hallazgos indican que la supresión inmune no siempre es necesaria en el contexto del trasplante de progenitores neurales, particularmente en el ojo, aunque los límites de este fenómeno y los mecanismos reguladores subyacentes aún no se han dilucidado.

4. Materiales y métodos

4.1. Cultivo de células

Se eligieron gmRPC previamente caracterizadas [31] como células donantes para este estudio alogénico. Originalmente, las gmRPC se aislaron de ratones C57BL/6 transgénicos con GFP modificados genéticamente para expresar una proteína fluorescente verde mejorada (GFP). La expresión de la proteína GFP en las gmRPC fue interesante porque permite la visualización de los injertos después de la inyección sin necesidad de etiquetado adicional. Para el estudio actual, se cultivaron gmRPC en DMEM/F12 avanzado suplementado con suplemento N-2 (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, EE. UU.), Glutamax-1 (1:100, Life Technology , Carlsbad, CA, EE. UU.) y EGF (20 ng/mL, recombinante, Human, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se incubaron a 37 ◦C y 5 % de CO2. Las células se mantuvieron en suspensión mixta/colonias ligeramente unidas en matraces de cultivo de tejidos sin revestir. Las células se pasaron mediante tripsinización con TrypLE Select CTS (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) diluido 1:5 en PBS durante un minuto y se neutralizaron con 10 veces el volumen de tripsina agregado. La mezcla de células y tripsina se centrifugó a 140 g durante 2 minutos a temperatura ambiente, se eliminó el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió en medio fresco antes de sembrarlo en matraces de cultivo de tejidos a la concentración deseada. La concentración celular y la viabilidad se determinaron mediante tinción con azul tripano; Los recuentos se realizaron con Countess (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) y hemocitómetro.

Para las inyecciones intravítreas, el sedimento celular se resuspendió a 50.000 células/μl en BSS PLUS®. La concentración celular y la viabilidad se evaluaron antes y después de las inyecciones. La dosis inyectada fue de 50,000 células por ojo por inyección. La dosis y el vehículo se seleccionaron en base a nuestros estudios previos.

4.2. Animales experimentales

El propósito del presente estudio fue investigar las posibles respuestas inmunes alogénicas inducidas mediante inyección intravítrea repetida de RPC alogénicas. Los animales receptores fueron ratones BALB/c, que difieren genéticamente de los ratones C57BL/6 de los que se aislaron las gmRPC. Se consideró necesario el uso de al menos tres animales por grupo experimental tratado para cada momento para permitir la evaluación de la significancia estadística entre los grupos con respecto a las variables de resultado y las posibles pérdidas de animales durante el período experimental. Además, dados los muchos factores adicionales que potencialmente afectan el resultado experimental, como un procedimiento fallido de inyección de células o un posible desgaste como resultado de peleas de animales, los procedimientos de inyección se realizaron en cinco animales por grupo para garantizar aún más el cumplimiento de los números mínimos requeridos para el análisis estadístico.

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La Tabla 1 muestra los cuatro grupos de animales preparados para cada uno de los cuatro puntos temporales (4, 7, 14 y 28 días) en los que se realizarían evaluaciones de histopatología, incluida la inmunofluorescencia. Se prepararon dos grupos adicionales de animales a los que se les inyectaron 10ˆ6 gmRPC por vía intraperitoneal como controles positivos para cada uno de los dos puntos temporales de evaluación de ELISPOT (14 y 28 días). La Tabla 2 resume las evaluaciones programadas para cada grupo.

Tabla 1. Grupos experimentales.

Tabla 2. Puntos temporales de evaluación.

