Descubrimiento de nuevos inhibidores de STING basados en la estructura del agonista de STING de ratón DMXAA
Nov 27, 2023
Abstracto:
La proteína estimuladora del gen del interferón (STING) participa en la inmunidad innata. El fármaco DMXAA (ácido 5,6-dimetilxantenona-4-acético) demostró ser un potente agonista de STING murino (mSTING), pero tuvo poco efecto sobre el STING humano (hSTING). En este artículo, nos basamos en la comparación de diferentes estructuras cristalinas y el análisis de las relaciones de interacción proteína-ligando para aventurar la hipótesis de que el diseño del fármaco de las variantes de DMXAA tiene el potencial de convertir los agonistas de STING en inhibidores. Basándonos en nuestro descubrimiento previo de dos análogos de DMXAA, 3 y 4 (ambos podrían unirse a STING), los optimizamos estructuralmente y sintetizamos nuevos derivados, respectivamente. En los ensayos de unión, encontramos que los compuestos 11 y 27 representan aglutinantes STING que eran superiores a las estructuras originales y discutimos las relaciones estructura-actividad. Todos los compuestos diana estaban inactivos en ensayos celulares para la detección de la actividad agonista de STING. Afortunadamente, identificamos 11 y 27 como inhibidores de STING con actividad micromolar en las vías hSTING y mSTING. Además, 11 y 27 inhibieron la inducción de interferón y citoquinas inflamatorias activadas por 20 3 0 -cGAMP sin citotoxicidad aparente. Estos hallazgos rompen el pensamiento rígido de que DMXAA proporciona la base estructural específicamente para los agonistas de STING y abre más posibilidades para desarrollar nuevos agonistas o inhibidores de STING.
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Palabras clave:
PICADURA; DMXAA; selectividad de especies; agonista de STING; Inhibidor de picadura
1. Introducción
El gen estimulador del interferón (STING) es una molécula de señalización esencial para la inmunidad intrínseca, mediando principalmente las respuestas inmunes naturales inducidas por el ADN citoplasmático [1]. Cuando el receptor de ADN guanosina-adenosina fosfato cíclico sintasa (cGAS) detecta ADN bicatenario intracelular, cGAS cataliza la síntesis de 2 0,30 -cGAMP (Figura 1), un dinucleótido cíclico (CDN) capaz de de unirse directamente y activar STING en el retículo endoplasmático [2–4]. Tras la activación, STING forma agregados que se reclutan aguas abajo de la quinasa 1 de unión a TANK (TBK1) y se unen al factor regulador de interferón 3 (IRF3), que fosforila el IRF3, activa los dímeros de IRF3 en el núcleo, induce la expresión del interferón tipo I (IFN) e inicia una respuesta inmune al interferón [1]. Muchos estudios han demostrado que STING está involucrado en la patogénesis de múltiples enfermedades y que la estimulación de STING induce respuestas inmunes efectivas a infecciones patógenas y cánceres; sin embargo, la falta de modulación de la señalización inflamatoria crónica conduce a enfermedades autoinmunes e inflamatorias [5–8]. Debido al papel fundamental de STING en la regulación de la inmunidad innata, un gran número de equipos han comenzado a desarrollar agonistas o inhibidores de STING.
Figura 1. Moduladores STING representativos
La investigación sobre agonistas de STING de primera generación se centró en la modificación estructural de los análogos de CDN para sortear algunas limitaciones de las CDN endógenas, como la escasa permeabilidad de la membrana y la susceptibilidad a la hidrólisis por fosfatasas [9,10]. La pequeña molécula agonista de STING 5,6-dimetilxantenona-4-ácido acético (DMXAA), que ha demostrado ser prometedora terapéutica contra tumores sólidos en modelos de ratón, podría contrarrestar los inconvenientes de los derivados de CDN [11]. Sin embargo, el fármaco fracasó en los ensayos clínicos en humanos [12]. Además, se afirma que DMXAA se une selectivamente a STING murino (mSTING) en lugar de a STING humano (hSTING) [13,14], lo que impide el potencial terapéutico de DMXAA en humanos. La 10-carboximetil-9-acridinona (CMA) es otro agonista STING específico murino representativo utilizado como potente inductor de IFN tipo I para la terapia antiviral a principios de la década de 1970 [15]. Por lo tanto, la selectividad de especies es un factor vital en el desarrollo de agonistas de STING de molécula pequeña. Los esfuerzos incansables de investigadores, incluidos diABZI, SR717, MSA02 y otros, han puesto de manifiesto importantes agonistas de hSTING novedosos y esqueléticos [16-19].
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Cada vez hay más evidencia que muestra que la hiperactivación de STING está asociada con enfermedades autoinflamatorias y autoinmunes. Es necesario limitar la activación excesiva de la vía de señalización STING, que resalta el valor potencial de los inhibidores de STING. Sin embargo, a diferencia de los agonistas de STING, el desarrollo de inhibidores de STING aún está en sus inicios y todavía no se han iniciado estudios clínicos de ningún fármaco candidato. Los inhibidores de STING conocidos incluyen dos tipos de compuestos: antagonistas competitivos (SN-011 y Merck-18) e inhibidores covalentes (H151) [20-22]. Los inhibidores covalentes de STING identificados anteriormente interactúan con Cys88/91 o Cys91, que se encuentra en el dominio transmembrana N-terminal de STING fuera del bolsillo de unión a CDN [22]. Recientemente, dos equipos han informado sucesivamente sobre dos tipos estructurales de antagonistas de STING que ocupan la bolsa de unión de 20 3 0 -cGAMP para inhibir la activación de 20 3 0 -cGAMP, lo que sugiere un efecto de doble filo en la bolsa de unión de CDN [20 ,21].
Aquí ofrecemos una nueva perspectiva. Sugerimos que el bolsillo inferior donde se encuentran DMXAA y CMA facilita el desarrollo de inhibidores de STING en función de nuestra extracción profunda de datos y la comparación de la información de la estructura cocristalina de las proteínas STING identificadas. Nuestro estudio anterior informó una serie de análogos de CMA y DMXAA e identificó los compuestos 3 y 4 que se unen a hSTING pero con una potencia celular débil [23] (Figura 2).
Figura 2. Estructuras químicas de los compuestos 3 y 4 con datos de sus actividades biológicas. Los valores de CE50 de los compuestos 1 a 4 se midieron mediante células indicadoras STING, y las CI50 de unión se midieron mediante kits de unión de competencia STING.
En este artículo, con respecto al diseño de inhibidores de STING para descubrir agentes aglutinantes más potentes con más contactos en el bolsillo inferior, realizamos optimizaciones estructurales para 3 y 4, respectivamente. Posteriormente, realizamos un estudio SAR basado en ensayos vinculantes a la competencia. En la evaluación de la bioactividad, los compuestos 11 y 27 actuaron como aglutinantes de amplio espectro y exhibieron niveles micromolares de actividad inhibidora de STING en múltiples células informadas. En términos de estructura de acoplamiento, dos moléculas del compuesto 11 mantienen hSTING en una conformación "abierta" inactiva, inhibiendo así competitivamente la unión endógena de 20 3 0 -cGAMP, que es similar a la estructura cristalina de Merck-18 y la estructura de acoplamiento. de SN-011 [20,21].
