Parte Ⅱ: Aislamiento guiado por desreplicación de nuevos diglucósidos sustituidos con fenilpropanoide de la salsa de cistanche y su actividad inhibitoria sobre la producción de NO en macrófagos
Mar 04, 2022
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Las correlaciones COSY de H-2 con H-1a y H-1b y las correlaciones HMBC entre H{{ 4}} y H-5 y los carbonos olefinicos, a kC 120,7 (C-2) y 136,4 (C-3). Se establecieron dos fracciones de azúcar mediante el análisis de espectros de RMN y el análisis de espectros de HPLC del hidrolizado ácido, con patrón de fragmentos de MS. Se determinó que la configuración absoluta de ellos era D-glucosa y L-ramnosa usando análisis HPLC del hidrolizado ácido [17]. Estos restos de azúcar se definieron como a-glucosa y a-ramnosa mediante constantes de acoplamiento de los protones anoméricos. El espectro 1H-1H COSY mostró correlaciones secuenciales de H-13 a H-63 y de H-133 a H-633 (Figura 4).
Un protón de glucosa desplazado hacia abajo a kH 4,70 (H-43) sugirió un sustituyente acilo en la glucosa. Del espectro HMBC, la correlación entre H-43 y C-9333 confirmó la posición del sustituyente cafeoílo. Las correlaciones HMBC entre H-13 y C-1 (kC 64.5) y entre H-33 (kH 3.68) y C-133 (kC 101.2) sugirieron las posiciones de cada sustituyente . En consecuencia, la estructura de 6 se determinó como 3-metilbutenil-O- -L-ramnopiranosil-(1→3)-4-O-(E)-cafeoil- -D- glucosa-piranósido y se denominó cistansalside B.
Cistansalside C (12), un polvo amorfo marrón, se determinó que tenía una fórmula molecular de C26H38O13 por ( más )-HR-ESI-QTOF-MS, que mostró un pico en m/z 581,2213 [M más Na] más (calcd para C26H38O13Na, 581.2205). Un ion característico am/z 163 sugirió que existía un sustituyente cafeoílo en la estructura. Los iones del fragmento en m/z 325 ym/z 471 sugirieron la existencia de una unidad de ramnosa y una unidad de glucosa.
La comparación de los espectros de RMN de 12 con los de 6 mostró que eran similares excepto por la estructura de aglicona. En los espectros de RMN de 12, se observaron dos carbonos parafínicos en kC 38.0 (C-2) y 24,4 (C-3) en lugar de dos carbonos olefínicos en kC 12{{16 }}.7 (C-2) y 136.4 (C-3) en la aglicona de 6. Los grupos metilo germinales (kH 0.88) en la aglicona de 12 se desplazaron campo arriba relativo a H-4 y H-5 (kH 1.71 y 1.63) en la aglicona de 6 (Tabla 2). Se sugirió que la aglicona de 12 era un grupo 3-metilbutilo, lo que fue confirmado por los espectros 1H y COSY NMR. Se observaron picos del grupo butilo 3-metilo a 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) y 0,88 (H-4, 5).
Se reafirmaron dos fracciones de azúcar mediante el análisis de HPLC del hidrolizado ácido y el análisis de espectros de RMN, así como el patrón de fragmentos de MS. Las configuraciones absolutas de los azúcares se identificaron como D-glucosa y L-ramnosa usando análisis HPLC del hidrolizado ácido [17]. El resto A-glucosa y el resto a-ramnosa se confirmaron mediante constantes de acoplamiento de los protones anoméricos. El espectro 1H-1H COSY mostró correlaciones secuenciales de H-13 a H-53, de H-133 a H-333, y de H{{11} } a H-433 (Figura 4).
La posición de los sustituyentes se confirmó mediante el análisis HMBC. En el espectro HMBC, las correlaciones entre H-13 y C-1 (kC 67,2), entre H-33 (kH 3,68) y C-133 (kC 101,2) y entre Se detectaron H-43 (kH 4,70) y C-9333 (kC 165,7). En consecuencia, se estableció que la estructura de 12 es 3-metilbutil-OaL-ramnopiranosil-(1→3)-4-O-(E)-cafeoil- -D-glucosa-piranósido y llamado cistansalside C.
Se determinó que Cistansalside D (17), un polvo marrón amorfo, tiene una fórmula molecular de C31H38O14 mediante ESI-QTOF-MS de alta resolución en modo positivo, que mostró un pico de iones de aducción en m/z 657,2147 [M más Na] más (calculado para C31H38O14Na, 657,2154). Fragmento de iones que incluyen un [M más H x Aglicona x Rha x Acetil Glc] más ion en m/z 147, un [M más H x Aglicona x Rha] más ion en m/z 351 y un [M más H x Aglicona] También se detectaron iones positivos am/z 497. Un ion característico am/z 147 sugirió que un sustituyente cumaroílo estaba presente en su estructura. Los iones del fragmento en m/z 351 ym/z 497 sugirieron la existencia de una unidad de ramnosa y una unidad de glucosa sustituida con acetilo.
