Los conjugados de anticuerpos inmunoestimulantes provocan una activación mieloide robusta y una inmunidad antitumoral duradera (Parte 2)

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Discusión:

Los resultados presentados aquí brindan evidencia convincente que respalda a los ISAC como una tecnología novedosa para la inmunoterapia tumoral. El modelado in vitro de ISAC demostró su capacidad para activar APC mieloides humanas primarias de una manera dependiente de Fc R y TLR y para mejorar la presentación cruzada de antígenos utilizando el sistema de modelo OVA murino. La activación a través de la regulación ascendente de la molécula coestimuladora CD40 no solo se observó in vitro, sino que también se observó en APC mieloides residentes en tumores tanto en modelos de xenoinjerto como de tumor singénico. Uno de los hallazgos sorprendentes de este estudio fue que la unión covalente de un agonista de TLR a un El anticuerpo monoclonal dirigido al tumor en forma de ISAC alteró el resultado inmunoestimulador y la eficacia general que normalmente se anticipa con los agonistas de TLR. Una comparación de la administración local de trastuzumab combinado con T785 con la administración sistémica de T785-ISAC demostró que solo ISAC logró reducir la carga tumoral. La administración local de la mezcla no proporcionó ningún beneficio en el modelo de xenoinjerto tumoral HCC1954, con efectos comparables a trastuzumab solo. Este hallazgo respalda que no solo la administración local sino también la administración simultánea del anticuerpo y el agonista de TLR es esencial para la eficacia terapéutica observada con ISAC. Los datos mecanísticos generados en el modelo de xenoinjerto tumoral HCC1954 demostraron el requisito in vivo para el compromiso de Fc R y el compromiso de TLR para la eficacia, ya que tanto el ISAC TLRnull-ISAC como el ISAC inactivo para Fc no lograron controlar el crecimiento tumoral. Además, la administración sistémica de ISAC dio como resultado una eficacia antitumoral sostenida en modelos de tumor singénico HER2 plus de rata y xenoinjertos de cáncer de mama HER2 plus humano que eran resistentes al tratamiento con el anticuerpo no conjugado. Se seleccionó HER2 como el antígeno diana para los estudios preclínicos in vivo porque la terapia neoadyuvante, adyuvante y de primera línea para pacientes con cáncer de mama metastásico o localmente avanzado está dominada por anticuerpos dirigidos contra HER2- que no están diseñados para estimular el sistema inmunitario. El sistema y los anticuerpos bloqueadores del inhibidor del punto de control de células T aprobados han sido mínimamente efectivos en estos pacientes. Estos pacientes podrían beneficiarse de los ISAC que conservan la funcionalidad de los anticuerpos originales y agregan un potencial inmunoestimulador significativo. Como con cualquier inmunoterapéutico, existe la posibilidad de generar o exacerbar anticuerpos antidrogas y, en el caso del ISAC, puede depender en última instancia de la inmunogenicidad del anticuerpo original. Estas evaluaciones se realizan mejor clínicamente y trastuzumab puede ser ideal para la investigación ya que la tasa de inmunogenicidad informada de Herceptin™ en pacientes es inferior al 1 por ciento. Los datos in vivo que demuestran el requisito de la administración simultánea del anticuerpo y el adyuvante están respaldados por el trabajo que detalla la señalización intracelular que rige la actividad de ISAC a través de la señalización simultánea de Fc R y TLR. Si bien estudios adicionales pueden dilucidar aún más la dinámica de señalización de ISAC intracelular, los estudios descritos aquí destacan las posibles ventajas de señalización de conjugar un agonista de TLR con un anticuerpo, como se observa típicamente cuando los anticuerpos se involucran con patógenos durante la inmunidad protectora. Análisis basado en CyTOF de señalización intracelular en Se emplearon PBMC humanas para seguircomprender y diferenciar la actividad de la mezcla e ISAC. Los resultados revelaron una firma amplificada después de la estimulación con ISAC en comparación con la provocada por la mezcla de componentes individuales, lo que respalda aún más el potencial de mejora de la actividad a través de la conjugación química del anticuerpo y el agonista de TLR. Si bien la potencia específica de TLR7 y TLR8-de los ISAC no se puede medir con células reporteras HEK293, la demostraciónde la fosforilación inducida por ISAC de IRF-7 sugiere un agonismo TLR7/8 activo, ya que se sabe que IRF-7 está aguas abajo de TLR7 y TLR8 MyD88-señalización impulsada 30. Los datos indican que el ISAC no solo provoca una mayor señalización de las vías canónicas asociadas con las vías TLR y Fc R, sino que también reduce el umbral de activación por pares necesario para desencadenar la fosforilación de las proteínas de señalización posteriores, como la proteína ribosómica S6, un regulador clave de la traducción de proteínas en la célula. Altos puntajes DREMI, particularmente medidostanto en monocitos como en DCs, apoyan la fuerte dependencia condicional inducida por la estimulación con el ISAC que no se observa con la mezcla. Este fenómeno puedeser facilitado por cambios intracelulares en abundancia, localización y/o reclutamiento de receptores dentro del endosoma, pero se requiere más investigación para confirmar un mecanismo exacto. Es importante destacar que el análisis DREMI identificó relaciones consistentes con socios de señalización conocidos como resultado de la estimulación ISAC. Por su conocido inhibidorpapel en la señalización canónica de NF-κB 49, observamos una dependencia reducida (es decir, puntuación DREMI)entre pIRF7 e inhibidor de kappa B (IκB) cuando las células mieloides se estimularon con ISAC. En conjunto, estos resultados respaldan una respuesta intracelular amplificada y sostenida a través de moléculas relevantes de la vía de transducción de señales aguas abajo de la estimulación ISAC, además de la sinergia entre las vías de señalización relacionadas con TLR y Fc R.