2. Resultados
2.1. Estrategia de diseño de derivados de DMXAA como inhibidores de STING
2.1.1. Identificación de sitios de diseño para inhibidores de STING mediante la comparación de diferentes estructuras cristalinas
La apoproteína del dominio de unión al ligando (LBD) de STING cristalizó como un dímero simétrico en el no ligando, lo que se demostró que no fue causado por la filtración en gel y el análisis de ultracentrifugación analítica [24-26]. El dímero STING adopta una conformación similar a una mariposa con el sitio de unión del ligando ubicado en la interfaz entre los dos monómeros. En primer lugar, este artículo examina los mecanismos infraestructurales y de activación de las proteínas hSTING y mSTING, comparando las diferencias entre ellas y revelando algunos conocimientos interesantes. Para la estructura apo, la conformación natural de ambas proteínas muestra que la mSTING está más concentrada que la hSTING (Figura 3). Shih et al. Emplearon simulaciones de dinámica molecular (MD) para estudiar las diferencias entre hSTING y mSTING, mostrando que hSTING prefiere una conformación abierta-inactiva y mSTING prefiere una conformación cerrada-activa incluso sin un ligando unido [27].
Cuando se une a 20,30 -cGAMP, la transición conformacional de hSTING es de abierta (apoproteína, distancia lateral ~57 Å) a cerrada (proteína unida a cGAMP, distancia lateral ~40 Å), mientras que lo contrario es cierto para mSTING (29 Å a 40 Å). La estructura de apo-hSTING difiere dramáticamente de la de apo-mSTING, pero las estructuras del STING complejado con 20,30 -cGAMP se superponen. DMXAA, CMA y cGAMP son agonistas de STING con diversos andamios estructurales, pero sus conformaciones de activación al unirse a proteínas mSTING también son esencialmente las mismas (Figura 3). Los escenarios descritos anteriormente atestiguan que los mecanismos de estimulación de hSTING y mSTING son sorprendentemente divergentes; Sin embargo, las conformaciones activadas por STING son relativamente constantes, independientes de la selectividad de la especie y del tipo de columna vertebral del agonista (aunque se limitan a los agonistas de STING que provocan cambios conformacionales). Los volúmenes de las bolsas de unión de los diferentes complejos cristalinos son generalmente convergentes (~300 Å3, Tabla S1), lo que es una prueba más de la estabilidad de la conformación de activación de la proteína STING.
Figura 3. Comparación de estructuras cristalinas STING unidas a apo y compuestas. La proteína mSTING es trigo (distancia probada con línea roja), código PDB: 4KC0 (apo), 4LOJ (cGAMP unido), 4LOL (DMXAA unido) y 4JC5 (CMA unido).
En segundo lugar, con base en los hallazgos anteriores sobre la estabilidad conformacional de la activación, superpusimos estructuras cocristalinas de cGAMP, DMXAA, CMA, SR717 y MSA02, que son agonistas de STING conformacionales cerradas, para explorar la posición de los diferentes agonistas estructurales en la Sitios de unión a proteínas STING. La bolsa de proteínas se puede dividir en dos regiones: la bolsa inferior y la bolsa superior, siguiendo la distribución de los agonistas de STING en la bolsa de proteínas (Figura 4a). Excepto que los agonistas de mSTING, DMXAA y CMA, están completamente en el bolsillo inferior, los otros agonistas podrían activar la vía de hSTING y ubicarse en la región superior. Luego mapeamos las interacciones de los cinco agonistas de STING con residuos de aminoácidos unidos a la proteína STING (dentro de 5 Å del ligando; Figura S1), mostrando que los aminoácidos primarios incluían R238, Y167, R232, S162, T263 y T267. (el número de secuencia de residuos correspondiente a mSTING menos uno). Al hacer coincidir los residuos secuencialmente con los bolsillos se demostró que T267, T263 y S162 se encuentran en el bolsillo inferior; el bolsillo superior contiene R238, R232 e Y167 (Figura 4b). Como se informó, R238, Y167 y R232 son esenciales para la unión de agonistas a STING, especialmente R238 (la proteína mSTING corresponde a R237), cuya mutación resultaría en una pérdida completa de estabilización (unión a ligando) [28-30]. Che et al. También reveló que el residuo clave R238 domina la unión de DMXAA, y las mutaciones puntuales (S162A/E260I) pueden mejorar la interacción de R238 con DMXAA mediante simulaciones MD [31].
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Para ocupar el bolsillo de la proteína mSTING, DMXAA o CMA adoptaron un modo de unión único en el que dos agonistas de molécula pequeña se unen a un único homodímero de mSTING. Los DMXAA se montan firmemente en el bolsillo inferior mediante enlaces de hidrógeno entre el grupo ceto y la cadena lateral T266 (hSTING corresponde a 267), mientras que el grupo carboxilato interactúa con las cadenas laterales R237 y T262 (Figura 5a). La interacción de DMXAA con R237 (el único aminoácido clave en el bolsillo superior) es crucial para la actividad mSTING. Un detalle que a menudo se pasa por alto es que DMXAA solo puede actuar sobre R237 de proteínas monoméricas simétricas, por ejemplo, DMXAA (molécula A) que afecta a R237B (Figura 5a). Debido a que DMXAA se encuentra en la parte inferior, la distancia entre la molécula A y R237B es de 3,06 Å, mientras que la distancia a R237A es mayor que 5 Å (Figura 5b). Al beneficiarse del bolsillo más compacto de la proteína mSTING, DMXAA interactúa sin esfuerzo con R237 del monómero mSTING simétrico, pero no hay forma de que DMXAA se asocie con ninguno de los R238 en la proteína apo-hSTING conformacionalmente abierta (Figura 3). Por tanto, la posición del bolsillo de DMXAA perjudica la estimulación de la vía hSTING. Recientemente, Merck, inspirándose en la relación de unión 2:1 de DMXAA, ha descubierto antagonistas de STING capaces de ocupar el bolsillo de unión [21]. El complejo cristalino de Merck 18 y la proteína hSTING muestra que el compuesto se encuentra principalmente debajo de la bolsa de proteína e interactúa con S162, T263 y T267, todos los cuales coinciden con las propiedades de DMXAA (Figura 5c). A partir de esto, se generaron hipótesis: el bolsillo superior es una cavidad excelente para diseñar agonistas de STING; el bolsillo inferior es un nido más adecuado para inhibidores y la estructura de DMXAA o CMA está optimizada para tener el potencial de convertirse en un antagonista de STING.
Figura 4. Subdivisión de los sitios de unión de STING y distribución con aminoácidos clave. ( a ) Ubicación de dos regiones en el monómero STING. El bolsillo inferior es de color magenta y el bolsillo superior es de color verde. Los códigos PDB para los complejos cristalinos superpuestos son los siguientes: 4LOH (cGAMP, verde), 6UKV (MSA-02, amarillo), 6XNP (SR717, naranja), 4LOL (DMXAA, magenta) y 4JC5 (CMA, púrpura). (b) Distribuciones de aminoácidos clave en las regiones superior e inferior. Los residuos en el bolsillo inferior se muestran en magenta y los verdes en la región superior.
