Los conjugados de anticuerpos inmunoestimulantes provocan una activación mieloide robusta y una inmunidad antitumoral duradera (parte 1)

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Resumen

Los receptores de reconocimiento de patrones innatos, incluidos los receptores tipo toll (TLR), pueden alterar el microambiente del tumor y estimular la inmunidad antitumoral adaptativa.Sin embargo, los agonistas de TLR no han sido bien tolerados debido a las toxicidades asociadas con la activación inmunitaria generalizada después de la administración sistémica.Diseñar un tratamiento que sea adecuado para la administración sistémica ycapaz de provocar una respuesta dirigida al tumor, desarrollamos una nueva clase de conjugados de anticuerpos inmunoestimulantes (ISAC) que comprenden un agonista de TLR7/8 conjugado con anticuerpos dirigidos al tumor.Los ISAC anti-HER2 administrados sistémicamente fueron bien tolerados in vivo y provocaron una fuerte activación de las células mieloides intratumorales, lo que resultó en la eliminación del tumor y la subsiguiente memoria inmunológica.La potencia in vitro y la eficacia in vivo requerían una actividad en tándem impulsada por la funcionalidad Fc intacta y el agonismo TLR para permitir la fagocitosis y la inmunidad antitumoral mediada por células T.La memoria inmunológica mediada por ISAC no se limitó a HER2, ya que los ratones tratados con ISAC estaban protegidos contra una nueva exposición a un tumor HER2-negativo.Estos resultados proporcionan una sólida base para el desarrollo clínico de ISAC y muestran que la sinergia entre la señalización de Fc R y TLR7/8 contribuye al mecanismo de inmunidad antitumoral mediada por ISAC.

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Introducción

Antes de finales del siglo XX, los pacientes con cáncer generalmente tenían tres modalidades de tratamiento disponibles: resección quirúrgica, radiación y quimioterapia. El surgimiento de la inmunoterapia contra el cáncer agregó una poderosa cuarta modalidad que amplió enormemente el repertorio oncológico, comenzando con la aprobación de rituximab para el linfoma no Hodgkin y extendiéndose hasta la adopción generalizada de inhibidores de puntos de control 1,2. Sin embargo, cualquier terapia, incluida la inmunoterapia, está temporalmente limitada a menos que genere respuestas biológicas e inmunológicas duraderas que superen la heterogeneidad tumoral y la carga mutacional 3–5. Los inhibidores de puntos de control como los anticuerpos anti-PD-1 y PD-L1 mejoran drásticamente los resultados en varias indicaciones, incluso en pacientes con alta carga mutacional del tumor o inestabilidad de microsatélites, y un factor determinante de la susceptibilidad del tumor a la inmunoterapia de punto de control es el grado de pre -infiltración de células T existente. Los pacientes con tumores "fríos" que tienen un escaso infiltrado de células T responden menos al bloqueo de puntos de control y tienen peores pronósticos en comparación con los pacientes con tumores "calientes" en los que las células T inmunosuprimidas reactivas al tumor están presentes dentro del microambiente tumoral (TME) 6,7 . La biopsia tumoral y la inmunohistoquímica indican que las células presentadoras de antígeno (APC) profesionales, como las células dendríticas (DC), suelen ser más frecuentes en el TME que las células T, aunque siguen siendo susceptibles a los mecanismos inmunosupresores 8,9. Dada la presencia de células mieloides en el TME y su papel en la promoción de la activación de las células T, ha habido un esfuerzo cada vez mayor para desarrollar terapias que activen las APC asociadas a tumores para provocar una inmunidad de células T generalizada y una respuesta inmunitaria antitumoral eficaz.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 donantes. (d) Rituximab se hizo reaccionar con SATA a través de residuos de lisina para convertir las aminas libres en grupos sulfhidrilo protegidos antes de la desacetilación con hidroxilamina y la reacción posterior con T785-MCC para producir rituximab-ISAC. ( e ) Análisis LC-MS del rituximab-ISAC después del tratamiento con PNGase F. La DAR se calculó sobre la base de la adición en masa del enlazador-agonista de 606 g/mol. (f) Se incubó rituximab o rituximab-ISAC marcado con fluorescencia con células tumorales CD20 más Toledo a 4 grados durante 2 horas antes del análisis mediante citometría de flujo. Los datos son de 1 experimento con muestras por triplicado y son representativos de 2 experimentos.( gh ) Las APC mieloides humanas recién aisladas se cultivaron con rituximab, T785, rituximab y T785 o el rituximab-ISAC en presencia de células tumorales CD20 más Toledo marcadas con CFSE en una proporción de efector a objetivo de 3: 1. La concentración de rituximab se representa en el eje X, siendo la concentración de T785 en estos ensayos coherente con la cantidad de T785

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 donantes (media y SEM); *PAGS<0.05,><0.01,><0.001,><>