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Nuestros resultados revelaron que las interacciones Fc-Fc R funcionales son esenciales para la activación de las APC mieloides mediada por ISAC. La IgG1 Fc nativa, que tiene la mayor afinidad por los Fc R activadores de los isotipos de IgG existentes de forma natural, fue superior a otros isotipos de IgG con afinidades más bajas por los Fc R activadores. La mejora adicional de la interacción Fc-FcR a través de la potencia mejorada de fucosilación, mientras que la disminución de la interacción Fc-FcR a través de la potencia reducida de glicosilación. Como era de esperar, se requería la señalización de Syk aguas abajo del compromiso de Fc R además del agonismo de TLR posterior para que los ISAC provocaran la estimulación máxima. Estos hallazgos están respaldados por estudios que demuestran una mejora drástica de la estimulación mieloide después de la coestimulación con IgG unida a la placa y el agonista de TLR PAM3CSK 50. También sugieren una reticulación más extensa de Fc, en la superficie de la célula diana o dentro de la placa in vitro. , puede ocurrir, o se activan redes de señalización diferencial, siguiendo la estimulación ISAC en lugar de la mezcla de componentes. La traducción de la plataforma ISAC in vivo se evaluó primero con líneas de células tumorales HER2 plus humanas en ratones que carecen de células B, T y NK completamente funcionales. Sorprendentemente, el ISAC de trastuzumab fue significativamente más efectivo que trastuzumab en múltiples tumores con niveles variables de expresión de HER2. Además, los datos demostraron la dependencia de la orientación al tumor para los efectos antitumorales del ISAC, ya que el isotipo-ISAC no pudo inducir la regresión y la eliminación del tumor. Si bien el modelado in vitro demostró la necesidad de que la actividad de TLR y Fc R permitiera la potencia de ISAC, dichos modelos no lograron medir la dependencia de la orientación del antígeno de ISAC. No se midieron diferencias entre los ISAC T785-dirigidos y de isotipo en ensayos basados ​​en placas con APC mieloides humanas sanas cocultivadascon células tumorales (datos no mostrados).La falta de dependencia del objetivo medida in vitro se puede atribuir a múltiples factores: se encontró que las APC mieloides regulan al alza los Fc R en la superficie celular después del cultivo in vitro, lo que puede mejorar la capacidad de la IgG soluble para unirse a Fc R, lo que lleva a una señal amplificada del isotipo ISAC.Además, los cultosEl sistema carece de IgG endógena y factores séricos adicionales presentes in vivo que pueden competir por Fc R in vivo y amortiguar los efectos observados con un isotipo ISAC.No obstante, los modelos in vivo demostraron la confianza de ISAC en la orientación al tumor para la eficacia antitumoral.Los isotipos ISAC no solo mostraron poco impacto en el crecimiento tumoral en los estudios de eficacia, sino que también se descubrió que no inducían ningún impacto en el nivel genético de los tumores, como se muestra en modelos de xenoinjertos y tumores singénicos.Además de demostrar la eficacia dependiente del objetivo in vivo, los animales toleraron el T785-ISAC e indujo una pérdida de peso mínima, demostrando pocos signos de efectos no deseados y eventos adversos en el ratón.Estos datos respaldan aún más la capacidad de un ISAC dirigido al tumor administrado sistémicamente para viajar al tumor e inducir una respuesta antitumoral proinflamatoria localizada.

La importancia de las funciones efectoras mediadas por células mieloides se demostró en estudios de depleción de células, en los que la depleción de fagocitos por clodronato eliminó la capacidad de ISAC para inducir la eliminación del tumor.Curiosamente, aunque los tumores retrocedieron inicialmente después del agotamiento de las células positivas para Gr1, los tumores crecieron posteriormente.Este fenómeno puede haber ocurrido como resultado del agotamiento de los precursores de los fagocitos, como los monocitos, que luego pueden haberse diferenciado en células fagocíticas funcionales y maduras 51.Se obtuvieron más conocimientos moleculares y celulares al cuantificar los niveles de ARNm y los cambios posteriores al tratamiento con ISAC.Estos datos fueron corroborados por inmunohistoquímica y cuantificación de proteínas, lo que indica una infiltración de células mieloides en el tumor a lo largo decon la producción de una citocina proinflamatoria TNF y quimioatrayentes mieloides CCL2 (MCP-1) y CCL4 (Mip1b).

