Factores inmunomoduladores en Cistanche Salsa

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Shinjiro MARUYAMA, Koji YAMADA, Hirofumi TACHIBANA

Salsa Cistanche(CAMever) G.Beck, Orobanchaceae es una planta parásita que se utiliza como tónico medicinal oriental en Japón. En nuestro estudio anterior, encontramos que el extracto de C, salsa mejoró la producción de IgM e IgG en los linfocitos del nódulo Ivmph humano. Además, el dializado de salsa C (CSD) preparado con una membrana de diálisis con un peso molecular de corte a3.500-Da mejoró la producción de IgM en la línea de células B humanas BALL-1; además, indujo una ligera proliferación celular. Sin embargo, por el contrario, la CSD indujo la inhibición del crecimiento acompañada de apoptosis en la línea celular de linfoma de Burkitt humano Namalwa. Estos resultados indican la posible presencia de componentes activos en CSD que son específicos de los linfocitos. Hasta el momento, las propiedades químicas de estos componentes no han sido dilucidadas. En este estudio, investigamos las propiedades químicas de los componentes activos en CSD. Ambas actividades mencionadas anteriormente en líneas de células B no fueron inactivadas por tratamiento en autoclave de CSD. Usando cromatografía en columna de filtración en gel, encontramos que los picos de las fracciones activas se concentraron en diferentes fracciones. Nuestros resultados sugieren que hay al menos 2 tipos de componentes activos en CSD, y pueden ser polisacáridos ya que son componentes solubles en agua de alto peso molecular y termoestables.

Palabras clave: Salsa Cistanche, alto peso molecular, IgM, inhibición del crecimiento.

Introducción

Salsa Cistanche(CA Meyer) G.Beck, Orobanchaceae es una planta parásita que se usa como tónico medicinal oriental en Japón. En China, esta planta es una importante medicina tradicional utilizada para el tratamiento de la insuficiencia renal y la neurastenia. A través de estudios in vitro, ya hemos reportado los efectos de C. salsa en el sistema inmunológico. Primero. demostramos que el extracto de C. salsa mejoró la producción de IgM e IgG en los linfocitos de los ganglios linfáticos humanos. En segundo lugar, demostramos que el dializado de C. salsa (CSD) preparado con una membrana de diálisis de corte de peso molecular de 3,500-Da mejoró la producción de IgM en la línea de células B humanas BALL-1; además, indujo la proliferación celular en una pequeña medida. 2 Además, la CSD tiene un efecto opuesto por el cual induce la inhibición del crecimiento acompañada de apoptosis en la línea celular del linfoma de Burkitt humano, Namalwa. 3) Estos hallazgos sugirieron que este efecto de la CSD estaba relacionado con la activación de las células B, mientras que la apoptosis resultó de la falta de otras señales que se requieren para la diferenciación de las células B, como las citocinas y el contacto célula-célula; sin embargo, las propiedades químicas de la CSD no se dilucidaron en ninguno de los estudios anteriores. Por lo tanto, en este estudio, investigamos las propiedades químicas de los componentes activos en CSD.

Materiales y métodos

CSD fue preparado por el mismo método en nuestro estudio anterior. CSD se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 20 mg/ml. La solución preparada (0.8 ml) se pasó a través de un filtro (0.22 um) antes de la aplicación y luego se eluyó con la misma solución a través de columnas que contenían TOYOPEARL HW-40F (1.0×96,5 cm; Tosoh Corp., Japón),TOYOPEARL HW-55F(1.0 × 98.0 cm; Tosoh Corp., Japón) , y Sephacryl S-400HR(1.0x98,0 cm; GE Healthcare UK Ltd., Inglaterra); y luego se recogieron fracciones de 1 ml (30 gotas). Para determinar el volumen vacío de los geles y el peso molecular aproximado (MW) de los constituyentes fraccionados, dextrano azul (BD) (Sigma-Aldrich Japón KK, Japón); y dextranos de PM conocido obtenidos de Leuconostoc spp. (Sigma-Aldrich Japan KK, Japón), es decir, de PM2,000kDa(D1),500kDa(D2),70kDa (D3) y 6kDa (D4); y cianocobalamina (VB12, PM: 1355,4) (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japón). Los contenidos totales de azúcar y proteína de cada fracción se determinaron utilizando el método de ácido fenol-sulfúrico y el método de Lowry con el kit de ensayo de proteínas de ácidos bicinconínicos (BCA) PIERCETM (Thermo Fisher Scientific Inc., EE. UU.), respectivamente. Se usaron glucosa y albúmina de suero bovino como estándares respectivos. Además, se midió la absorbancia a 320 nm (A:2o) de cada fracción. Los picos de elución de azul dextrano y cianocobalamina se determinaron por su valor de absorbancia a 260 nm, y los picos de dextranos de PM conocido se determinaron utilizando el método de ácido fenol-sulfúrico. La CSD se autoclavó a 120 grados durante 20 minutos para evaluar su termoestabilidad. En los bioensayos, el cultivo celular y la medición de IgM se realizaron por el mismo método en nuestro estudio anterior.