Ahora está bien documentado que la administración local de agentes inmunoestimuladores en modelos preclínicos puede reprogramar las APC residentes del tumor suprimidas en células activadas capaces de procesar y presentar antígenos asociados al tumor, incluidos los neoantígenos, a las células T que posteriormente median la inmunidad antitumoral 10–13 . Una estrategia de este tipo iniciada por Carmi et al demostró que la administración intratumoral de anticuerpos alogénicos dirigidos contra el tumor con un agonista del receptor tipo Toll (TLR)-3 o con TNF y CD40L rescataron funcionalmente las APC asociadas al tumor que conducen a una mayor captación de antígeno y inducción posterior de inmunidad de células T antitumorales. Esta estrategia de combinación, que aprovechó la función efectora del anticuerpo con el agonista de TLR, condujo a la erradicación de tumores primarios y lesiones metastásicas y protegió al huésped de la recurrencia del tumor 11,14. De manera similar, un anticuerpo anti-OX40 agonista en combinación con un agonista de TLR9, CpG, activó las APC y las células T dentro del tumor, lo que resultó en una eficacia impresionante contra múltiples tipos de tumores en ratones 13. La traducción efectiva de las estrategias de activación de APC en la clínica está siendo investigada. investigado en múltiples indicaciones con datos clínicos en pacientes con melanoma que sugieren que la administración intratumoral de agonistas TLR9 en combinación con anticuerpos anti-PD-1 puede conducir a la reducción del tumor y respuestas abscopales en lesiones no inyectadas 15. De manera similar, varios Los grupos buscan agonistas de TLR7/8 para la inmunoterapia tumoral, ya que el patrón de expresión de TLR7/8 en las APC humanas refleja más fielmente el patrón de expresión de TLR7 y TLR9 en las APC murinas16–18. En última instancia, la adopción de estrategias de administración intratumoral, si son eficaces, se verá limitada por la accesibilidad del tumor, ya que la administración sistémica de agonistas inmunitarios dirigidos a las APC se ha visto restringida por la toxicidad, las vidas medias cortas y la administración subóptima a los sitios de destino.Nuestro objetivo era diseñar un conjugado de anticuerpos inmunoestimulantes (ISAC) que comprendiera un anticuerpo monoclonal dirigido a tumores conjugado con un agonista inmunológico como un enfoque terapéutico novedoso para obtener una inmunidad antitumoral duradera. La administración sistémica de ISAC provocó la activación de APC localizada en el TME que dependía de Fcfunción efectora y activación de TLR mientras evita las toxicidades típicas asociadas con la administración sistémica de agonistas de TLR. Además, la administración sistémica de estos conjugados a ratones portadores de tumores permitió el procesamiento y la presentación de antígenos a las células T, lo que condujo a una inmunidad antitumoral sostenida en múltiples modelos que son resistentes al anticuerpo dirigido al tumor no conjugado.

Resultados

Diseño y caracterización de ISAC Para permitir la conjugación de un agonista de TLR con un anticuerpo, se emplearon herramientas de acoplamiento molecular para diseñar un nuevo agonista de TLR7/8 (T785) con una butilamina que sirvió como un punto de unión al anticuerpo accesible por solvente ( Figura 1A, Figura complementaria 1A-C). T785 interactuó con TLR7 humano con un EC50 de 0,643 μM y TLR8 humano con un EC50 de 1,60 μM en líneas celulares HEK293 que coexpresan un indicador de fosfatasa alcalina secretada inducible por NF-κB y TLR7 o TLR8 (Figura 1B ). La especificidad de T785 para TLR7/8 se confirmó por la incapacidad de T785 para inducir la actividad de NF-κB en células reporteras HEK293 que carecen de expresión de TLR7/8 (Figura 2A complementaria). Para confirmar la actividad agonista en las células primarias, monocitos y DC recién aislados, denominados APC mieloides (~96 por ciento de monocitos, 4 por ciento de DC; Figura complementaria 3A), que expresan tanto TLR7 como TLR8, se estimularon durante la noche con 1 μM T785 o R848, un agonista de TLR7/8 bien establecido y caracterizado 19. T785 y R848 estimularon las APC mieloides en un grado similar (Figura 1C) 20,21. La actividad de T785 también se confirmó en DC plasmocitoides humanas (pDC) recién aisladas, que expresan TLR7 pero no TLR8 (Figura 2B complementaria). Para investigar los efectos de los ISAC en cultivos humanos in vitro, se generó un ISAC con rituximab (Figura 1D), un anticuerpo monoclonal anti-CD20 clínicamente validado que se utiliza para el tratamiento de tumores malignos de células B, mediante conjugación con T785 en una reacción de varios pasos. con reticuladores heterobifuncionales compatibles 22. La eficiencia de conjugación de T785-ISAC se midió mediante LC-MS después de la desglicosilación con PNGase F, lo que resultó en una proporción promedio de fármaco a anticuerpo (DAR) de 1,71 (Figura 1E). Confirmamos que ISAC retuvo una unión comparable a CD20 luego de experimentos de citometría de flujo con la línea celular tumoral Toledo que expresa CD20-, una línea celular bien caracterizada derivada de un paciente con linfoma difuso de células grandes (Figura 1F) 23. T 785-La unión de ISAC a los receptores Fc humanos (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) fue evaluada por Biacore y fue comparable a rituximab (Tabla 1 complementaria). Los ISAC activan las APC mieloides humanas El potencial inmunoestimulador de la T de rituximab{{77 }}ISAC se evaluó después del cocultivo de APC mieloides humanas recién aisladas con células tumorales CD20 más Toledo marcadas con CFSE durante 18 horas. Las APC mieloides cultivadas con rituximab T785-ISAC experimentaron cambios morfológicos rápidos consistentes con la morfología de las DC, mientras que la morfología de las DC no fue observado en cocultivos incubados con rituximab, T785 o una mezcla equimolar de rituximab y T785 (Figura 1G). Las APC estimuladas con rituximab T785-ISAC permanecieron viables y de morfología dendrítica durante hasta ocho días, mientras que las APC estimuladas con la mezcla eran en su mayoría no viables el día ocho (Figura 1H). Análisis de citometría de flujo multicolordespués de 18 horas indicó que las APC estimuladas con rituximab T785-ISAC regularon a la baja CD14 y CD16 y concomitantemente regularon al alza CD123, un marcador de superficie celular que se ha demostrado queregularse al alza en las CD mieloides activadas 24. Por el contrario, las APC estimuladas con rituximab,T785 o la mezcla no modularon la expresión de estos marcadores (Figura 1I, Figura complementaria 4A, estrategia de activación descrita en las Figuras complementarias 3BC).