4.3. Inyección intravítrea

Las gmRPC se administraron mediante inyección intravítrea. Una vez anestesiado, se aplicaron Mydriacil (solución oftálmica de tropicamida al 1%) y fenilefrina (solución oftálmica al 2,5%) en ambos ojos del animal que se iba a inyectar. Cuando se logró la midriasis adecuada, se sujetó manualmente al animal y se giró la cabeza del animal para alinear el eje ocular del ojo que se iba a inyectar con la óptica del microscopio quirúrgico para visualizar el segmento posterior ocular (es decir, vítreo y retina). . El ojo se propuso suavemente de forma manual presionando los párpados y se usó una aguja de 31G en una jeringa de insulina para perforar suavemente la esclerótica adyacente al limbo en el cuadrante nasal inferior. Se avanzó una punta de micropipeta de vidrio pulido que contenía células del donante (o control del vehículo) a través de la incisión hasta la cavidad vítrea bajo visualización directa. Se tuvo cuidado de no alterar la integridad del cristalino o de las estructuras del segmento posterior. Las células o vehículos solos se inyectaron en un volumen de 1 microlitro. Después de varios momentos de pausa para permitir el equilibrio de la presión intraocular, la punta de la pipeta se retiró gradualmente del ojo, todo ello bajo visualización directa. Se anotó cualquier sangrado intraocular, junto con su ubicación. Después de la inyección, se colocó al animal en una jaula limpia revestida con una almohadilla desechable nueva orientada con el lado absorbente hacia arriba y el lado plástico hacia abajo, para recuperarse. La recuperación se facilitó mediante una almohadilla térmica y se verificó mediante la capacidad del animal para deambular. Después de despertar, el animal fue trasladado a la jaula postoperatoria con acceso ad libitum al agua. Los animales fueron monitoreados visualmente diariamente después de la operación. Se observaron signos mínimos o nulos relacionados con la inyección intraocular.

Después del procedimiento, se observó a los animales para detectar frotamiento del ojo operado, pelaje erizado o letargo sostenido, todo lo cual fue motivo de eutanasia inmediata. Dos animales fueron sacrificados como resultado de las heridas sufridas en combates. Todos los demás animales fueron eliminados en los puntos finales planificados. La eutanasia se realizó mediante inhalación de CO2.

4.4. Examen oftálmico

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) y respuesta a la estimulación luminosa. Como compensación por la pérdida del parpadeo, se aplicó tópicamente una solución de hipromelosa (Gonak) según fuera necesario en ambos ojos para evitar la desecación corneal. Para el procedimiento de imágenes, los animales anestesiados se colocaron sobre una almohadilla térmica y se colocaron en decúbito esternal. Al finalizar el procedimiento, se logró la reversión parcial de la anestesia con la administración de atipamezol (0.1–1 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal.

4.5. histopatología

Las respuestas inmunes en animales que recibieron dos injertos secuenciales (uno en cada ojo) se evaluaron mediante histopatología de ambos ojos el día 4, el día 7, el día 14 y el día 28 ± 1 después de la inyección del segundo ojo. Los ratones que fueron tratados según la Tabla 1 fueron eliminados según el programa indicado en la Tabla 2. Los animales fueron sacrificados mediante inhalación de dióxido de carbono. Se realizaron perfusiones cardíacas en los animales de experimentación con paraformaldehído (PFA) al 2% en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Luego, se recogieron todos los globos oculares y se dejaron en remojo en PFA/PBS al 2% durante 48 h a 4 ◦C. Los globos oculares fijos se procesaron a través de un gradiente de sacarosa (10% de sacarosa en PBS durante 1 h a temperatura ambiente, 20% de sacarosa en PBS durante 1 h a temperatura ambiente y 30% de sacarosa en PBS a 4 ◦C durante la noche) antes de ser incluidos en Medios OCT para crioseccionamiento. Se tiñeron criosecciones (10 µm) de los ojos con hematoxilina y eosina (H&E) de Harrison para visualizar la microanatomía de la retina y localizar las células del donante inyectadas.

Para los grupos tratados con gmRPC, las criosecciones se evaluaron mediante inmunofluorescencia para células GFP+ (donantes). La identificación de los tipos de células inmunitarias específicas presentes en los ojos se llevó a cabo mediante el marcaje con anticuerpos primarios específicos para lo siguiente: CD3 (marcador de linfocitos T) [35], CD45R (marcador de linfocitos B) [36], Iba-1 (marcador de macrófagos y microglia activados) [37], Ly-6G (marcador de neutrófilos) [38] y CD49b (marcador de células asesinas naturales) [39]. Las criosecciones se lavaron en PBS tres veces a temperatura ambiente y se bloquearon con 0.03 % de Triton X-100 y 10 % de suero de cabra normal en PBS (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE. UU.) durante 1 h a temperatura ambiente. CD3 anti-ratón de rata (dilución 1:100, BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.), CD45R anti-ratón de rata (1:100, BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.), Iba anti-ratón de conejo {{ 26}} (dilución 1:400, Wako Chemicals, Richmond, VA, EE. UU.), Ly-6G anti-ratón de rata (dilución 1:100, BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.) y anti-rata -Se aplicaron CD49b de ratón (dilución 1:100, BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.) a las muestras y se incubaron durante la noche a 4 grados. Las muestras se lavaron nuevamente en PBS 3 veces a temperatura ambiente. Se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con Alexa-Fluor (Alexa-Flour de cabra anti-rata -568 y Alexa-Flour de cabra anti-conejo -568, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) a las muestras durante 1 h. a temperatura ambiente. Luego, todas las muestras se lavaron en PBS otras tres veces a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se montaron utilizando DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, EE. UU.) y los portaobjetos se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente.