Figura 5. Complejos cristalinos de DMXAA y Merck 18. (a) Contactos intermoleculares en el complejo de DMXAA y mSTING. El DMXAA unido se muestra en color gris, con las subunidades STING individuales en el dímero simétrico en verde y morado. Los superíndices A y B indican la identidad del monómero proteico o del ligando individual. ( b ) Distancias entre los residuos clave R237A y R237B, respectivamente, y DMXAA (molécula A). R237A con respecto al carboxilo de DMXAA es 6,02 Å, R237B con respecto al carboxilo de DMXAA es 3,06 Å. (c) Estructura cristalina de Merck 18 unida a la proteína hSTING (PDB 6MXE) y detalles de sus contactos intermoleculares. El ligando unido se muestra en color gris, con las subunidades STING individuales en el dímero simétrico en verde y morado. Los superíndices A y B indican la identidad del monómero proteico o del ligando individual.
Figura 6. Base de investigación y nuestros puntos de acceso optimizados para derivados de DMXAA y CMA. (a) Superposición de la estructura de DMXAA unida a mSTING (PDB: 4LOL, mostrado en azul oscuro) con la estructura de DMXAA unida a hSTING S162A/G230I/Q266I (PDB: 4QXR, mostrado en naranja). ( b ) Detalles de DMXAA unido a hSTING mutado (PDB: 4QXR). Los cuadros de línea discontinua representan los posibles sitios de modificación. Los residuos amino que se muestran en verde son residuos mutados (S162A/Q266I).
Descubrimos que la incapacidad de DMXAA para activar la vía de alojamiento estaba relacionada con la ubicación de DMXAA en el bolsillo inferior (según la Sección 2.1.1), lo que también nos proporcionó la idea de diseño de los inhibidores STING: aumentar los contactos de los derivados de DMXAA. con la región inferior a través de modificaciones estructurales para mantener a STING en una conformación no activada. S162 y Q266 se encuentran apropiadamente en la parte inferior del sitio de unión, por lo que los DMXAA pueden ubicarse bien en contacto directo con ambos, lo que facilita la exploración del efecto de los aminoácidos del bolsillo inferior sobre los ligandos. El análisis de las relaciones estructura-actividad (SAR) reveló que el resto 5,6-dimetilo y el metoxi en la posición C7- eran cruciales para la actividad biológica de 3 y 4. Como se muestra en la Figura 6b, el 5 El grupo ,6-dimetilo creó interacciones hidrófobas con múltiples aminoácidos en el bolsillo inferior; debido a la proximidad de la posición C7 de DMXAA al aminoácido Q266, la correspondiente modificación metoxi permitió que 3 y 4 se unieran al alojamiento. Por lo tanto, nuestras elaboraciones estructurales presupusieron el bloqueo de 5,6-dimetilo y metoxi C7, y el diseño de nuevos derivados se centró en modificar el grupo polar en la posición C1/C2 (que afecta a S162) y cambiar el grupo ácido carboxílico ( ampliar la diversidad estructural). Diseñamos y sintetizamos una serie de derivados utilizando los compuestos 3 y 4 como andamios, validando así nuestra conjetura inhibidora propuesta.
2.2. Química
La preparación de todos los compuestos intermedios y objetivo se describe en el Esquema 1. 1-metoxi-2,3-dimetil-4-nitrobenceno (5) y ácido 2-bromobenzoico ( 7) estaban disponibles comercialmente. Inicialmente, 1-metoxi-2,3-dimetil-4-nitrobenceno se convirtió en 4-metoxi- 2,3-dimetilanilina (6) mediante reducción con polvo de hierro. Luego, 6 y 7 se sometieron a la reacción de Ullmann con carbonato de potasio con catálisis por cobre y óxido de cobre (I) en N,N-dimetilformamida para proporcionar el correspondiente intermedio 8. La reacción de condensación intramolecular de 8 se realizó con reactivo de Eaton para proporcionar el intermedio. 2-metoxi-3,4-dimetilacridina-9(10H)-ona (9). La sustitución posterior de 9 se realizó con bromoacetato de etilo y la pérdida de 1 equivalente de HBr produjo etil 2-(2-metoxi-3,4-dimetil-9- oxoacridina-10(9H)-il)acetato (10). Finalmente, el acetato de etilo en 10 se hidrolizó a ácido carboxílico mediante hidróxido de sodio, produciendo 2-(2-metoxi-3,4-dimetil-9-oxoacridina-10 Ácido (9H)-il)acético (11).
Esquema 1. a. EtOH, Fe, NH4Cl; b. DMF, Cu, Cu2O, K2CO3; C. reactivo de Eaton; d. BrCH2COOC2H5, NaH; mi. NaOH; F. CCl3CH(OH)2, NH2OH; gramo. H2SO4; h. EtOH, H2O2, NaOH.
Para la síntesis posterior de más compuestos objetivo, primero debemos sintetizar el compuesto ácido 2-amino-5-metoxi-3,4-dimetilbenzoico (14). 6 se hizo reaccionar con hidrato de cloral e hidroxilamina, formando acetamida e hidroxiamino, con el intermedio (E)-2-(hidroxilamina)-N-(4-metoxi-2,3-dimetilfenilo )acetamida (12). La posterior reacción de transposición de Beckmann del hidroxiamino de 12 se realizó con ácido sulfúrico para producir el derivado de lactama 13. Finalmente, el intermedio 13 se hidrolizó con peróxido de hidrógeno e hidróxido de sodio en una solución de etanol dando 14. Usando 14 como material de partida para la reacción, Sintetizó además una serie de 8-metoxi-9,10-dimetil-6Hpirrolo[3,2,1-de]acridina-1,6( Derivados de 2H)-diona con sustituyentes en R1 y R2. Inicialmente, 14 y 15-19 se sometieron a la reacción de Ullmann con carbonato de potasio con catálisis por cobre y óxido de cobre (I) en N, N-dimetilformamida para proporcionar los intermedios correspondientes 20-24. Las reacciones de condensación intramolecular de 20–24 se realizaron con el reactivo de Eaton para producir 8-metoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,{{46} }de]acridina-1,6(2H)-derivados de diona (25–29). De manera similar, utilizando 14 como material de partida para la reacción, sintetizamos además una serie de 7-metoxi-5,6-dimetil-9-oxo-9,{{ 59}}derivados del ácido carboxílico dihidroacridina-4- con sustituyentes en R. Inicialmente, 14 y 7 o 30 se sometieron a reacción de Ullmann con carbonato de potasio con catálisis por cobre y óxido de cobre (I) en N, N-dimetilformamida para proporcionar los intermedios correspondientes 31 y 32. Las reacciones de condensación intramolecular de 31 y 32 se realizaron con el reactivo de Eaton para producir 7-metoxi-5,6-dimetil-9-oxo-9 ,10-dihidroacridina-4-derivados del ácido carboxílico (33,34). Por lo tanto, diseñamos, sintetizamos y seleccionamos 16 análogos de acridona, cuyas estructuras se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Estructuras de los nuevos análogos del presente estudio.