Las APC humanas estimuladas con rituximab T785-ISAC también aumentaron la molécula coestimuladora CD86 de una manera dependiente de la dosis, con tendencias similares observadas con la regulación al alza de CD40 y HLA-DR consistente con el fenotipo de las APC activadas (Figura 1I & Figura complementaria 4B). Los cambios dependientes de la dosis en la expresión del marcador de superficie fueron consistentes, ya sea que se evaluaron como la intensidad de fluorescencia mediana (MFI, Figura 1) o como el porcentaje de la población total de células que es positiva para el marcador respectivo (Figura 5 complementaria). El análisis posterior de los sobrenadantes libres de células demostró que las APC estimuladas con rituximab T785-ISAC secretaron mayores cantidades de TNF e IL-1 (Figura 2J y Figura complementaria 4C). El potencial inmunoestimulador de los T785-ISAC no se limitó al rituximab, ya que un T785-ISAC generado con trastuzumab también provocó una activación mieloide mejorada (Figura 4D complementaria). La capacidad de las APC estimuladas por ISAC para provocar la presentación de antígenos y el cebado cruzado de células T CD8 plus se evaluó utilizando el sistema de antígeno modelo de ovoalbúmina (OVA) 25,26. CD11c esplénica más DC aisladas de ratones de tipo salvaje se cultivaron durante la noche con inmunocomplejos formados con OVA y el anticuerpo anti-OVA o ISAC. Las CD cargadas con OVA se cuantificaron y se incubaron con linfocitos T OT-I CD8 plus que tienen especificidad de TCR para el péptido OVA, SIINFEKL, complejado con MHC-I. Presentación cruzada mejorada mediada por ISAC anti-OVA, medida por la cantidad de MHC-I, péptido SIINFEKL unido y cebado cruzado mejorado medido por la proliferación de células T CD8 más (Figuras complementarias 6A y 6B). Los ISAC provocan TLR amplificado y señalización intracelular asociada a Fc R en APC mieloides humanas La activación de Fc R y TLR induce una cascada compleja de señalización fosfo, y la magnitud y las características de estas respuestas difieren entre varios subconjuntos de células inmunitarias 27. Investigamos las vías de señalización intracelular aguas abajo involucradas en varios tipos de células dentro de cocultivos de PBMC-tumores estimulados con rituximab T785-ISAC en comparación con controles de mezcla equimolar utilizando citometría de masas (CyTOF) 28. Los subgrupos de leucocitos (es decir, monocitos, CD4 más células T) se identificaron mediante agrupación SPADE utilizando marcadores de linaje con células diana que abarcan tanto CD20 más células tumorales de Toledo como células B sanas 29. Eventos de fosforilación asociados con la señalización de TLR (pIRF7) y Fc R (pERK1/2) se incrementaron 15 minutos después de la estimulación con el T785-ISAC en monocitos y cDC, en comparación con la mezcla de componentes individuales 30,31. La señalización intracelular se restringió en gran medida a las células de origen mieloide (monocitos y CDC), así como a las CDp, quetodos expresan el requisito Fc Rs y TLR7 y/o TLR8. En monocitos y CDC, la estimulación inducida por ISAC también resultó en una fosforilación significativamente mayor de MAPKAPK2, p38, CREB y la proteína ribosómica S6 (RPS6), un requisito para iniciar la síntesis de proteínas aguas abajo (Figura 2A-C y Figura 7A complementaria). CD141 más cDC y CD1c más cDC mostraron niveles comparables de pIRF7 en ambos subconjuntos de CDC, mientras que los niveles de RPS6 y pERK1/2 tendieron a ser más altos en CD141 más cDC, que sobresalen en CD8 más cebado de células T y presentación cruzada de antígenos, en comparación con CD1c más CDC (Figura 7B complementaria).

La cinética de la estimulación de T785-ISAC fue consistente con la dinámica de señalización esperada: la fosforilación de ERK1/2 alcanzó su punto máximo después de 5 minutos, mientras que su socio aguas abajo RPS6 no alcanzó la fosforilación máxima hasta el punto de tiempo de 15-minutos (Suplementario Figura 7C). Esta cinética respalda la dinámica esperada a medida que la señalización se propaga con el tiempo y sugiere que existe una respuesta de señalización sostenida y amplificada a la estimulación de las APC por ISAC. Dada la respuesta amplificada observada después de la estimulación ISAC asociada con las vías de señalización de Fc R y TLR, a continuación utilizamos los algoritmos de estimación de información mutua remuestreada de densidad condicional (DREMI) y visualización reescalada de densidad condicional (DREVI) para cuantificar la fuerza de las relaciones por pares dentro de las vías de señalización Fc R y TLR 32. Estos algoritmos generan gráficos DREVI para su visualización, donde el área bajo la curva (AUC) es un indicador de la intensidad de la señal general, el punto de inflexión (IP) es una medida del umbral de activación y el La puntuación DREMI cuantifica la dependencia por pares de las dos fosfoproteínas en cuestión. Este análisis identificó puntuaciones DREMI aumentadas que indican una mayor dependencia por pares entre las proteínas asociadas con las vías de señalización de Fc R y TLR después de la estimulación T785-ISAC en comparación con los controles de mezcla equimolar (Figura 2D). Se observó de forma única una fuerte interdependencia entre pERK1/2 y pIRF7 después de la estimulación con T785-ISAC, pero no una mezcla, como lo indica un puntaje DREMI aumentado, una intensidad de señal amplificada y un umbral de activación reducido requerido para la fosforilación de IRF7 (Figura 2D ). Este análisis también indicó un umbral de activación reducido requerido para iniciar la traducción de proteínas (fosforilación de RPS6) luego de la estimulación ISAC, según lo cuantificado por puntajes DREMI aumentados y IP reducidos para las combinaciones por pares de pERK1/2-pRPS6 y pIRF7-pRPS6 . Además, el nivel de fosforilación de RPS6 se amplificó como resultado de la fosforilación de ERK1/2 o IRF7 según lo determinado por el aumento de las AUC por pares (Figura 2D). Estos resultados combinados no solo confirman la señalización de ISAC a través de las vías Fc R y TLR esperadas, sino que además respaldan la sinergia entre las dos vías, lo que da como resultado umbrales de activación reducidos e intensidades de señal amplificadas.