Figura 2: ISACS provoca distintos patrones de señalización en APC mieloides. (ad) Se estimularon PBMC humanas recién aisladas con 1 μM de rituximab-ISAC o un equivalente equimolar de la mezcla en presencia de CD20 más células tumorales de Toledo a una proporción de 1:1. relación durante 15 minutos. (a) La mediana de la relación arcsinh de ISAC sobre la señalización se midió después de la estimulación de la mezcla para varias fosfoproteínas como se muestra en un mapa de calor, con el amarillo indicativo de una mayor señalización y el azul indicativo de una señal reducida. ( b ) Gráficos representativos de citometría de flujo para pIRF7 y pRPS6 en monocitos y CDC. ( c ) El cambio de pliegue de la señalización inducida se calculó como la relación arcsinh sobre el control no estimulado. La fosforilación de IRF7 y ERK1/2 se midió en monocitos y CDc después de la estimulación con ISAC o mezcla. Los datos son de un experimento con seis donantes (media y SEM); *PAGS<0.05,><0.01,><0.001,><0.0001. (d)="" representative="" drevi="" plots="" following="" dremi="" analysis="" with="" the="" area="" under="" the="" curve="" (auc)="" and="" inflection="" point="" (ip)="" denoted.="" drevi="" plots="" were="" visually="" inspected="" for="" curve="" fit="" and="" signal-to-noise,="" and="" inflection="" points="" were="" calculated="" for="" those="" with="" proper="" sigmoidal="" curve="" fits="" (n/a="" indicates="" no="" curve="">

Los receptores para CCL2 y CCL4, CCR2 y CCR5 se expresan en monocitos y macrófagos, respectivamente, lo que sugiere que estos tipos de células podrían reclutarse para tumores tratados con ISAC.Además, el ARNm de Cxcl9 y Cxcl11, que codifican quimiocinas específicas de células T y se expresan mediante DC en el TME, también se regulaba al alza con el tratamiento con trastuzumab ISAC (Figura 23 complementaria) 52,53.Un ISAC de trastuzumab con mayor potencia, usando el agonista CL264, exhibió una mayor eficacia en modelos tumorales que expresan menos HER2.Esto es importante dado que los pacientes cuyos tumores expresan HER2 bajo tienen opciones de tratamiento más limitadas y no son elegibles para trastuzumab u otras terapias que contienen trastuzumab.Se observó una pérdida de peso transitoria de alrededor del 5-10 por ciento y un aumento de la secreción sistémica de TNF en animales tratados con los isotipos CL264-ISAC dirigidos y de isotipo, lo que indica posibles efectos fuera del objetivo además del sólido anti- actividad tumoral observada.Los datos colectivos presentados en los modelos de xenoinjerto sugieren que la fagocitosis mediada por ISAC es un mecanismo eficaz para eliminar tumores, pero este mecanismo podría mejorarse después de la presentación de antígenos de neoantígenos tumorales a las células T en huéspedes inmunocompetentes.Con este fin, se investigó la capacidad de los ISAC para promover la inmunidad antitumoral en ratones de tipo salvaje con ISAC anti-rHER2 en dos estudios diferentes.rHER2-expresando modelos singénicos (MMC y CT26-rHER2). Tanto los ISAC que contenían T785 como CL264 se evaluaron en el modelo MMC singénico dada la alta expresión de antígeno de rHER2, ya que se postuló que los ISAC de menor y mayor potencia eran eficaces con una alta densidad de antígeno en la célula tumoral. Ambos ISAC rHER2 condujeron a la eliminación completa del tumor en animales con tumores grandes (350-950 mm3) en el modelo MMC, mientras que el anticuerpo no conjugado no logró controlar el crecimiento tumoral. El análisis de los niveles de transcripción de ARNm en el modelo MMC reveló un cambio dramático en la regulación demuchos genes a las 24 horas después del tratamiento con el rHER2 T785-ISAC dirigido en relación con el anticuerpo rHER2 o el isotipo ISAC, incluso dentro de los genes involucrados en la biología de células mieloides, la biología de TLR y las respuestas inmunitarias adaptativas. Mediante inmunohistoquímica se observaron infiltrados aumentados de células que expresan CD11c y F4/80-, similar a la tendencia observada en el modelo de tumor de xenoinjerto HCC1954. Además, se observó infiltración de células T CD8 porinmunohistoquímica, apoyando la generación de una respuesta inmune adaptativa después del tratamiento con ISAC.