Cistansal aparte dehierba cistanche
El espectro 13C-NMR reveló la presencia de 31 átomos de carbono. Se observaron dos protones anoméricos a kH 4,61 (1H, m, H-13) y 4,60 (1H, s, H{{10}}) en los espectros 1H y HSQC . El espectro de 1H-RMN indicó la presencia de un grupo metilo a 1,97 (3H, s, acetil-CH3), una trans-olefina a kH 7,55 (1H, d, J=15,9 Hz, H{{ 25}}) y 6,34 (1H, d, J=15,9 Hz, H-8333) y dos anillos de benceno sustituidos en para a kH 7,53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) y 6,79 (2H, d, J=6.9 Hz, H-2333, 6333)/ kH 6,98 (2H, d, J {{5 0}}.0 Hz, H-2, 6) y 6.65 (2H, d, J=8.0 Hz, H-3, 5) (Tabla 2) . A partir del espectro de RMN de HMBC, las correlaciones entre un carbono carbonilo en kc 165,5 (C-9333) y H-8333 y entre H-2333, 6333 y C-7333 (kc 145.4) sugirió un grupo (E)-cumaroilo. La correlación HMBC entre un pico de protón metilo y un carbono carbonilo en kc 169.0 confirmó la presencia de un grupo acetilo.
Se sugirió un grupo 4-hidroxifenilo basado en las correlaciones HMBC entre H-3, 5 y carbonos aromáticos cuaternarios en kC 155,6 (C-4) y 128,6 (C-1) . Un grupo etilo hidroxilado fue confirmado por las señales COSY NMR en kH 2.66 (2H, t, J=6.1 Hz, H-7), 3.90 (1H, m, H-8a ) y 3,54 (1H, m, H-8b). Las correlaciones de HMBC entre H-7 y C-1 (kC 128.6) y C-2, 6 (kC 129.7) sugirieron un grupo 4-hidroxifeniletilo, como una subestructura de aglicona.
Dos restos de azúcar, sugeridos por el patrón de fragmentos de MS, se volvieron a confirmar mediante el análisis de HPLC del hidrolizado ácido y los espectros de RMN. La D-glucosa y la L-ramnosa se elucidaron mediante análisis por HPLC del hidrolizado ácido [17]. Se establecieron un resto A-glucosa y un resto a-ramnosa mediante constantes de acoplamiento de los protones anoméricos. El espectro 1H-1H COSY mostró correlaciones secuenciales de H-13 a H-53 y de H-133 a H-633 (Figura 4).
A partir del espectro de 1H-NMR, el cambio de campo descendente de H-23 (kH 4,69) y H-43 (kH 4,80) sugirió la posición sustituida con acilo en la glucosa. Las conexiones entre la glucosa y dos grupos acilo fueron confirmadas por las correlaciones HMBC entre H-43 (kH 4.80) y C-9333 y entre H-23 y el carbono carbonilo de un grupo acetilo (kC 169.0 ). Las posiciones de una aglicona y ramnosa fueron dadas por las correlaciones HMBC entre H-33 (kH 3.95) y C-1333 y entre H-8 y C-13. En consecuencia, la estructura de 17 se asignó como 4-hidroxifeniletilo-2-O-acetil-O- -L-ramnopiranosil-(1→3)-4-O-(E)- cumaroil- -D-glucopiranósido y se denominó cistansalside D.
Cistansalside E (18) se aisló como un polvo marrón amorfo. Se determinó que su fórmula molecular era C31H38O14 mediante datos de 13C-NMR y el pico ESI-QTOF-MS de alta resolución en modo positivo en m/z 657,2166 [M más Na] más (calculado para C31H38O14Na, 657,2154). Además, también se detectaron iones de fragmento que incluyen un ion cafeoílo en m/z 163, un ion [M más H x Aglicona x Rha] más en m/z 367 y un ión [M más H x Aglicona] en m/z 513. Los iones del fragmento sugirieron la existencia de una unidad de ramnosa y una unidad de glucosa sustituida con acetilo.
El espectro de 1H-RMN sugirió la presencia de dos protones anoméricos a kH 4,63 (1H, d, J=8,2 Hz, H-13) y 4,60 (1H, s, H-133 ) y dos protones de glucosa sustituidos con acilo a kH 4,71 (1H, dd, J=8,9, 8,2 Hz, H-23) y 4,81 (1H, dd, J=9,7 , 9,5 Hz, H-43). Los espectros de 1H y HMBC sugirieron la existencia de un grupo acetilo a kH 1,94 (3H, s, acetil-CH3), un resto (E)-cafeoilo a kH 7,48 (1H, d, J=15,9 Hz, H-7333), 7,02 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2333), 6,98 (1H, dd, J=8,1, 1,6 Hz, H-6333), 6,76 (1H,d, J=8,1 Hz, H-5333) y 6,21 (1H, d, J=15,9 Hz, H{ {67}}) y un anillo de benceno monosustituido en kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) y 7,20 (1H, m, H-4) (Tabla 2). Las correlaciones de HMBC entre H-7 (2H, kH 2,80, m) y C-1 (kC 138,8) y entre H-7 y C sugirieron un grupo fenilmetilo, una subestructura de aglicona. -2, 6 (kC 128,9) y las señales COSY NMR de H-7 con H-8a (1H, kH 3,99, m) y H-8b (1H, kH 3,63, m).