Figura 3: Los ISAC requieren la función efectora de Fc y el agonista de TLR para mediar en la activación mieloide. Se cultivaron APC mieloides humanas recién aisladas durante 18 horas en presencia de CD20 más células tumorales de Toledo en una proporción de 3:1 de efector a diana y (a) 80 nM del rituximab-ISAC con o sin R406 1 μM, (b) rituximab-ISAC en el isotipo de anticuerpo indicado, (c) rituximab-ISAC o rituximab-ISAC desglicosilado (ISAC-desglicosilado). ( ac ) Las células se analizaron mediante citometría de flujo y los datos se informan como intensidad de fluorescencia media. ( d ) Se cultivaron células indicadoras HEK-Blue-TLR7 o TLR8 durante 18 horas en presencia de T785 o TLRnull antes de la evaluación de la actividad SEAP inducida por NF-κB. Los datos mostrados sonde 1 experimento y representante de al menos 3 experimentos. (e) Las APC mieloides humanas recién aisladas se cultivaron durante 18 horas en presencia de células tumorales CD20 más Toledo y los rituximab-ISAC indicados y se analizaron mediante citometría de flujo (los datos se muestran como la medianaIntensidad fluorescente). (ae) Los datos que se muestran son representativos de 1-4 experimentos adicionales y mayores o iguales a 3 donantes para cada experimento (media y SEM). La significación estadística se define como *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Los ISAC requieren la función efectora de Fc para mediar en la activación de las APC mieloides. La contribución de la actividad de Fc a la función de ISAC se investigó luego de la ablación de la señalización de Fc R aguas abajo con R406, una molécula pequeña inhibidora de la cinasa de Syk que previene la transducción de señales aguas abajo del Fc Rs activador 33,34 . La adición de R406 anuló la activación mieloide mediada por T785-ISAC como lo demuestra la falta de regulación positiva de la molécula coestimuladora CD86 pero no alteró la respuesta celular a la activación de TLR7/8 por T785 (Figura 3A & Figura Suplementaria 8). La inhibición de Syk con R406 también anuló la señalización en monocitos después de la estimulación de T785-ISAC, conniveles significativamente reducidos de MAPKAPK-2 fosforilados, ERK1/2 e IRF7 medidos (Figura 7D complementaria).Teniendo en cuenta estos datos, los T785-ISAC de rituximab se formularon con DAR comparables en cada uno de los cuatro isotipos naturales para definir el grado en que la actividad de T785-ISAC varía con las afinidades de unión a Fc R conocidas 35,36. También se investigaron los ISAC de rituximab aglicosilados y fucosilados, ya que la glicosilación anula la unión de Fc R, mientras que la fucosilación aumenta la afinidad de unión por FCGR3A 37. La capacidad inmunoestimuladora del rituximab T785-ISAC se correlacionó con la afinidad de Fc R del isotipo del anticuerpo (Figura 3B). Por el contrario, los IgG1 fucosilados (IgG1-AF), IgG1 de tipo salvaje e IgG3 T785-ISAC provocaron la activación mieloide, con el IgG1-AF T785-ISAC induciendo la mayor niveles de regulación positiva de CD86 (Figura 3B). La desglicosilación del rituximab T785-ISAC de tipo salvaje con PNGase F, que reduce la afinidad de unión de Fc-FcR, resultó en una disminución de la actividad inmunoestimuladora de ISAC in vitro, lo que respalda la importancia de una región Fc funcionalmente activa (Figura 3C).

Los ISAC requieren el agonismo de TLR para mediar en la activación mieloide. La contribución de la actividad de TLR en la función de ISAC se investigó luego de la ablación del agonismo de TLR mediante la eliminación de la 2-aminopiridina de T785 que se cree que forma un puente salino con residuos críticos de aspartato en la unión bolsillos de TLR7 y TLR8 38 (TLRnull, Figura 3D). El compuesto TLRnull se conjugó con rituximab (TLRnull ISAC) y se evaluó el potencial de activación mieloide en presencia de células tumorales CD20 plus in vitro. El TLRnull ISAC no indujo la regulación positiva de la molécula coestimuladora CD86 ni moduló la expresión de CD14 o CD123, lo que indica que se necesita el agonismo de TLR para el fenotipo de activación observado con T785-ISAC (Figura 3E). Además, el TLRnull ISAC no indujo la fosforilación de IRF-7 en los monocitos, lo que concuerda con su incapacidad para interactuar con TLR7/8 (Figura 7E complementaria). El trastuzumab T785-ISAC administrado sistémicamente elimina los tumores en ausencia de Actividad de las células B, T o NK en modelos tumorales de xenoinjertos humanos La capacidad de los ISAC para inducir la destrucción de tumores sólidos mediada por mieloides y neutrófilos en ausencia de actividad de células B, T y NK se evaluó utilizando modelos de xenoinjertos humanos 39,40. Trastuzumab, un anticuerpo dirigido a HER2-clínicamente validado, fue seleccionado para la investigación para determinar si el T785-ISAC de trastuzumab podría superar la resistencia tumoral a trastuzumab en modelos de tumores sólidos HER2 más (Figura 4 y Figura 9 complementaria ) 41,42. En primer lugar, se comparó la administración sistémica de trastuzumab T785-ISAC con la administración intratumoral de una mezcla de trastuzumab y T785. El T785-ISAC de trastuzumab provocó la regresión y la eliminación del tumor, mientras que la administración de una mezcla equimolar de componentes proporcionó un beneficio terapéutico mínimo en comparación con el trastuzumab solo (Figura 4A). Los estudios posteriores que compararon los ISAC dirigidos a tumores con sus controles de isotipo apropiados confirmaron que la actividad antitumoral requería la orientación al tumor (Figura 4B y Figura complementaria 10). Es importante destacar que la administración sistémica de trastuzumab T785- ISAC y su control de isotipo fueron bien tolerados, con un impacto mínimo en el peso corporal (Figura 11 complementaria).Para determinar si el mecanismo de acción que contribuye a la eficacia de ISAC in vivo es similar al descrito in vitro, Fc-incompetente (trastuzumab N297A-ISAC) y trastuzumab TLRnull-ISAC se probaron en el mismo modelo de xenoinjerto de tumor de mama enparalelo con un trastuzumab de tipo salvaje T785-ISAC.Mientras que el T785-ISAC de trastuzumab condujo a la regresión y eliminación del tumor, tanto el ISAC incompetente para Fc como el ISAC nulo para TLR no lograron provocar actividad antitumoral (Figura 4C).Juntos, estos datos indican un requisito para la orientación del tumor y el compromiso tanto de Fc R como de TLR para la actividad antitumoral de ISAC.