Además de la importancia demostrada de los fagocitos en el modelo de xenoinjerto, los estudios de agotamiento en el modelo de tumor singénico MMC revelaron una fuerte dependencia de los fagocitos, ya que el agotamiento con liposomas cargados con clodronato detuvo los efectos antitumorales mediados por ISAC. Además, los estudios singénicos demostraron un papel crítico para las células T en la eficacia de ISAC. La eliminación del tumor impulsada por ISAC dependía en gran medida de la actividad de las células T CD8, ya que el agotamiento de las células T CD8 inhibía la eficacia antitumoral. Los datos sugieren que la actividad de las células T es impulsada a través de la activación mediada por TLR de células mieloides estimuladas por ISAC. Tal requerimiento de células T, presumiblemente relacionado con la presentación de antígenos asociados a tumores por parte de células mieloides estimuladas por ISAC, respalda que los ISAC probablemente medien su actividad antitumoral a través de al menos dos mecanismos: fagocitosis y presentación de antígenos. Mientras que los fagocitos brindan una respuesta antitumoral temprana después del tratamiento con ISAC, la preparación antigénica de las células T finalmente proporciona la eliminación del tumor y los efectos duraderos medidos en modelos totalmente inmunocompetentes. Esta combinación sería muy deseable para los pacientes con cáncer, ya que el tratamiento con ISAC podría conducir a una inmunidad antitumoral sólida y duradera. 264-El tratamiento con ISAC se volvió a desafiar, después de 30 días de estar libre de tumores, con la línea celular parental CT26 que no expresa rHER2. Los animales curados con rHER2-CT26 estaban protegidos de la exposición a CT26, mientras que los animales sin tratamiento previo con tumor no pudieron rechazar el crecimiento tumoral. Además, para demostrar que la protección era específica para la línea de células tumorales CT26, se implantó simultáneamente 4T1 en el flanco contralateral de ratones expuestos a CT26 parentales. Aunque los tumores CT26 no crecieron en ratones curados con her-CT26, el crecimiento del tumor 4T1 no se vio obstaculizado y, por lo tanto, proporciona evidencia de que la inmunidad es específica de antígeno y depende de la respuesta inmune adaptativa. Además, estos estudios sugieren que los ISAC dirigidos a tumores median la memoria inmunológica no solo para el antígeno tumoral inicialmente dirigido sino también para antígenos no dirigidos. Estos datos también sugieren que las células mieloides pueden presentar antígenos asociados a tumores que impulsan respuestas CTL adicionales. Las implicaciones de estos hallazgos demuestran que, incluso si el antígeno tumoral objetivo se regula a la baja o no puede unirse al ISAC, la memoria inmunológica ya se ha invocado y es capaz de mantener una respuesta duradera. Esta respuesta no eslimitado al antígeno al que se dirige el ISAC, pero también a antígenos adicionales, no identificados, expresados ​​en el tumor.En conjunto, estos datos indican que los ISAC provocan una biología distinta cualitativa y cuantitativamente relacionada con la activación celular y la presentación de antígenos, la proliferación de células T y la inmunidad antitumoral duradera.

Methods and Materials: Antibody Conjugation & Characterization For conjugation of adjuvants to the antibody, adjuvants were first synthesized to include a linker flanked by a reactive group. Conjugates produced using two-step methods were first synthesized through the modification of mAb lysine residues with a heterobifunctional crosslinker SATA. Deprotection of the acetylated thiol exposed a reactive thiol which was then reacted at room temperature for 2-4 hours with an adjuvant-linker flanked by a thio-reactive maleimide. For constructs produced using a single-step conjugation method, TFP esters were then conjugated to an IgG1 antibody. The TFP esters were dissolved in anhydrous DMSO to make a 20 mM stock solution and 5-10 molar equivalents (relative to the antibody) were added to the IgG antibody at 10 mg/mL in PBS. The conjugation reaction was performed at 4-40°C for 2-12 hours. The resulting immunoconjugates were buffer exchanged into PBS (pH 7.4) through desalting (Zeba Columns, Thermo Fisher Scientific) or dialysis to remove excess small molecular weight impurities. The final protein concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm on a Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). The yields were >75 por ciento basado en proteína recuperada. El análisis SEC detectó una presencia mínima de agregados y el DAR se determinó mediante análisis LC/MS. Los ISAC purificados se filtraron a través de un filtro estéril 0, 2 μm y se almacenaron a -20 grados hasta su uso. Ensayo HEK Reporter Las células reporter HEK293 que expresan TLR7 humano o TLR8 humano se compraron de Invivogen (hub-htlr7 o hub-htlr8) y se siguieron los protocolos de los proveedores para la propagación y experimentación celular. Brevemente, las células se cultivaron hasta un 80-85 por ciento de confluencia con un 5 por ciento de CO2 en DMEM complementado con un 10 por ciento de FBS, zeocina y blasticidina. A continuación, las células se sembraron en 96-placas planas de pocillos a razón de 4x104 células/pocillo con sustrato que contenía medio de detección HEK y moléculas inmunoestimuladoras. La actividad se midió utilizando un lector de placas a una longitud de onda de 620-655 nm. }), FCGR2A (CD32a, cat# 1257-FC-050), FCGR2B (CD32b, cat# 1875-FC-050), FCGR3A (CD16a, cat# {{34 }}FC-050). El análisis de unión se realizó en un instrumento Biacore T200 en HBS-EP más tampón (GE BR100669) usando un chip CM5 (GE BR100530) que contenía anticuerpo anti-HIS inmovilizado (kit de captura HIS, GE 28995056 Rituximab o Rituximab-ISAC se han inyectado sobre células de flujo que contienen FCGR capturados o un anticuerpo anti-His de superficie de referencia únicamente.superficie anti-His y una inyección sólo de tampón. Se utilizó un método de valoración cinética y las superficies se regeneraron entre ciclos mediante inyección de glicina 10 mM, pH 1,5. Los datos se ajustaron con el software de evaluación Biacore T200 (V3.1) con ajuste cinético (1:1) para FCGR1 y FCGR3A (promedio de 6 ejecuciones) y afinidad en estado estacionario (1:1) para FCGR2A y FCGR2B (promedio de 3 ejecuciones). ).