4.6. Ensayos ELISPOT y MLR

Las células T de memoria específicas de RPC se controlaron a las 2 y 4 semanas después de la colocación del primer injerto mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISPOT). Los grupos experimentales se configuraron como se muestra en las Tablas 1 y 2 para cada momento. El ensayo ELISPOT captura proteínas secretadas en una microplaca recubierta de anticuerpos específicos y puede usarse para determinar la activación de las células T de memoria mediante la detección de la secreción de IFN de las células T. La lectura experimental es el número de puntos de IFN en la microplaca. La cantidad de puntos de IFN presentes es indicativa de la cantidad de células T que se activan. La frecuencia de células T aloreactivas se evaluó realizando una reacción de leucocitos mixtos (MLR) de 48 h en placas 96-pocillos Multiscreen-IP (Millipore, Burlington, MA, EE. UU.). Las células respondedoras fueron linfocitos/esplenocitos que contenían células T purificadas de ganglios linfáticos cervicales (CLN) y bazos de los animales de experimentación, y las células estimuladoras fueron las gmRPC derivadas originalmente de ratones C57BL/6. Los ensayos ELISPOT se llevaron a cabo según un protocolo estándar. Las placas 96-pocillos Multiscreen-IP se humedecieron previamente con 15 µl de etanol al 35 % por pocillo en condiciones estériles. Las placas se lavaron con PBS estéril tres veces antes de aplicar a las placas 100 µl del anticuerpo de captura de IFN (clon AN-18, eBioscience, San Diego, CA, EE. UU.) diluido en PBS (2 µg/ml). Las placas se incubaron durante la noche a 4 grados antes de realizar los ensayos MLR en las placas. Las placas recubiertas con anticuerpo de captura se lavaron tres veces con PBS y luego se bloquearon con RPMI1640 durante 2 h a 37 ◦C.

Cada una de las placas de ensayo incluía los siguientes controles: pocillos que no contenían células, pocillos que contenían células sin estimulación y pocillos que contenían células con tratamientos de {{0}}miristato 13-acetato de forbol (PMA). y ionóforo de Ca como controles positivos. El tratamiento con PMA sirve como control positivo al imitar al segundo mensajero, DAG, para activar la vía del receptor de células T y, a su vez, provocar la activación de las células T, con el ionóforo de Ca facilitando la entrada de iones de calcio en las células. Las placas se incubaron durante 36 h a 37 ◦C antes de la reacción de color. Las placas se lavaron con PBS que contenía {{10}}.0Tween 20 al 1 % seis veces y luego 100 µl de anticuerpo de detección (clon R64A2, eBioscience, San Diego, CA, EE. UU.), diluidos. en PBS (0,5 µg/ml) a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37 ◦C durante 2 h más. Las placas se lavaron nuevamente con Tween 20 al 0,01% en PBS. Se aplicaron 100 µl de estreptavidina-AP (dilución 1:1000, Invitrogen) por pocillo y las placas se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. Todas las placas se lavaron tres veces nuevamente con Tween 20 al 0,01% en PBS y PBS solo otras tres veces. Finalmente, se agregaron 100 µl de BCIP/NBT (Sigma Aldrich, Munich, Alemania) a cada pocillo para colorear. Todas las placas se lavaron exhaustivamente con agua del grifo y se secaron antes del análisis de los datos.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

5. Conclusiones

Este estudio muestra que los injertos binoculares secuenciales de RPC alogénicas en la cavidad vítrea no provocan el rechazo inmunológico clásico en el ratón. Si bien se reconoce que estos estudios histológicos alogénicos no se pudieron realizar con el producto clínico RPC humano, los datos parecen consistentes con los resultados de un estudio de seguridad clínica (jCyte, JC-01E, datos no publicados) en el que pacientes con retinitis pigmentosa recibieron inyecciones bilaterales no contemporáneas sin tratamientos inmunosupresores. Si bien es difícil comparar los dos estudios directamente, cabe señalar que los resultados generales de ambos mostraron similitudes en términos de supervivencia del aloinjerto.

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