La contribución diferencial de los neutrófilos frente a otras células mieloides en la mediación de los efectos antitumorales se evaluó mediante depleciones específicas de células.Los neutrófilos se agotaron usando un anticuerpo Ly6G, mientras que el agotamiento tanto de los neutrófilos como de las APC inmaduras (monocitos)se logró con un anticuerpo anti-Gr1.Las células fagocíticas se agotaron utilizando liposomas cargados con clodronato.Encontramos que las células fagocíticas, presumiblemente macrófagos, contribuyeron significativamente a mediar la actividad antitumoral después del tratamiento con ISAC (Figura 4D).Sin embargo, el agotamiento de neutrófilos con anti-Ly6G no tuvo impacto en la eficacia de ISAC.El agotamiento de Gr1 no tuvo un impacto inmediato en la eficacia mediada por ISAC, pero redujo la duración del control del tumor (Figura 4D).Para investigar la capacidad de los T785-ISAC para controlar el crecimiento tumoral en modelos con menorExpresión de HER2, luego modelamos la eficacia en el modelo de tumor de expresión media HER2-resistente a trastuzumab, JIMT-1.Se estima que la línea de células cancerosas JIMT-1 tiene aproximadamente 6,5 x105 copias de HER2 de superficie y expresa un nivel reducido deHER2 en comparación con la línea celular tumoral HCC1954 por citometría de flujo 43.Mientras que latrastuzumab T785-ISAC ralentizó significativamente el crecimiento tumoral en comparación con los controles de isotipo ISAC o trastuzumab, no se observó regresión o eliminación del tumor (Figura 4E).Presumimos que pertuzumab, que se une a un epítopo HER2 distinto del sitio de unión de trastuzumab, aumentaría la agrupación de Fc y, posteriormente, mejoraría la ADCP y la eficacia de ISAC en el modelo JIMT-1.La combinación de trastuzumab T785-ISAC con pertuzumab condujo a una eficacia significativamente mejorada y una regresión significativa del tumor (Figura 4F).Sin la estimulación inmunológica del trastuzumab T785-ISAC, la combinación de pertuzumab con trastuzumab no proporcionó ningún beneficio.

A continuación, investigamos los eventos moleculares y celulares desencadenados por trastuzumab T785-ISAC que, en última instancia, dan como resultado una eficacia antitumoral.Cambios tempranos en la expresión génica en tumoresse midieron con el panel de perfilado inmunitario contra el cáncer de ratón NanoString, que reveló una regulación positiva significativa del 13,7 % de los genes dentro de las 24 horas posteriores al tratamiento, incluidos los genes asociados con la señalización y activación de TLR7 (IRF-7, genes asociados con NF-kB)en comparación con 0-0.1 por ciento después del tratamiento con trastuzumab o isotipo T785-ISAC (Figura 4G) 44.El análisis de las vías de expresión génica evaluadas por nSolver Advanced Analysis Pathway Score reveló una regulación positiva significativa de firmas genéticas clave relacionadas con el sistema inmunitario (funciones de macrófagos, funciones de DC, procesamiento y presentación de antígenos) que fueronconsistente con los hallazgos in vitro e in vivo de que las interacciones Fc-Fc R son críticas para la actividad mediada por ISAC (Figura 4H y Figura 12 complementaria).Las puntuaciones de las firmas genéticas asociadas con las quimiocinas y las citocinas fueron muy elevadas después del tratamiento con trastuzumab T785-ISAC, de acuerdo con la cuantificación de proteínas realizada para medir la secreción de citocinas y quimiocinas dentro del tumor 24 horas después de la administración (Figura 4Hy Figura Suplementaria 13).Estos hallazgos, en congruencia con los datos de eficacia in vitro e in vivo, indican que ISAC induce una respuesta mediada por TLR y Fc R robusta.