Human Myeloid APC Isolation Myeloid APCs, which predominantly consisted of monocytes (>95%), were isolated from the whole blood of healthy donors (Stanford Blood Center) by density gradient centrifugation using a RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail (Stem Cell Technologies). Myeloid APCs were further isolated using a negative selection Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 depletion (Stem Cell Technologies) to a final purity of >90 por ciento según lo determinado por citometría de flujo basada en la expresión de CD14, CD16, CD11c y HLA-DR. Las células se retiraron del cultivo, se lavaron y se resuspendieron en PBS con FBS al 2 % y EDTA 2 mM a 1-10x106 células/ml. En algunos casos, las células se marcaron posteriormente con CFSE 2 μM durante 2 minutos y luego se lavaron una vez con RPMI-1640 (Lonza) complementado con FBS al 10 % (Atlanta Biologicals) y 100 U/ml de Pen/Strep (Lonza). A continuación, las células se fijaron en paraformaldehído al 2 % y se lavaron tres veces con PBS antes de su uso posterior. Ensayos de activación celular Las PBMC o los monocitos aislados se colocaron en placas a 3x105 o 2x105 células por pocillo, respectivamente, en placas de 96-pocillos de fondo plano en IMDM complementado con FBS al 10 % (Atlanta Biologicals), piruvato de sodio 1 mM (Lonza), aminoácidos no esenciales 100 μM (Lonza) y Pen/Strep 100 U/mL (Lonza). Para los experimentos de cocultivo de monocitos y tumores, los monocitos se cultivaron con células tumorales alogénicas fijadas en una proporción de 3 a 1. Posteriormente, las células se incubaron con agentes inmunoestimuladores o controles durante 18-36 horas a 37 grados con 10 por ciento de CO2. La activación celular se midió a través de la expresión en la superficie celular de marcadores de activación y la producción de citoquinas. Los niveles de expresión de marcadores de superficie se midieron mediante citometría de flujo con anticuerpos contra CD40 (5C3, BD), CD86 (IT2.2, BD), HLA-DR (L243, BD) y CD16 (3G8, BD), CD14 (MΦP9, BD) y CD123 (7G3, BD). Las PBMC se analizaron por citometría de flujo con anticuerpos contra los marcadores de activación antes mencionados, así como los marcadores de linaje CD19 (HIB19, BD), CD56 (B159, BD), CD3 (SK7, BD), CD4 (OKT4, BioLegend), CD8 (SK1, BD) y CD69 (FN50, BD). En todos los casos, el sobrenadante del cultivo celular se recolectó después de 18 o 36- horas de incubación, y la producción de citocinas se midió utilizando kits de matriz de perlas de citocinas (kit de citocinas inflamatorias humanas, BD Biosciences) y ELISA (kit ELISA humano TNF, eBiosciences) Citometría de masas Se aislaron PBMC de sangre de donantes sanos y se estimularon con ISAC, una mezcla de anticuerpo y adyuvante, o sin estímulo durante 5-15 minutos a 37 grados. Después de la estimulación, las célulasse fijaron agregando 16 % de PFA (ciencias de microscopía electrónica) a una concentración final de 1,6 % y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA). Las células fijadas se lavaron con medio de tinción celular (CSM; PBS con 0,5 por ciento de BSA y 0,02 por ciento de azida de sodio (todas Sigma) y se codificaron con un método basado en paladio como se describió anteriormente 54. Las muestras con código de barras se combinaron en una muestra compuesta para tinción superficial.

La tinción de la superficie se realizó agregando anticuerpos (Tabla complementaria 2) en CSM e incubando durante 3{{10}} minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos antihumanos se compraron conjugados (Fluidigm) o conjugados con isótopos de metales pesados ​​utilizando el kit de etiquetado de anticuerpos MaxPar X8 (Fluidigm) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células teñidas en la superficie se lavaron una vez en CSM y se permeabilizaron con MeOH durante 10 minutos en hielo. Las células permeabilizadas se lavaron dos veces con CSM y se añadieron anticuerpos contra antígenos intracelulares durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron con CSM y finalmente se resuspendieron en solución de intercalación (1,6 por ciento de PFA en PBS, 0,02 por ciento de saponina (Sigma) y 0,5 μM de intercalador de iridio (Fluidigm)) durante la noche a 4 grados. Antes de la adquisición de datos, las muestras se lavaron una vez en CSM y dos veces en ddH2O. Todas las muestras se filtraron a través de un filtro de células (Falcon) y se resuspendieron a 1x106 células/mL en ddH2O complementada con perlas de calibración de cuatro elementos 1x EQ (Fluidigm) y los datos se adquirieron en un citómetro de masas CyTOF2 (Fluidigm). Las respuestas de señalización se evaluaron utilizando la implementación SPADE dentro de Citibank 29. Los análisis se realizaron en todas las celdas (sin reducción de muestreo), eligiendo el número indicado de grupos y utilizando todos los marcadores de superficie relevantes, pero no los marcadores intracelulares para la agrupación. Los linajes de células inmunes se anotaron en función de sus patrones de expresión de proteínas de superficie de alta dimensión. Los análisis estadísticos se realizaron en R, un entorno de software estadístico de código abierto. Dentro de cada subconjunto de células, grupo de tratamiento y donante, se calculó el cambio de veces promedio para los siguientes veinte marcadores de fosfoproteína: p-Src, p-STAT5, p-cMET, p-AKT, p-MAPKAPK2, p-SHP2, p -SLP76, p-IRF-7, p-ZAP70/SYK, p-CREB, p-NFKB, p-PI3K, IKB (total), p-PLCG1, p-ERK1/2, p-p38, p -BTK/ITK, p-S6, p-STAT3 y p-JNK/SAPK. El cambio de pliegue promedio se ponderó por el número total de celdas en cada grupo, como se define después del agrupamiento de SPADE. Se realizaron pruebas t pareadas para estimar la diferencia en el cambio de pliegue promedio y para probar la hipótesis nula de que no había diferencia en el cambio de pliegue promedio de cada marcador entre las condiciones de tratamiento y control.