2.3. Potencias de unión de nuevos compuestos a STING y sus SAR
Potencias de unión de nuevos compuestos a STING y sus SAR Para confirmar directamente la efectividad de la modificación estructural, primero analizamos todos los compuestos sintetizados mediante ensayos de desplazamiento de cGAMP. Además de la selectividad de especies, existen cinco variantes de STING que son polimórficas en humanos, R232 (WT, 58% de la población), HAQ (20%), H232 (13%), AQ (7%) y Q ( 2%) [32]. Por lo tanto, utilizamos los kits de ensayo de competencia comerciales mediante tecnología de fluorescencia homogénea de resolución temporal (HTRF) para probar la potencia bioquímica de nuevos compuestos en mSTING y varias isoformas de hSTING (WT, H232 y AQ) y los comparamos con el control. Como se anticipó, todos los compuestos de control 1 a 4 estaban unidos a mSTING; en la pantalla hSTING, los compuestos 3 y 4 tenían valores de CI50 a nivel micromolar.
Tabla 2. Resultados de compuestos con diversas isoformas de hSTING y ensayos de unión competitiva de mSTING.
Primero, basándose en el compuesto 3, se introdujo un átomo de halógeno o un grupo metoxi en el sitio C1/C2 (Tabla 1). El compuesto 27, como derivado óptimo del compuesto 3 (posición C1 sustituida por F), tiene mejor actividad general que el compuesto 3 (actividad micromolar de un solo dígito en todos los ensayos bioquímicos, Tabla 2). El compuesto 25 modificado con R1- tiene un efecto de unión de amplio espectro, pero no es tan activo como la versión sustituida o no sustituida con F. En comparación con el compuesto 3, los compuestos (26, 28 y 29) con el grupo introducido en el sitio C2- mostraron diferentes grados de disminución en la afinidad de unión, especialmente el compuesto 29. En segundo lugar, mantener la columna vertebral del compuesto 4 y reemplazar el átomo de halógeno contra el sitio C1/C2, obtuvimos los compuestos 35–38 (Tabla 1). Estos compuestos fueron inactivos en los cuatro ensayos de desplazamiento en concentraciones de hasta 100 µM, lo que demuestra que no se tolera la sustitución con un átomo de halógeno en el sitio C1/C2. Luego, convertimos el grupo acetato del compuesto 4 en un grupo carboxilo (33) e introdujimos metoxi en el sitio C2 (34). Desafortunadamente, este cambio fue un fracaso ya que ambos compuestos permanecieron inactivos. Aprendiendo de nuestro fracaso, exploramos más a fondo los SAR de los derivados del compuesto 4 cambiando el grupo acetato a la posición N y dejando las posiciones C1/C2 sin modificar. El compuesto 11 muestra unión a una amplia gama de variantes de STING, todas con IC50 por debajo de 20 µM; la actividad es superior al compuesto 4 y comparable al compuesto 27. Además, el compuesto 9 (sin grupo carboxilo en el sitio N) y el compuesto 10 (N-acetato de etilo) son precursores sintéticos del compuesto 11 que no pueden unirse a STING, lo que demuestra indirectamente La importancia del grupo ácido carboxílico.
2.4. Evaluación biológica celular
2.4.1. Detección in vitro de nuevos análogos con actividades agonistas de STING
Examinamos sistemáticamente todos los compuestos para detectar actividad agonista de STING utilizando las líneas celulares informadoras 293T hSTING-WT, 293T-mSTING y THP1-KO-STING (proporcionadas por Invivo Gen). Utilizando células 293T-hSTING-R232 y células 293T-mSTING, mostramos la activación de la vía IRF como una medida indirecta de la inducción de IFN tipo I mediante el monitoreo de la actividad de la fosfatasa alcalina embrionaria secretora (SEAP), contribuyendo a nuestro estudio de la selectividad de especies de compuestos. Las células THP1-KO-STING se generaron a partir de células THP1-Duales mediante inactivación estable del gen STING, y empleamos células THP1-KO-STING para confirmar si el compuesto exhibe la función de la inducción de citoquinas dependiente de STING. Comparamos las actividades agonistas de STING de todos los derivados específicos con las de los agonistas de referencia para STING murino (DMXAA) y humano (20,30 -cGAMP). Sorprendentemente, ninguno de los compuestos sintetizados pudo activar las vías hSTING o mSTING (concentración máxima a 200 µM), lo que es seriamente inconsistente con los resultados de los ensayos de unión. Por lo tanto, nuestros agentes aglutinantes de STING seleccionados pueden tener patrones de unión potenciales como nuevos antagonistas de STING.
2.4.2. Detección in vitro de aglutinantes de STING con actividades inhibidoras de STING
Primero, hicimos experimentos previos: con el inhibidor covalente H151 1 µM como referencia positiva, exploramos sus niveles inhibidores en líneas celulares informadoras mSTING y hSTING cocultivadas con diferentes concentraciones de 20 3 0 -cGAMP para determinar las condiciones óptimas. para detectar el inhibidor (consulte la Sección 4.2.3 para obtener detalles del protocolo). En segundo lugar, inicialmente evaluamos la potencia inhibidora de los nuevos compuestos mediante tratamiento con métodos preexperimentales a una concentración de 100 µM. Descubrimos que los compuestos 11 y 27 de unión a STING de amplio espectro exhibieron una excelente inhibición en células indicadoras STING tanto murinas como humanas, mientras que los compuestos 3 y 4 y los otros compuestos no fueron tan efectivos. En tercer lugar, establecimos gradientes de concentración para los compuestos 11 y 27 para probar ambos valores de IC50 y compararlos con H151. Los compuestos 11 y 27 fueron activos en concentraciones micromolares inhibiendo la expresión de IFN-inducida por 20 3 0 -cGAMP en las vías hSTING y mSTING.
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Con valores de IC50, el compuesto 11 (hSTING 19,93 µM y mSTING 15,47 µM) superó al compuesto 27 (hSTING 38,75 µM y mSTING 30,81 µM) (Figura 7a). En comparación, los valores IC50 de H-151 en células 293T-hSTING y 293T-mSTING fueron 1,04 y 0,82 µM (Figura 7a), lo que indica que el inhibidor covalente H-151 exhibe un mejor efecto inhibidor sobre STING. -Señalización dependiente en ensayos basados en células. Para confirmar aún más la propiedad inhibidora de los compuestos 11 y 27, empleamos otra línea celular indicadora de monocitos humanos THP-1, THP1-Dual-hSTING-R232, que utiliza un sistema de indicador dual para informar sobre la activación de IRF. como medida indirecta de la inducción de IFN tipo I y de la activación de NF-κB como medida indirecta de la inducción de citoquinas proinflamatorias. Después de la estimulación de la línea celular informadora THP-1 con 20,30 -cGAMP, agregamos inhibidores de STING con concentraciones apropiadas para inhibir las inducciones de IFN y citoquinas proinflamatorias. Como se anticipó, los compuestos 11, 27 y H151 inhibieron significativamente las activaciones de las vías IRF y NF-κB desencadenadas por STING (Figura 7b). Además, para excluir el efecto de la citotoxicidad de los compuestos sobre la actividad inhibidora, utilizamos el kit CellTiter-Glo para analizar la actividad celular. Afortunadamente, los compuestos 11 y 27 no mostraron evidencia de citotoxicidad para las células 293T y THP-1 mediante el ensayo de viabilidad celular cuando se agregaron en concentraciones (5 a 100 µM) que inhiben STING, en contraste con H151, que ya mostró una citotoxicidad significativa en 10 µM (Figura 7c). Estos estudios identificaron los compuestos 11 y 27 como inhibidores moderados de STING, rompiendo la sensibilidad de las especies e inhibiendo las vías duales IRF y NF-κB sin citotoxicidad aparente.