Se utilizaron la citometría de flujo y la IHC para evaluar si el aumento de la activación mediada por T785-ISAC y la expresión de quimiocinas conducían finalmente al reclutamiento de células efectoras inmunitarias.Los infiltrados inmunes mieloides se perfilaron mediante citometría de flujo 24 horas y 7 días después de la administración de una dosis única de trastuzumab T785-ISAC o trastuzumab y se compararon con controles no tratados.Análisis de tumores 24 horas después del tratamiento reveladoinfiltración de CD11b más Ly6C más monocitos y CD11b más Ly6G más granulocitos en los tumores tratados con trastuzumab o trastuzumab T785-ISAC en comparación con los controles no tratados (Figura 4I).Siete días después del tratamiento, CD11b más CD11c más F4/80 más APC mieloide positivo aumentaron significativamente en el grupo tratado con trastuzumab T785-ISAC en comparación contrastuzumab o controles no tratados (Figura 4I) 45,46.Este aumento en las APC mieloides puede seratribuido al aumento significativo en la producción de quimiocinas relacionadas con mieloides después del tratamiento con trastuzumab T785-ISAC.Si bien no hubo un aumento significativo en la frecuencia de APC mieloides en el punto de tiempo de 24-hora, las células de este fenotipo se activaron después del tratamiento con trastuzumab T785-ISAC, según lo medido por la regulación positiva de CD40 en la superficie celular , en comparación con la misma población de trastuzumab o controles no tratados (Figura 4I).Este hallazgo, junto con los datos de NanoString, demuestra aún más la capacidad de trastuzumab T785-ISAC para participar y activar las células mieloides en el microambiente tumoral.Dada la positividad para CD11b de las APC mieloides observada una semana después del tratamiento, el infiltrado temprano de monocitos puede ser precursor de la población de APC mieloides que madura en los tumores tratados con ISAC pero no en los tumores tratados con trastuzumab.Sin embargo, queda por determinar cómo los eventos proximales proinflamatorios medidos 24 horas después de la estimulación ISAC por NanoString y MSD finalmente influyeron en los eventos distales, como la maduración de las células mieloides en el microambiente tumoral en transformación en el punto de tiempo del 6-día posterior. y, en última instancia, influyó en la regresión y la eliminación del tumor.
Finalmente, se realizó IHC para evaluar la presencia y ubicación de poblaciones de células inmunitarias clave en el tumor después del tratamiento con trastuzumab T785-ISAC en comparación con sus controles.De acuerdo con la citometría de flujo del día 7, las células que expresan F4/80 enel tumor y la región peritumoral se elevaron el día 9 después de un único tratamiento con trastuzumab T785-ISAC (Figura 4J).Además, el tratamiento con ISAC dirigido resultó en un aumento dramático en las células CD11c plus en la región peritumoral que no se observó después del tratamiento con anticuerpos rHER2 o el tratamiento con isotipo o isotipo-ISAC (Figura 4J).La elevación en las células CD11c plus tanto por citometría de flujo como por IHC también se evidenció en los datos de NanoString, en los que la expresión de ARNm de ITGAX se elevó significativamente en los días 6 y 9 después de la administración de trastuzumab T785-ISAC (Figura 14 complementaria).

Figura 5: Los T785-ISAC provocan efectos antitumorales sólidos en el modelo de tumor singénico MMC. (ah) A ratones FVB/N-TgN (MMTV-Erbb2) se les implantó la línea de células tumorales MMC. (a) Los ratones hembra se aleatorizaron cuando el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 500 mm3. Luego, los ratones se trataron mediante inyección intraperitoneal con 5 mg/kg q5d x 2 de anticuerpo de ratón anti-HER2 de rata, de ratón anti-HER2 de rata T785-ISAC, o isotipo T785-ISAC (TA99) (n =4-7 ratones por brazo). (b, c) Los ratones macho se aleatorizaron cuando el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 500 mm3 y se pretrataron comenzando un día antes de la fecha de tratamiento inicial con liposomas de control o cargados con clodronato para el agotamiento de fagocitos (6 ciclos, hasta el día 15) o anti -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >60 días después de su último tratamiento fueron desafiados con la línea celular tumoral MMC. Los ratones ingenuos para tumores sirvieron como controles de implantación (n=5 ratones por grupo). (ad) Los datos son representativos de al menos 2 experimentos. Los ratones fueron sacrificados humanamente una vez que los tumoresllegó a 2,000 mm3. Se muestran los datos de aquellos grupos en los que ningún tumor había alcanzado2,000 mm3. (ei) Las cohortes de ratones se aleatorizaron cuando los volúmenes tumorales de los tumores MMC alcanzaron aproximadamente 500 mm3 y se trataron con 5 mg/kg de ISAC o anticuerpos de control dosificados en el día 0 y el día 5. Los tumores se procesaron para la medición de citoquinas por MSD , análisis de citometría de flujo, cuantificación de ARNm de NanoString o fijado en formalina e incluido en parafina parainmunohistoquímica en los tiempos indicados. (e) Los gráficos de volcán representan el cambio log2 veces de la expresión génica en tumores tratados frente a los de control de isotipo medidos por NanoString a las 24 horas (n=5 ratones por grupo). Los cambios con un valor p ajustado de <0.05 se="" muestran="" en="" rojo.="" (f)="" puntuaciones="" de="" firmas="" genéticas="" cuantificadas="" por="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" para="" tumores="" analizados="" 24="" horas="" después="" del="" tratamiento="" (n="5" ratones="" por="" grupo).="" (="" g,="" h="" )="" análisis="" de="" citometría="" de="" flujo="" de="" la="" composición="" celular="" tumoral="" y="" el="" estado="" de="" activación="" 24="" horas="" y="" 6="" días="" después="" del="" inicio="" del="" tratamiento="" (n="4" ratones="" por="" grupo).="" los="" datos="" son="" representativos="" de="" al="" menos="" 2="" experimentos.="">Imágenes representativas, así como cuantificación de F4/80, CD11c y CD8 IHC de tumores recolectados 6 días después de cada tratamiento indicado. Las barras de escala son de 50 μm. (ai) Los datos se informan como media y SEM; *PAGS<0.05,><0.01,><0.001,><>

Los T785-ISAC dirigidos a tumores provocan la regresión tumoral en el modelo de tumor MMC singénico
Para evaluar la capacidad de los ISAC para mediar en la eficacia antitumoral en presencia de células B, T y NK, utilizamos una línea celular de carcinoma mamario de ratón (MMC) que expresa HER2 de rata singénica (rHER2) que se derivó de un tumor mamario espontáneo. carcinoma en ratones FVB que expresan rHER2-.Para minimizar la inmunogenicidad entre especies asociada con la expresión de rHER2 en MMC, los ratones transgénicos que expresan endógenamente Her2 de rata bajo el controldel promotor MMTV se utilizaron como huésped (Figura 15 complementaria) 47. Aprovechando la presencia de un sistema inmunitario completamente intacto, nuestro objetivo fue evaluar la capacidad del ISAC para combatir tumores con una gran carga tumoral de 500 mm3, ya que los tumores más grandes generalmente son más difícil de tratar en modelos preclínicos 48. La administración sistémica de todos los tratamientos, incluido el rHER2 T785-ISAC, fue bien tolerado, con un impacto mínimo en el peso corporal (Figura 16A complementaria). Sin embargo, solo el rHER2 T785-ISAC pudo curar ratones que tenían tumores grandes establecidos (Figura 5A). Como se vio en el modelo de xenoinjerto, los estudios de agotamiento celular mostraron que se perdía una actividad antitumoral significativa cuando las células fagocíticas se agotaban con liposomas cargados con clodronato (Figura 5B). Si bien no se espera que ISAC actúe directamente sobre las células T, los ratones pretratados con un anticuerpo que agota CD8-perdieron la capacidad de eliminar tumores después de dos administraciones de rHER2 T785-ISAC (Figura 5C). Esto sugiere que los ISAC dirigidos al tumor pueden actuar indirectamente a través de las células T, luego de la presentación de antígenos asociados al tumor. De acuerdo con la presencia de memoria inmunológica, los ratonescurados de tumores MMC después del tratamiento con rHER2 T785-ISAC estaban protegidos contra la reexposición al tumor (Figura 5D).