Procedimiento experimental del modelo tumoral de xenoinjerto Se adquirieron líneas de células tumorales de ATCC (NCI-N87, HCC1954 y COLO205) o AddexBio (JIMT-1) y se cultivaron de acuerdo con las directrices del fabricante. Las células se recolectaron cuando alcanzaron un 80-90 por ciento de confluencia mediante separación con Accutase (Stemcell), se lavaron con PBS, se resuspendieron a 40 x 106 células/mL en PBS y se colocaron en hielo durante no más de dos horas. Inmediatamente antes de la implantación, las células suspendidas se mezclaron con un volumen igual de Cultrex PathClear BME, Tipo 3 (R&D Systems) y se implantaron 100 μL de la mezcla (2 x 106 células) por vía subcutánea en el flanco derecho de 6-8-semana -ratones hembra de edad de la siguiente manera: se implantaron células NCI-N87 y COLO205 en ratones NSG (Jackson Laboratory), se implantaron células HCC1954 y JIMT-1 en Rag2/IL2rg doble knockout (Taconic) y HCC1954 (para evaluación con T785-ISAC) se implantaron en NSG oRatones SCID/beige (Jackson Laboratory o Taconic y Envigo). El tamaño del tumor se registró dos veces por semana y se estimó utilizando la siguiente fórmula: (largo x ancho2)/2. Una vez que los tumores alcanzaron 50-100 mm3, generalmente dentro de una semana desde la implantación del tumor, se iniciaron los tratamientos. Los ratones se aleatorizaron por tamaño del tumor en grupos de tratamiento antes del tratamiento inicial. Trastuzumab (EirGenix; EG12014), Trastuzumab ISAC o Isotype ISAC se preparó en PBS a 1 mg/mL y se administró a 5 mg/kg por vía intraperitoneal cada cinco días (Q5D) para un total de seis dosis. Los ratones cuyos tumores superaron los 2000 mm3 se sacrificaron.

Procedimiento experimental de agotamiento celular de HCC1954 y MMC Para eliminar los macrófagos y otras células fagocíticas, se trataron ratones con tumores HCC1954 o MMC mediante inyección intraperitoneal dos días antes del tratamiento inicial con ISAC con liposomas de clodronato o liposomas de control que no contenían clodronato como control negativo (Encapsula, número de catálogo CLD-8901) y luego se trató dos veces por semana durante un total de tres semanas. Para reducir los neutrófilos, los ratones se trataron con anticuerpos de reducción 1A8 para reducir Ly6G más neutrófilos solamente (n.º de catálogo de BioXCell BE0075-1) o RB6-8C5 para reducir las células Gr1 más, que incluye Ly6G más neutrófilos y Ly6C más (N.º de catálogo de BioXCell BE0075) o controles de isotipo 2A3 y LTF-2 (N.º de catálogo de BioXCell BE0089 y BE0090, respectivamente) dos días antes del tratamiento inicial con ISAC, luego tratados dos veces por semana durante tres semanas. El agotamiento de las células en la sangre se confirmó mediante citometría de flujo (Figura 24 complementaria). Para el análisis de inmunohistoquímica y ARNm, los tumores se dividieron y el ARNm se analizó con el panel de perfilado inmunitario contra el cáncer de ratón NanoString. El análisis de datos se realizó con el software de análisis avanzado nSolver de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los gráficos de volcanes se dibujaron con el paquete ggplot2 en R. Para obtener lisados ​​tumorales para el análisis de citocinas, los fragmentos tumorales se mantuvieron en un tampón prefabricado (1 tabletas de inhibidor de proteasa Pierce (Thermo Fisher, catálogo n.º A32965) disueltas en 20 ml de T- Reactivo de extracción de proteína de tejido PER, Thermo Fisher, n.º de catálogo 78510) en tubos GentleMACS M (Miltenyi, n.º de catálogo130-093-236) inmediatamente después de la necropsia. A continuación, las muestras tumorales se disociaron utilizando un GentleMACS Octo Disociator. Todas las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 300 g después. A continuación, los sobrenadantes se recogieron en tubos de microcentrífuga y se centrifugaron de nuevo con una microcentrífuga. El análisis de citoquinas se realizó en sobrenadantes por MSD. La inmunohistoquímica se realizó con hematoxilina y eosina para identificar la arquitectura del tejido, así como para los siguientes marcadores cuando se indicaron en los estudios: CD11c (CST, catálogo n.º 87585) y CD8 (CST, catálogo n.º 98941).