2.5. La base estructural de la actividad del compuesto 11 se investigó mediante el acoplamiento
El mecanismo de los antagonistas competitivos de STING es ocupar el sitio de unión e interrumpir la conformación de activación de la proteína STING [20, 21]. Específicamente para hSTING, los antagonistas dejan el dímero hSTING en una conformación "abierta". Utilizamos el acoplamiento Glide para determinar la interacción entre STING CTD humano (código PDB ID 6MXE) y el mejor compuesto activo 11. En la estructura de acoplamiento, los dos compuestos 11 son parcialmente paralelos entre sí y se encuentran en el fondo de la hendidura de el dímero hSTING (Figura 8a), bloqueando hSTING en una conformación abierta inactiva (Figura S2). El compuesto 11 produce interacciones principalmente hidrófobas, y la estructura tricíclica del ligando permite un mayor contacto con la interfaz en el bolsillo inferior. Al igual que con DMXAA o CMA, el grupo carboxilo forma un enlace de hidrógeno con la cadena lateral de T263, mientras que el grupo ceto forma un enlace de hidrógeno con la cadena lateral de T267. El metoxi en la posición C2 interactúa íntimamente con S162, lo que resulta en una proximidad ligando-ligando entre sí. Los sustituyentes bis-metilo no solo generan interacciones ligando-ligando sino que también están convenientemente ubicados en la entrada del bolsillo superior, lo que evita la unión de los agonistas naturales de STING a residuos clave (Figura 8b).
Figura 7. Los aglutinantes de STING 11 y 27 de amplio espectro son antagonistas de STING. ( a ) Estructuras químicas de los compuestos 11 y 27, y la actividad inhibidora de los inhibidores de STING contra las vías m- y h-STING. Las células 293T (mSTING o hSTING), pretratadas con diferentes concentraciones de compuestos, fueron estimuladas por 20,30 -cGAMP; La inhibición de la actividad de la vía IRF se midió indirectamente mediante valores de densidad óptica (OD). Se ajustó la curva inhibidora dependiente de la dosis para calcular las IC50 de los compuestos. (b) Los compuestos 11 y 27 pueden inhibir la activación de las vías duales de hSTING. Las líneas celulares informadoras THP1-hSTING-R232 se estimularon con 20,30 -cGAMP y se trataron con los compuestos que inhibían la inducción de IFN- (evaluando la actividad mediante las unidades relativas de luz (RLU) de la luciferasa Lucia. ) e inducción de citocinas proinflamatorias (monitoreo de la actividad de SEAP medida por los valores de OD). (c) Los nuevos análogos presentan una citotoxicidad baja en comparación con el inhibidor covalente. Se incubaron células 293T (o THP-1) con la concentración indicada de inhibidores durante los períodos de tiempo indicados. La viabilidad celular se midió mediante kits CellTiter-Glo. Los datos mostrados son la media de tres experimentos independientes. NS (no significativo) p > 0,05, *** p < 0,001. Los valores de p se calcularon mediante una prueba t de dos colas.
Figura 8. Estructura de acoplamiento del compuesto 11 unido a la proteína STING. (a) Modo de unión del compuesto 11. El ligando unido se muestra en color gris, con las subunidades STING individuales en el dímero simétrico mostradas en verde y morado. En los bolsillos de unión del monómero STING, la parte inferior es de color magenta y la parte superior es verde. (b) Los contactos intermoleculares del compuesto 11 están unidos a STING. El compuesto 11 y los aminoácidos STING contactados se muestran como un modelo de barra. Los contactos intermoleculares y los enlaces de hidrógeno se muestran con una línea discontinua amarilla. Los superíndices A y B indican la identidad del monómero proteico o del ligando individual.
3. Discusión
A la luz de los extensos informes sobre el mecanismo y la estructura cristalina de STING, tenemos la oportunidad de explicar el problema científico de por qué DMXAA no posee actividad agonística de STING humana. En este estudio, comparando varias estructuras cristalinas de STING, obtuvimos algunos hallazgos interesantes: 1. La conformación de activación de STING es estable; 2. Existen diferentes mecanismos de activación para hSTING y mSTING; 3. DMXAA y CMA se encuentran en la parte inferior del sitio de unión, lo que los distingue de otros agonistas. Dados los diferentes mecanismos de activación de mSTING y hSTING, los agonistas de mSTING DMXAA o CMA ubicados en el bolsillo inferior no pueden ejercer una activación en hSTING porque apo-hSTING tiene una cavidad de unión más grande que impide que el ligando se asocie con R238.
Gao et al. informaron que mutaciones únicas (G230I, S162A y Q266I) dotan a hSTING de la misma sensibilidad a DMXAA que mSTING [33]. Las simulaciones de MD revelaron que la cadena lateral de la mutación de la región del párpado G230I es suficiente para formar una barrera estérica para prevenir la excreción de DMXAA, mientras que DMXAA sale fácilmente en hSTING WT [27]. Con base en la modificación estructural correspondiente a las mutaciones puntuales de hSTING (S162A/Q266I) en el sitio de unión, se encuentran disponibles análogos sustanciales de DMXAA y CMA, pero no agonistas potentes de hSTING. La razón detrás de esto podría ser que la sutil discrepancia estructural entre hSTING "naturales" y "mutados" podría desempeñar un papel crucial en el proceso de reconocimiento. A través de simulaciones MD, Che et al. descubrieron que los hSTING mutados de forma antinatural alteran los movimientos coordinados de las moléculas de agua y alteran la cantidad de agua expulsada tras la unión del ligando, lo que es más propicio para restaurar la activación de hSTING por DMXAA [31].
Alentados por el descubrimiento del estudio de inhibidores de STING en el sitio de unión inferior [21], nos aventuramos a imaginar que el DMXAA, ubicado en la misma región, tiene el potencial de transformarse en nuevos inhibidores de STING. En un estudio anterior, fusionamos las estructuras de DMXAA y CMA con modificaciones estructurales sutiles y descubrimos con éxito 3 y 4 que podrían unirse a hSTING, pero su débil actividad agonista de STING no coincide con su potencia de unión. En este artículo, la idea de diseño es mejorar aún más los contactos de los análogos de DMXAA con el bolsillo inferior para resistir competitivamente la unión de 20,30 -cGAMP, por lo que diseñamos y sintetizamos estructuras optimizadas de los compuestos 3 y 4.
cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico
El primer paso de selección fue probar la actividad bioquímica utilizando los kits de unión de múltiples variantes de STING para caracterizar la potencia de unión de los nuevos derivados. Los resultados de los ensayos vinculantes demostraron la solidez de nuestras direcciones de diseño; Identificamos 11 y 27 como aglutinantes STING de amplio espectro (superiores a 3 y 4) y discutimos los SAR. Para los análogos del compuesto 3, las modificaciones en la posición C1 mejoraron significativamente la unión a varias variantes de STING, mientras que los compuestos modificados con C2-no tuvieron ningún efecto. Sin embargo, el compuesto 4 no fue bien tolerado para modificaciones estructurales en C1/C2. Después de reubicar la posición del ácido carboxílico (C4 a N), encontramos el mejor aglutinante STING 11 y determinamos que el grupo ácido carboxílico era esencial para la actividad. A continuación, analizamos todos los compuestos para determinar su actividad a nivel celular utilizando tres líneas celulares informadoras, y ninguno de los compuestos objetivo estaba activo. Luego establecimos un método de detección de inhibidores de STING y volvimos a analizar todos los análogos nuevos. Los agentes de unión STING 11 y 27 exhibieron actividades inhibidoras micromolares, con datos comparables al ensayo de unión competitiva. El inhibidor covalente H151 mostró una actividad inhibidora de STING ligeramente mejor que 11 y 27 in vitro. Además, validamos además que 11 y 27 pueden inhibir eficazmente la activación de las vías duales STING inducida por 20,30 -cGAMP. Lo más impresionante es que 11 y 27 mantienen un alto nivel de viabilidad celular en altas concentraciones, lo que no es posible con H151. La citotoxicidad es un problema común con los inhibidores covalentes y limita la aplicación de H151.
Mediante el análisis de acoplamiento, hemos adquirido información sobre la base estructural de la actividad del mejor compuesto activo 11. El compuesto 11 ocupa perfectamente el bolsillo inferior, manteniendo hSTING en una conformación abierta inactiva y, por lo tanto, inhibiendo competitivamente la unión de 20,30 -cGAMP. La estructura del anillo tricíclico de la acridina es clave para generar interacciones hidrófobas, con el grupo ácido carboxílico y el resto cetona anclando el compuesto en el fondo del bolsillo. Especulamos que la metoxi produce asociaciones íntimas con el S162, cerrando marginalmente la conformación de la proteína, pero no lo suficiente como para convertirla en una conformación agonista. La estructura bis-metilo crea un bloqueo espacial del sitio que mejora las interacciones ligando-ligando y resta valor a la entrada del agonista en el bolsillo superior. Actualmente, no se han informado estructuras cocristalinas de mSTING y antagonistas de STING, por lo que no podemos explicar el mecanismo de acción del compuesto 11 con mSTING mediante un enfoque de acoplamiento. Sin embargo, conjeturamos que existen dos posibilidades: una es que el principio de actuación sea idéntico al de hSTING; la otra es que el compuesto 11 mantiene a mSTING en una conformación apo más agregada y 20,30 -cGAMP no puede entrar en el bolsillo para ejercer el efecto agonístico. En resumen, nuestras sutiles optimizaciones estructurales de los agonistas de STING más débiles han revertido con éxito la función biológica para descubrir inhibidores de STING. Estos hallazgos ilustran la complejidad de las bolsas de unión de STING y proporcionan nuevos conocimientos de investigación para el desarrollo de fármacos agonistas o inhibidores de STING.
4. Materiales y métodos
4.1. Química
Los disolventes y reactivos utilizados en la síntesis se obtuvieron de Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Beijing, China). Las estructuras de los productos se identificaron mediante espectroscopia de RMN 1H y 13C (JNM-ECA-400, Japón). Los pesos moleculares de los productos se midieron mediante espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) con ionización por electropulverización (ESI) como modo de ionización (Agilent 1260-G6230A, Alemania). La RMN y los espectros de masas de los compuestos se proporcionan en los materiales complementarios. Nosotros sintetizamos e identificamos los compuestos 35 a 38; consulte el artículo publicado anteriormente para obtener más detalles [23].
{{0}}(2-metoxi-3,4-dimetil-9-oxoacridina-10(9H)-il)acetato de etilo (1{ {25}}): A una solución de 4-metoxi{{10}},3-dimetilanilina (6) (0.97 g, 6,4 mmol) y Ácido 2-bromobenzoico (7) (1,29 g, 6,4 mmol) en DMF (6 ml) a temperatura ambiente, posteriormente añadimos Cu en polvo (0.05 g), Cu2O ({{60}}.05 g) y K2CO3 ({{186}}.71 g, 5,1 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 110 ◦C durante 12 h. Tras la eliminación de los disolventes al vacío, el residuo se disolvió en una solución de NaOH 1 N (25 ml). El producto bruto se obtuvo por precipitación tras acidificación del filtrado con concentrado. HCl. Después del secado, el producto bruto se añadió al reactivo de Eaton (5 ml) a temperatura ambiente y luego la mezcla se calentó a 90 ◦C durante 1 h. La mezcla de reacción enfriada se vertió gota a gota en una solución acuosa saturada de NaHCO3. El precipitado se filtró para recoger el producto bruto. La purificación del residuo mediante cromatografía en columna de gel de sílice proporcionó 9, un sólido amarillo pálido (0,61 g, rendimiento del 37,7%). Una solución de NaH (1,43 mmol) y 9 (0,33 g, 1,3 mmol) en DMF (5 ml) a temperatura ambiente se agitó durante 1 h y luego se enfrió a 5–7 ◦C. Se añadió bromoacetato de etilo (0,43 g, 2,6 mmol) a la mezcla resultante y se agitó continuamente a temperatura ambiente durante 20 h. Después de completarse la reacción (TLC), la mezcla de reacción se vertió en agua con hielo (15 ml). Los precipitados resultantes se filtraron, se secaron y luego se extrajeron con cloroformo. La evaporación del disolvente dio un éster bruto que se purificó mediante recristalización para proporcionar 10, un sólido amarillo (0,33 g, rendimiento del 76%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-D6) δ 8,30 (d, J=8.4 Hz, 1H), 8,08 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7,75–7,67 (m , 1H), 7,57–7,50 (m, 1H), 7,48 (s, 1H), 5,02 (s, 2H), 4,22 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3,96 (s, 3H) , 2,77 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 1,21 (t, J=7.1 Hz, 3H). RMN 13C (101 MHz, DMSO-D6) δ (ppm): 169,25, 157,87, 155,96, 147,46, 146,72, 135,46, 132,15, 130,17, 129,51, 125,88, 122,48, 119,80, 11 9,46, 95,26, 72,06, 61,28, 56,06, 14,59 , 14,34, 13,77. HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculado para C20H21NO4: 339,3910 encontrado: 340,1546. Ácido 2-(2-metoxi-3,4-dimetil-9-oxoacridin-10(9H)-il)acético (11): una solución de 10 (0,37 g, 1,1 mmol) y NaOH (0,05 g, 1,3 mmol) en etanol (20 ml) y agua (2 ml) se calentaron a 60 ◦C durante 1 h. Tras la eliminación de los disolventes, el residuo resultante se disolvió en agua y se filtró. Después de la neutralización del filtrado con conc. HCl, la mezcla se filtró para obtener el sólido bruto, posteriormente se recristalizó en metanol para dar 11, un polvo amarillo pálido (0,29 g, rendimiento del 85,7%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-D6) δ 10,51 (s, 1H), 8,33 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8,04 (d, J=8.5 Hz, 1H ), 7,69 (s, 1H), 7,67–7,62 (m, 1H), 7,45 (t, J=6.8 Hz, 1H), 4,52 (s, 2H), 3,90 (s, 3H), 2,75 (s, 3H), 2,31 (s, 3H). RMN 13C (101 MHz, DMSO-D6) δ (ppm): 159,04, 155,63, 147,47, 146,64, 134,86, 131,52, 129,56, 128,98, 125,15, 122,85, 120,53, 119,69, 10 1,77, 96,02, 74,81, 55,69, 14,42, 13,33 . HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculado para C18H17NO4: 311,3370 encontrado: 312,1229.