Para investigar más a fondo el mecanismo subyacente a la eficacia de ISAC en el modelo singénico, a continuación investigamos los cambios celulares, transcripcionales y de citoquinas en el microambiente tumoral después de la dosificación de ISAC. Se trataron dos cohortes de ratones con tumores MMC grandes con rHER2 T785-ISAC o controles. Los tumores de la primera cohorte se recolectaron 24 horas después de la dosificación (Día 1) cuando todos los tumores tenían un tamaño similar (Figura 16B complementaria). A la otra cohorte se le administró una segunda dosis 5 días después de la primera, luego se recolectó 24 horas más tarde (Día 6), momento en el que los tumores en todos los grupos de tratamiento habían crecido de manera apreciable excepto aquellos tratados con T785-ISAC (Figura 16B complementaria ). Los tumores se analizaron mediante IHC, expresión de ARNm y secreción de citocinas en lisados ​​de proteínas. Para respaldar aún más nuestras observaciones en los modelos de xenoinjerto de que se requiere la orientación del tumor para la actividad ISAC, el análisis de ARNm de los tumores 24 horas después del tratamiento con rHER2 T785-ISAC mostró una regulación positiva espectacular del 34,1 por ciento de los genes en el ratón NanoString inmune al cáncer. panel de perfiles en comparación con tumores tratados con isotipo. El anticuerpo anti-rHER2 solo tuvo solo un ligero impacto en la expresión génica (3,5 por ciento de los genes analizados), mientras que el isotipo no dirigido T785-ISAC no afectó la expresión génica (Figura 5E). Como se vio en el modelo de xenoinjerto HCC1954, los genes asociados con la activación y señalización mediada por TLR7-fueron significativamente regulados al alza por el rHER2 T785-ISAC dirigido al tumor, indicativo de una respuesta mediada por TLR sólida (Figura 5E). El análisis de la vía de expresión génica reveló nuevamente una regulación positiva significativa de las firmas genéticas clave relacionadas con el sistema inmunitario, incluidas las firmas para el análisis de la vía de expresión génica, reveló una regulación positiva significativa de las firmas genéticas clave relacionadas con el sistema inmunológico después del tratamiento con rHER2 T785-ISAC, incluidas las asociadas con las quimiocinas y citoquinas (Figura 5F). La cuantificación de proteínas se realizó en los mismos tumores analizados por NanoString y, de acuerdo con los hallazgos de la firma genética, se midieron niveles significativamente mayores de citocinas y quimiocinas proinflamatorias 24 horas después del tratamiento con rHER2 T785-ISAC (Figura 17 complementaria ). Las puntuaciones de las firmas genéticas también fueron significativamente elevadas para el procesamiento y presentación de antígenos, la función de células dendríticas y la función de macrófagos, lo que respalda aún más la respuesta mediada por anFc-Fc R e impulsada por la fagocitosis 24 horas después de rHER2 T785-ISACtratamiento (Figura 5F y Figura Suplementaria 18). Además de puntajes de firmas genéticas significativamente elevados asociados con una respuesta mediada por TLR y Fc R sólida, el puntaje de firmas genéticas para las funciones de las células T también aumentó significativamente dentro de las 24 horas del tratamiento con rHER2 T785-ISAC, lo que respalda aún más la encontrando que las células T son necesarias para la eficacia mediada por ISAC (Figura 5F y Figura 18 complementaria).