Figura 4: Los T785-ISAC obtienen una inmunidad antitumoral robusta en modelos de xenoinjertos de tumores resistentes a trastuzumab. (anuncio) Se implantó la línea de células tumorales HCC1954 en ratones SCID/Beige o NSG y se aleatorizaron cuando el volumen del tumor alcanzó 50 – 75 mm3. (a) Los ratones se trataron una vez por vía intraperitoneal (IP) con 5 mg/kg de trastuzumab T785-ISAC o trastuzumab, o con una dosis equivalente molar con una mezcla de trastuzumab y T785 para ISAC mediante inyección intratumoral (IT). Los datos son de un experimento con n=3-5 ratones por grupo. (b) Los ratones se trataron mediante inyección intraperitoneal con 5 mg/kg de trastuzumab, trastuzumab-ISAC,rituximab o rituximab-ISAC Q5DX6 (n= 5 ratones por grupo). (c) Los ratones se trataron mediante inyección intraperitoneal con 5 mg/kg de trastuzumab, trastuzumab T785-ISAC, trastuzumab N297A-ISAC o trastuzumab TLRnull-ISAC (n=5 ratones por grupo). (d) Se implantaron células tumorales HCC1954 en ratones SCID/Beige, y las células de interés se agotaron antes y durante el tratamiento con trastuzumab T785-ISAC (5 mg/kg, Q5DX3) usando anticuerpo anti-Ly6G (control IgG2a de rata) , liposomas de clodronato (liposomas de control como control) o anticuerpo anti-Gr1 (control IgG2b de rata). Los datos son de un experimento con n=4-6 ratones por grupo. (e, f) Se implantó la línea de células tumorales JIMT-1 en ratones NSG o Rag2/IL2rg con doble knockout y se aleatorizaron cuando el volumen del tumor alcanzó 50 – 75 mm3. Posteriormente, los ratones se trataron con los tratamientos indicados a 5 mg/kg por vía intraperitoneal con una frecuencia de (e) Q5DX6o (f) Q5DX5 (n=3-6 ratones por grupo). (bf) Los datos mostrados son representativos de al menos dos experimentos. (gj) Se recolectaron tumores HCC-1954 de cohortes de ratones en los puntos de tiempo indicados después del tratamiento con una dosis única de 5 mg/kg de ISAC o anticuerpos de control. Los tumores se procesaron para análisis de citometría de flujo, cuantificación de ARNm de NanoString o fijados en formalina e incluidos en parafina para inmunohistoquímica. (g) Los gráficos de volcán representan el cambio log2 veces de la expresión génica en tumores tratados frente a los de control de isotipo medidos por NanoString a las 24 horas (n=5 ratones por grupo). Los cambios con un valor p ajustado de < 0.05="" se="" muestran="" en="" rojo.="" (h)="" puntuaciones="" de="" la="" firma="" genética="" cuantificadas="" por="" la="" puntuación="" de="" la="" ruta="" de="" análisis="" avanzado="" de="" nsolver="" para="" los="" tumores="" analizados="" 24="" horas="" después="" del="" tratamiento="" (n="5" ratones="" por="" grupo).="" (i)="" análisis="" de="" citometría="" de="" flujo="" de="" la="" composición="" celular="" tumoral="" 24="" horas="" y="" 7="" días="" después="" del="" tratamiento="" (n="2-4" ratones="" por="" grupo).="" los="" datos="" son="" representativos="" de="" al="" menos="" 2="" experimentos.="" (="" j="" )="" imágenes="" representativas,="" así="" como="" cuantificación="" de="" f4/80="" y="" cd11c="" ihc="" de="" tumores="" recolectados="" 9="" días="" después="" de="" cada="" tratamiento="" indicado.="" las="" barras="" de="" escala="" son="" de="" 50="" μm.="" (aj)="" los="" datos="" se="" muestran="" como="" media="" con="" sem="" y="" las="" estadísticas="" se="" muestran="" con=""><0.05,><0.01,><0.001,><>