{{0}}cloro-8-metoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]acridina{ {9}},6(2H)-diona (25): A una solución de 6-carboxi-4-metoxi-2,3-dimetilbencenaminio (14) (1,3 g, 6,4 mmol) y ácido 2-(2-bromo-4-clorofenil)acético (15) (1,6 g, 6,4 mmol) en DMF (6 ml) a temperatura ambiente, posteriormente añadimos Cu en polvo. (0.05 g), Cu2O (0.05 g) y K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 110 ◦C durante 12 h. Tras la eliminación de los disolventes al vacío, el residuo se disolvió en una solución de NaOH 1 N (25 ml). El producto bruto se obtuvo por precipitación tras acidificación del filtrado con concentrado. HCl. Después del secado, el producto bruto se añadió al reactivo de Eaton (5 ml) a temperatura ambiente y luego la mezcla se calentó a 90 ◦C durante 1 h. La mezcla de reacción enfriada se vertió gota a gota en una solución acuosa saturada de NaHCO3. El precipitado se filtró para recoger el producto bruto. La purificación del residuo mediante cromatografía en columna de gel de sílice proporcionó 25, un sólido amarillo (0,80 g, rendimiento del 38,6%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-D6) δ 8,17 (d, J =8.1, 1,5 Hz, 1H), 7.86 (d, J=6.9 Hz, 1H), 7,51 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,78 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculado para C18H14ClNO3: 327,7640 encontrado: 328,0734. 4-cloro-8-metoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]acridina-1 ,6(2H)-diona (26): La síntesis de este compuesto fue similar a 25. 15 se reemplazó con ácido 2-(2-bromo-5-clorofenil)acético (16). Obtuvimos 0,82 g de 26 en forma de un sólido de color amarillo pálido con un rendimiento del 38,7%. RMN 1H (400 MHz, DMSO-D6) δ 7,73 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,64 (s,2H), 2,36 (s, 3H), 2,13 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculado para C18H14ClNO3: 327,7640 encontrado: 328,0734.
{{0}}fluoro-8-metoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]acridina{ {9}},6(2H)-diona (27): la síntesis de este compuesto fue similar a 25. 15 se reemplazó con ácido 2-(2-bromo-4-fluorofenil)acético (17). Obtuvimos un sólido 27 de color amarillo intenso con 0.84 g (rendimiento del 42,1%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-D6) δ 8,21 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,23 (d, J {{39} }.5 Hz, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,81 (s, 2H), 2,53 (s, 3H), 2,30 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculado para C18H14FNO3: 311,3124 encontrado: 312,1030. 4-fluoro-8-metoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]acridina-1 ,6(2H)-diona (28): La síntesis de este compuesto fue similar a 25. 15 se reemplazó con ácido 2-(2-bromo-5-fluorofenil)acético (18). Se obtuvieron 0,81 g de un sólido de color amarillo intenso (rendimiento del 40,5%). RMN 1H (400 MHz, DMSOD6) δ 7.86 (s, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,77 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,26 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculado para C18H14FNO3: 311,3124 encontrado: 312,1030.
4,8-dimetoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]acridina-1,6(2H )-diona (29): La síntesis de este compuesto fue similar a 25. 15 se reemplazó con ácido 2-(2-bromo-5-metoxifenil)acético (19). Se proporcionaron {{20}}.73 g de sólido amarillo con un rendimiento del 35,2%. RMN 1H (400 MHz, DMSO D6) δ 7,93 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,81 ( s, 3H), 3,67 (s, 2H), 2,44 (s, 3H), 2,28 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculado para C19H17NO4: 323,3480 encontrado: 324,1230. Ácido 7-metoxi-5,6-dimetil-9-oxo-9,10-dihidroacridina-4-carboxílico (33): en solución de 6-carboxi-4-metoxi-2,3-dimetilbencenaminio (14) (1,30 g, 6,4 mmol) y ácido 2-bromobenzoico (7) (1,29 g, 6,4 mmol) en DMF (6 ml) a temperatura ambiente, posteriormente añadimos Cu en polvo (0,05 g), Cu2O (0,05 g) y K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 110 ◦C durante 12 h. Tras la eliminación de los disolventes al vacío, el residuo se disolvió en una solución de NaOH 1 N (25 ml). El producto bruto se obtuvo por precipitación tras acidificación del filtrado con concentrado. HCl. Después del secado, el producto bruto se añadió al reactivo de Eaton (5 ml) a temperatura ambiente y luego la mezcla se calentó a 90 ◦C durante 1 h. La mezcla de reacción enfriada se vertió gota a gota en una solución acuosa saturada de NaHCO3. El precipitado se filtró para recoger el producto bruto. La purificación del residuo mediante cromatografía en columna de gel de sílice proporcionó 33, un sólido de color amarillo pálido (1,{106}} g, rendimiento del 52,7%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-D6) δ 13,00 (s, 1H), 10,28 (s, 1H), 8,01 (d, J=9.7 Hz, 1H), 7,69 (d , J=8.5 Hz, 1H), 7,48 (t, J=9.0 Hz, 1H), 7,34 (s, 1H), 3,67 (s, 3H), 2,32 (s, 3H ), 2,10 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculado para C17H15NO4: 297,3100 encontrado: 298,1073. Ácido 2,7-dimetoxi-5,6-dimetil-9-oxo-9,10-dihidroacridina-4-carboxílico (34): El La síntesis de este compuesto fue similar a la del 33. El 7 se reemplazó con ácido 2-bromo-5-metoxibenzoico (30). El sólido amarillo dio 1,05 g con un rendimiento del 50,2%. RMN 1H (400 MHz, DMSO-D6) δ 12,96 (s, 1H), 10,45 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,50 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,81 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ calculado para C18H17NO5: 327,3360 encontrado: 328,1179.