Para caracterizar las células inmunes que pueden contribuir al aumento temprano en la producción de citocinas y quimiocinas proinflamatorias, los tumores se analizaron mediante citometría de flujo 24 horas después de la primera dosis de rHER2 T785-ISAC o los controles, y 6 días después del inicio de la tratamiento, 24 horas después de una segunda dosis. El análisis de los tumores el día 1 reveló infiltración de CD11b más Ly6C más monocitos en los tumores tratados con rHER2 T785-ISAC, y CD11b más Ly6G más granulocitos en los tumores tratados con rHER2 mAb o rHER2 T785-ISAC , pero no el isotipo ISAC o los controles de isotipo de anticuerpos (Figura 5G). Los niveles de monocitos aumentaron aún más en los tumores tratados con rHER2 T785-ISAC después de 6 días. De manera similar a lo que observamos en el modelo de xenoinjerto HCC1954, las APC mieloides (CD11b más CD11c más F4/80 plus) se elevaron significativamente el día 6 después del tratamiento con rHER2 T785-ISAC en comparación con los controles (Figura 5G y Figura 19 complementaria ). Además, se encontró que las APC mieloides se activaron específicamente en el grupo tratado con rHER2 T785- ISAC en ambos puntos de tiempo, según lo medido por la regulación al alza de CD40 en la superficie celular (Figura 5H). Es importante destacar que no se midió un aumento en las APC mieloides tumorales después del agotamiento de los fagocitos usando liposomas cargados con clodronato (Figura 20 complementaria). Finalmente, se realizó IHC para evaluar la presencia y ubicación de poblaciones de células inmunitarias clave en el modelo MMC después del tratamiento con rHER2 T785-ISAC. Como se observó en el modelo de xenoinjerto HCC1954, el tratamiento con rHER2 T785-ISAC resultó en un aumento dramático en las células CD11c plus y F4/80 plus en la región peritumoral que no se observó después del tratamiento con el anticuerpo rHER2 o el tratamiento con el isotipo o isotipo T785-ISAC (Figura 5I). De acuerdo con la expresión temprana de las quimiocinas de las células T y el aumento de la puntuación de la firma genética para la función de las células T, la IHC observó una infiltración significativa de células CD8 plus en los tumores de los ratones tratados con rHER2 T785-ISAC el día 6, mientras que La tinción de CD8 en ratones tratados con anticuerpos anti-rHER2 o controles de isotipo permaneció baja (Figura 5I). El aumento de la tinción de CD8 más IHC, junto con la expresión génica amplificada de los genes asociados a la función de las células T y la eliminación del tumor dependiente de CD8-, respaldan el potencial del T785-ISAC para convertir un tumor frío en caliente.CL{ {58}}Los ISAC provocan la regresión del tumor en HER2-modelo tumoral de xenoinjerto de expresión media comparable al trastuzumab T785-ISAC (Figura 6A y Figura complementaria 21). La capacidad de los ISAC de trastuzumab producidos con CL264 o T785 para mediar en la activación mieloide intratumoral se evaluó en el modelo de xenoinjerto HCC1954 24 horas después de una administración única de trastuzumab, trastuzumab CL264-ISAC o trastuzumab T785-ISAC . Se observó una activación mieloide mejorada con trastuzumab CL264-ISAC como lo demuestra el aumento de la expresión de CD40 en CD11b más CD11c más F4/80 más mieloide que infiltran el tumor en comparación con trastuzumab o trastuzumab T785-ISAC (Figura 6B ).Para determinar si la mayor capacidad de activación mieloide del CL264-ISAC se traducía en una mayor actividad antitumoral in vivo, se comparó el trastuzumab CL264-ISAC con elT785-ISAC en los modelos tumorales HER2High HCC1954 y HER2Med JIMT-1. Mientras tantoLos ISAC de trastuzumab mediaron la regresión tumoral completa en el modelo HCC1954 HER2High, el CL264-ISAC demostró una mayor actividad antitumoral en el modelo JIMT-1 HER2Med, lo que sugiere que la potencia de ISAC y la capacidad de dirigirse a tumores de menor densidad de antígenos pueden vincularse (Figura 6C-D).

Ambos ISAC fueron bien tolerados, pero observamos una pérdida de peso corporal transitoria de 5-10 por ciento en animales tratados con trastuzumab CL264-ISAC o rituximab CL264-ISAC, con una recuperación del peso corporal a o por encima del valor inicial en la tercera dosis (Figura 16A complementaria). La secreción sistémica de citocinas se midió después del tratamiento con T785-ISAC o CL264-ISAC. Se midieron niveles bajos de TNF en el suero de los animales cuatro horas después de la administración del T785-ISAC, mientras que tanto el CL264-ISAC dirigido como el isotipo provocaron niveles más altos de secreción sistémica de TNF (Figura 11 complementaria) . Es poco probable que estos efectos entre los ISAC T785 y CL264 se deban a un impacto directo del ISAC en el crecimiento de células tumorales, ya que el ISAC no inhibió la proliferación de células cancerosas in vitro (Figura 9 complementaria).

Los CL264-ISAC provocan la eliminación del tumor y la memoria inmunológica en modelos de tumores singénicos Dado el aumento de la potencia y la eficacia observados con el CL264-ISAC en modelos de xenoinjertos de tumores humanos con una densidad de antígeno HER2 variada, a continuación caracterizamos la actividad de CL 264-ISAC en modelos de tumores singénicos. Similar al T785-ISAC en el modelo MMC, el CL264-ISAC condujo a la regresión y eliminación del tumor de una manera dependiente de las células T, lo que condujo a una memoria inmunológica duradera (Figura 22A complementaria). Para evaluar la eficacia de ISAC en un modelo de tumor singénico con expresión de antígeno reducida, desarrollamos una línea celular CT26 que expresa de forma estable HER2 de rata (CT26-rHER2). Es importante destacar que alrededor del 8,5 por ciento de las células CT26 no expresan rHER2 después de la implantación del tumor (Figura 6E). Los ratones Balb/c de tipo salvaje tratados con rHER2 CL264-ISAC mostraron una inmunidad antitumoral sustancial en el sentido de que el 75 por ciento (6 de 8) de los ratones eliminaron sus tumores y permanecieron libres de tumores durante la duración del experimento. mientras que ninguno de los ratones tratados con el anticuerpo anti-rHER2 tuvo una regresión completa (Figura 6F). Se observó una pérdida de peso transitoria de alrededor del 10 por ciento del peso corporal después del tratamiento con rHER2 CL264-ISAC, y el peso corporal se recuperó ocho días después del inicio del estudio (Figura 22B complementaria). Evaluamos si la memoria inmunológica mediada por rHER2 CL264-ISAC contra un tumor que carece de expresión del antígeno objetivo, rHER2, desafiando ratones previamente curados de tumores CT26-rHER2 con la línea celular parental CT26 que carecía de rHER2 expresión. Los ratones previamente curados de tumores CT26-rHER2 con rHER2 ISAC estaban totalmente protegidos de la exposición a la línea celular parental CT26 (Figura 6I). El agotamiento de las células T CD4 y CD8 antes de la nueva exposición al tumor mostró que las células T son necesarias para la protección. Finalmente, probamos si la memoria inmunológica desarrollada en ratones previamente curados con el ISAC era específica para los antígenos asociados al tumor del tumor primario tratado. Durante la nueva exposición al tumor CT26 parental, los ratones fueron expuestos simultáneamente a un tumor diferente, 4T1, implantado en el flanco contralateral. Los datos muestran que el desarrollo de la memoria inmunológica fueespecífico para los antígenos asociados a tumores CT26 distintos de rHER2, ya que el crecimiento tumoral de los tumores 4T1 no se vio afectado (Figura 6G).