Procedimiento experimental del modelo de tumor singénico Las células MMC se obtuvieron del Dr. Disis (Universidad de Washington) y se cultivaron en RPMI 1640 complementado con 20 por ciento de FBS, 1 por ciento de penicilina-estreptomicina y L-glutamina a 37 grados y 5 por ciento de CO2 hasta {{8 }} por ciento confluente. Las células CT26 (ATCC) transfectadas para expresar de forma estable la proteína HER2 de rata se cultivaron en RPMI 1640 complementado con 10 % de FBS y 600 ug/mL de antibiótico selectivo G418 (Thermo) a 37 grados y 5 % de CO2 hasta 80-90 % de confluencia. Una vez suficientemente confluentes, las células se recolectaron separando con Accutase (Stemcell) y lavando con PBS. Las células recolectadas se resuspendieron a 20 x 106 células/mL (MMC)o 5 x 106 células/mL (CT26-rHER2) en PBS y mantenido a 4 grados/en hielo hasta su uso. 100 lde células suspendidas se implantaron por vía subcutánea en ratones FVB/N-TgN(MMTV-Erbb2)NK1Mul/J de 6-8-semanas de edad (modelo MMC, The Jackson Laboratory) o ratones hembra BALB/c (modelo CT26, The Jackson Laboratory) . El tamaño del tumor se midió y registró dos vecesuna semana durante la duración del estudio. El volumen del tumor se estimó usando la siguiente fórmula: (largo x ancho2)/2. Una vez que los tumores alcanzaron 200-500 mm3 (MMC) o 50-100 mm3 (CT26-rHER2), generalmente dentro de una semana desde la implantación del tumor, se iniciaron los tratamientos. Los ratones se aleatorizaron según el tamaño del tumor en grupos de tratamiento antes de latratamiento. El mAb anti-rHER2 (BioXCell; 7.16.4) o anti-rHER2-ISAC se administraron por vía intraperitoneal (frecuencia como se indica en las leyendas de las figuras) durante la duración del estudio.Los ratones cuyos tumores superaron los 2000 mm3 se sacrificaron. Se evaluó el agotamiento de las células Ten animales usando anticuerpos depletores de células CD4 (BioXCell; GK1.5) o CD8 (BioXCell; YTS 169.4). El agotamiento se inició antes de la implantación del tumor y continuó con la administración dos veces por semana de 200 ug por anticuerpo. Para la nueva exposición al tumor, se implantaron líneas celulares CT26 y 4T1 a razón de 5 x 106 células por línea tumoral, y los ratones sin tratamiento previo con tumor se expusieron a ambas líneas celulares como controles.

Material complementario Consulte la versión web en PubMed Central para obtener material complementario. Agradecimientos: los autores desean agradecer a P. Basto, NE Reticker-Flynn, T. Prestwood y B. Mallet por su útil discusión. También agradecemos al Núcleo de Citometría de Flujo del Centro de Sangre de Stanford, específicamente a L. Tolentino, O. Choi y N.Wu. También extendemos nuestro agradecimiento a la Dra. Mary L. (Nora) Disis y Denise Cecil de la Universidad de Washington, quienes proporcionaron la línea de células tumorales MMC.

Financiamiento: SE Ackerman recibió el apoyo de una beca Stanford BioX Bowes.

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Figura 6: Los ISAC que contienen CL264- provocan la eliminación del tumor en xenoinjertos que expresan medio HER2 y la eliminación del tumor mediada por células T, la memoria inmunológica y la propagación del epítopo en un modelo de tumor singénico. ( a ) Estructuras químicas de los adyuvantes T785 y CL264 utilizados para la generación de ISAC. (b) Los ratones NSG implantados con la línea de células tumorales HCC1954 se aleatorizaron cuando el volumen del tumor alcanzó los 50 – 75 mm3. Los ratones se trataron una vez mediante inyección intraperitoneal de 5 mg/kg de trastuzumab, trastuzumab T785-ISAC o trastuzumab CL264-ISAC. Los tumores se recogieron 20 horas después de la administración, se procesaron en una suspensión de una sola célula y se analizaron mediante citometría de flujo para evaluar la activación de las APC mieloides que infiltran el tumor. (cd) A ratones NSG o Rag2/IL2rg con doble knockout se les implantó la línea celular tumoral humana indicada y se aleatorizaron cuando el volumen del tumor alcanzó 50 – 75 mm3 (HCC1954) o 75 – 150 mm3 (JIMT-1). Los ratones se trataron mediante inyección intraperitoneal con 5 mg/kg de rituximab, trastuzumab, trastuzumab T785-ISAC, trastuzumab CL264-ISAC o el isotipo respectivo.ISAC, cada 5 días para un total de 6 tratamientos. (e) La expresión de rHER2 se midió en células tumorales CT26-rHER2 en cultivo antes de la implantación (gráfico de flujo izquierdo) y en tumores nueve días después de la implantación (gráfico de flujo derecho) mediante citometría de flujo con anticuerpo anti-rHER2 conjugado con fluorescencia (rojo) o control de isotipo (azul). (f) A los ratones Balb/c se les implantó la línea de células tumorales CT26-rHER2 y se aleatorizaron cuando el volumen del tumor alcanzó 50mm3. A continuación, los ratones se trataron mediante inyección intraperitoneal con 10 mg/kg de anti-rata de ratón.HER2 o ratón anti-HER2 CL264-ISAC de rata cada 5 días para un total de 6 tratamientos. Los datos que se muestran son de 1 experimento con 8 ratones por brazo y son representativos de 3 experimentos.

(g) Anti-rat HER2 CL264-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >21 días después de su último tratamiento fueron desafiados con CT26 parental (flanco izquierdo) y líneas celulares 4T1 (flanco derecho), con o sin depleción de células T CD4 y CD8 (n =3 cada una). Se incluyeron como controles ratones ingenuos para tumores (n=6) desafiados con las líneas celulares parentales CT26 y 4T1. (ai) Los datos se muestran de experimentos individuales con 3-6 ratones por brazo y son representativos de 1-4 experimentos con un mínimo de 3 ratones por brazo en cada experimento. Los datos se muestran como media con SEM y las estadísticas se muestran con *P<><0.01,><0.001, and=""><>

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