Extracto de salsa cistanche

Resultados y discusión

La Figura 1 muestra los cromatogramas de columna de filtración en gel de CSD en HW-40F. A partir de la Figura la, se estimó que el PM de los constituyentes activos era superior a 6 kDa en base al marcador de dextrano D4. Además, ambas actividades de la CSD, es decir, aumentar la producción de IgM e inducir la inhibición del crecimiento, no fueron inactivadas por el tratamiento en autoclave (Figura 2), aunque algunos constituyentes se agregaron y se perdieron después de que la CSD pasara a través del 0.{{6} }um filtro. Los patrones de elución de la CSD y la CSD esterilizada en autoclave fueron casi idénticos, sin embargo, la actividad relativa de aumento de la producción de IgM en la CSD esterilizada en autoclave fue menor que la CSD no tratada. Algunas de las razones parecen ser que los agregados contenían los constituyentes activos o que algunos de los constituyentes activos estaban inactivados. Los resultados de la cromatografía en HW-55F mostraron la posible presencia de 2 tipos de factores inmunomoduladores: el primero, concentrado en fr. nº32. era un componente activo de alto peso molecular (HCS) que podría mejorar la producción de IgM, mientras que el segundo, concentrado en fr. n.º 50, era un componente activo de peso molecular medio (MCS) que podía inhibir la proliferación celular (Figura 3). Sin embargo, los picos obtenidos tanto para HCS como para MCS (fr.no.32 y 50 respectivamente) no fueron tan nítidos como los de los dextranos de PM conocido (datos no mostrados). Estas observaciones indican la posibilidad de que existan subproductos generados artificialmente durante la preparación de CSD, polímeros de principios activos que se destruyen fácilmente y comprenden múltiples unidades, o varios principios activos que tienen diferentes PM originales. Los patrones de elución en los cromatogramas muestran que no es fácil obtener constituyentes puros de HCS y MCS, ya que parece haber varios constituyentes que tienen PM ligeramente diferentes, como se mencionó anteriormente. Aunque ambos son mezclas de componentes activos, parece que HCS comprende componentes de PM superior a 70 kDa, mientras que MCS comprende aquellos de PM superior a 6 kDa. HCS se eluyó en HW-55F en una fracción que estaba más allá del rango de separación. En Sephacryl-S400, se eluyó una parte de HCS (fr.no.36) en la misma fracción que el marcador D1, que es de PM 2,000 kDa (Figura 4). En general, los polisacáridos y las proteínas se tienen en cuenta como componentes de alto peso molecular solubles en agua en los extractos de plantas. Dado que casi todas las proteínas funcionales se inactivan con el tratamiento térmico, parecen ser polisacáridos. Sin embargo, Park et. Alabama. han informado sobre la pequeña proteína citotóxica termoestable llamada viscotoxina, que se prepara a partir del extracto de muérdago (Viscum album L., Viscaceae).4 Además, se ha demostrado que las viscotoxinas mejoran la actividad inmunomoduladora de las células asesinas naturales humanas. tiene un PM más bajo, muestra un mayor contenido de proteína. Teniendo en cuenta estos hechos, el MCS puede ser un polisacárido ligado a proteínas8 o puede ser una proteína termoestable como las viscotoxinas. Estos resultados muestran que los 2 constituyentes activos pueden ser polisacáridos. De lo contrario, los MCS podrían ser proteínas termoestables.

Referencias

1) Deng, M., Zhao, JY, Ju, XD, Tu, PF, Jiang, Y., Li, ZB: Efecto protector del tubulosido B en la apoptosis inducida por TNF alfa en células neuronales. Acta Pharmacol. Sin., 25, 1276-1284, 2004.

2) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H.:Extracto de salsa cistancheproducción mejorada de IgM en la línea de células B humanas, BALL-1.J. Trad. Med., 24,209-211, 2007.

3) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H:Salsa Cistancheextraer la apoptosis inducida en la línea celular de linfoma de Burkitt humano Namalwa. J.Trad. Med., 25,24-27, 2008.

4) Parque. JH,Hyun, CK,Shin HK: Efectos citotóxicos de los componentes del muérdago tratado térmicamente (Viscum album).Cancer Let, 139, 207-213,1999.

5) Tabasco, J., Pont, F, Fournic, JJ, Vercellone, A.: Las viscotoxinas del muérdago aumentan la citotoxicidad mediada por células asesinas naturales. Eur.J. Bioquímica, 269,2591-2600, 2002.

6) Fisher, M., Yang, LX: Efectos y mecanismos anticancerígenos del polisacárido-K (PSK): implicaciones de la inmunoterapia contra el cáncer. Anticancer Res.,22,1737-1754,2002.

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