4.2. Ensayo biológico
Los kits de unión STING de ratón, los kits de unión STING WT humano, los kits de unión AQ STING humano y los kits de unión STING H232 humano se adquirieron de Cisbio. Se adquirieron células 293T mSTING (ISG/KI-IFNb), células 293T hSTING-R232 (ISG/KI-IFNb), células THP1-KI-hSTING-R232 y células THP1-KO-STING de Invivógeno. Se cultivaron células 293T mSTING y 293T hSTING-R232 utilizando DMEM (Gibco, Waltham, MA, EE. UU.), L-glutamina 2 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), glucosa 4,5 g/l (Sigma- Aldrich), FBS al 10 % (Gibco), Pen-Strep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), normocina 100 µM (Invivogen, San Diego, CA, EE. UU.) y suplementado con antibióticos selectivos (Invivogen ) blasticidina (10 µM), higromicina (100 µM) y zeocina (100 µM). Se cultivaron células THP1-KO-STING y células THP1-KI-hSTING-R232 utilizando RPMI-1640 (Gibco), L-glutamina 2 mM (Sigma-Aldrich), HEPES 25 mM. (Sigma-Aldrich), FBS inactivado por calor al 10% (Gibco), PenStrep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), normocina 100 µM (Invivogen) y suplementado con antibióticos selectivos (Invivogen) blasticidina ( 10 µM) y zeocina (100 µM). La solución QUANTI-Blue, QUANTI-Luc, 20,30 -cGAMP se adquirieron de Invivogen. H151 se obtuvo de Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Beijing, China). El kit de ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo se obtuvo de Promega.
4.2.1. Ensayo competitivo de unión HTRF STING
De acuerdo con las instrucciones de los kits de unión STING, se agregaron sucesivamente las siguientes soluciones a cada pocillo de la 384-placa de pocillos: 5 µL de los compuestos de detección o 2 0,30 -cGAMP (control positivo ) con diferentes concentraciones o diluyente (control negativo); 5 µl de proteína etiquetada con STING 6His humana (el pocillo de control negativo se añadió al tampón de detección); 10 µL de ligando STING d2 y solución de trabajo premezclada Anti 6His-Tb3+. Después de sellar la placa e incubar a temperatura ambiente durante 3 h, se leyeron los valores de fluorescencia a 665 nm y 620 nm. La relación de las dos intensidades de fluorescencia (665 nm/620 nm) se utilizó para estimar la potencia de unión de los compuestos. Los valores de IC50 (concentración inhibidora del 50%) se calcularon utilizando el software GraphPad Prism.
4.2.2. Ensayo celular para la detección de compuestos para la actividad agonística
Se distribuyeron cantidades de 180 µl de células 293T mSTING, células 293T hSTING-R232 y suspensión de células THP1-KOSTING en 96-placas de fondo plano con una densidad de ~50,000 células. /pocillo (293T) o ~100,000 células/pocillo (THP1). Se añadió una cantidad de 20 µl de solución salina o de una solución salina de un compuesto de prueba, o 20,{16}}cGAMP como referencia positiva, y las células se incubaron a 37 ◦C con 5 % de CO2 durante 48 h. Posteriormente, se añadió una cantidad de 20 µL de sobrenadante a una placa de fondo plano 96-pocillo, seguido de 180 µL de solución QUANTI-Blue a cada pocillo. La placa se incubó a 37 ◦C durante 3 h y los niveles de SEAP (la actividad de la vía IRF) se determinaron utilizando un espectrofotómetro a 620–655 nm.
4.2.3. Ensayo celular para la detección de compuestos en busca de actividad inhibidora
Preexperimento: Se estimularon 180 µL de células 293T mSTING, células 293T hSTING-R232 (~50,000 células/pocillo) durante 48 h a 37 ◦C en un Incubadora de CO2 al 5 % con 10 µL 20,30 -cGAMP (3,125 µM, 6,25 µM) y 10 µL H151 (1,0 µM ). Posteriormente, se añadió una cantidad de 20 µL de sobrenadante a una placa de fondo plano 96-pocillo, seguido de 180 µL de solución QUANTI-Blue a cada pocillo. La placa se incubó a 37 ◦C durante 3 h y los niveles de SEAP (la actividad de la vía IRF) se determinaron utilizando un espectrofotómetro a 620–655 nm. Se distribuyeron 180 µl de suspensión de células 293T mSTING y células 293T hSTING-R232 en 96-pocillos de placas de fondo plano con una densidad de ~50,000 células/pocillo. Una cantidad de 10 µL de 2 0,30 -cGAMP (3,125 µM) y el compuesto 11 o el compuesto 27 (0,78 µM, 1,56 µM, 3,13 µM, 6,25 µM, 12,5 µM, 25 µM, 50 µM, 100 µM) o H151 (0,08 µM, 0,16 µM, 0,31 µM, 0,63 µM, 1,25 µM, 2,5 µM, 5 µM) y las células se incubaron a 37 ◦C con 5% de CO2 durante 48 h. Posteriormente, se añadió una cantidad de 20 µl de sobrenadante a una placa de fondo plano 96-pocillo, seguido de 180 µl de solución QUANTI-Blue a cada pocillo. La placa se incubó a 37 ◦C durante 3 h y los niveles de SEAP (la actividad de la vía IRF) se determinaron utilizando un espectrofotómetro a 620–655 nm. Los valores de IC50 se calcularon mediante el software GraphPad.
4.2.4. Ensayo celular para la inhibición de las vías duales de STING
Se distribuyeron 180 µl de suspensión de células THP1-KI-hSTING-R232 en 96-placas de fondo plano con una densidad de ~100,000 células/pocillo. Se añadió una cantidad de 10 µL de 20,30 -cGAMP y 10 µL del compuesto 11 (20 µM) o del compuesto 27 (33 µM) o H151 (2 µM) y las células se incubaron a 37 ◦C con 5% de CO2 durante 24 h. Posteriormente, se añadió una cantidad de sobrenadante a una placa 96-pocillo blanca (opaca), seguido de solución QUANTI-Luc o QUANTI-Blue a cada pocillo, y se leyeron los niveles de luminiscencia o niveles de SEAP según las instrucciones del fabricante. Esto permite el estudio simultáneo de la vía del factor regulador IFN (IRF), mediante la evaluación de la actividad de Lucia luciferasa y la vía NF-κB, mediante el seguimiento de la actividad de SEAP.
4.2.5. Ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo
La viabilidad celular se midió mediante el kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se incubaron con tres concentraciones diferentes (5 µM, 10 µM, 100 µM) del compuesto 11, compuesto 27 o H-151 durante 48 h. Se agregaron 100 µl de reactivo CellTiter-Glo en una placa de ensayo 96-pocillo durante 10 minutos y luego se registró la luminiscencia.
4.3. Acoplamiento molecular del compuesto 11
La estructura cristalina del complejo STING (PDB ID: 6MXE) se tomó de una entrada del banco de datos de proteínas y se utilizó como punto de partida. La proteína se preparó usando la preparación de proteínas de Maestro y se dividió en la cadena A y la cadena B. Generamos un sitio de unión en el LBD del monómero STING basado en el ligando original (Merck-18) usando Receptor Grid Generation. Usamos la precisión SP de Glide-docking para la parte de acoplamiento molecular, permitiendo que el compuesto 11 genere como máximo 20 poses. Finalmente produjimos 16 conformaciones unidas (todas en el bolsillo inferior) y probamos la energía libre de unión de los complejos utilizando el módulo Prime MM-GBSA en el software de Schrödinger. Además, según la puntuación de acoplamiento, la puntuación del modelo de planeo y la puntuación de MMGBSA dG Bind, seleccionamos la conformación óptima que obtuvo la primera puntuación en dos y la tercera en uno (como se ve en la Tabla S2). Finalmente, fusionamos las mejores conformaciones de las cadenas A y B para obtener la estructura de acoplamiento completa.
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