Se reafirmaron dos fracciones de azúcar mediante el análisis de HPLC del hidrolizado ácido y el análisis de espectros de RMN. Las configuraciones absolutas de los azúcares se dilucidaron mediante análisis HPLC del hidrolizado ácido, que se confirmó que eran D-glucosa y L-ramnosa [17]. Se establecieron un resto de -glucosa y un resto de -ramnosa mediante constantes de acoplamiento de los protones anoméricos. El espectro 1H-1H COSY mostró correlaciones secuenciales de H-13 a H-53, de H-133 a H-233, y de H{{11} } a H-333 (Figura 4).
Del espectro HMBC, las correlaciones entre H{{0}} y C-8 (kC 69,4), entre H-23 y el carbono carbonílico de un grupo acetilo (kC 169,1), entre H-33 (kH 3.95) y C-133 (kC 102.0) y entre H-43 (kH 4.81) y C-9333 (kC 165.6) confirmaron la posición de los sustituyentes en la estructura. Por lo tanto, se determinó que la estructura de 18 era feniletil-2-O-acetil-OaL-ramnopiranosil-(1→3)-4-O-(E)-cafeoil- -D-glucopiranósido y llamado cistansalside E.
La mayoría de los sustituyentes trans-cinamoílo se isomerizaron a la isoforma cis in vitro. Se ha informado que la luz convierte los derivados del ácido trans-cinámico en isoformas cis [18,19]. Se observó que el equilibrio de la conversión trans-cis de los sustituyentes cinamoílo mantenía aproximadamente el 70 por ciento de los aislados en la isoforma trans. Para los protones de olefina de la forma cis, los picos son de aproximadamente 6,90 ppm(d, J=12~13 Hz, H-7333) y 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) eran asignables en los espectros de 1H-RMN, mientras que los picos eran de aproximadamente 7,55 ppm (d, J=15,8 Hz, H-7333) y 6,40 ppm (d, J { {28}}.8 Hz, H-8333) se observaron para la transformada [20]. En el espectro de 1H-NMR de mezclas trans-cis, se observaron picos para dos protones olefinicos (H-7333 y H-8333) en una proporción de 7:3 (trans:cis). Los picos de 13C-NMR de la forma cis fueron similares a los de la transformada.
Ingredientes efectivos de la cistanche: acteosidos
Todos los aislados fueron probados por sus efectos inhibitorios sobre la producción de NO inducida por LPS en RAW
Todos los aislados se analizaron para determinar sus efectos inhibidores sobre la producción de NO inducida por LPS en células RAW 264.7. Se utilizó dexametasona como control positivo y su IC50 fue de 7,0 uM. De los compuestos probados, compuestos 5 (IC50 42.7 o 6.6 uM), 11 (IC50 37.3 o 2.2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) y 18(IC50 27.9 o 0.8 uM) mostraron actividades inhibidoras moderadas sobre la NO sintasa inducible, mientras que los otros compuestos fueron inactivos en este ensayo (IC50 valores > 100 uM). Para verificar si estos compuestos tenían citotoxicidad, se midió la viabilidad celular empleando el ensayo MTT. Como resultado, ninguno de ellos mostró una citotoxicidad significativa (Figura Suplementaria S6-1). Estos cuatro compuestos se seleccionaron para evaluar su actividad inhibidora frente a la vía NF-λB en células RAW 264.7 estimuladas con LPS. La estimulación de células RAW 264.7 con LPS indujo la fosforilación de I入B y NF-入B (p65) después de 0,5 h de incubación. La fosforilación de NF- 入 B (p65) se redujo significativamente mediante el pretratamiento con los compuestos 11, 13 y 18 como se muestra por análisis de transferencia Western (Figura 5). Por lo tanto, los compuestos 11, 13 y 18 podrían ejercer efectos antiinflamatorios a través de la inhibición de NF-入B en macrófagos.
Figura 5.Efecto de cuatro compuestos sobre la fosforilación de I入B y NF-入B (p65) en células RAW 264.7 estimuladas con LPS. (A) Las transferencias Western se realizaron en LPS y células RAW 264.7 tratadas con muestra; (B, C) Las señales de inmunotransferencia se cuantificaron utilizando el software de densitometría Molecular Analyst/PC (Bio-Rad, Richmond, CA, EE. UU.). Se informa el análisis densitométrico de las isoformas fosforiladas. NF- 入 B en células RAW 264.7 se normalizó al contenido de -actina.
3. Materiales y Métodos
3.1. Experimento General Procedimiento
Las rotaciones ópticas se midieron con un polarímetro digital Jasco P-2000 (Jasco, Tokio, Japón). Los espectros UV se registraron en un espectrómetro Chirascan plus Circular Dichroism (Chirascan, APL, Reino Unido). Los espectros IR se registraron utilizando el espectrofotómetro Jasco FT/IR-4200. La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo de ionización por electrospray de alta resolución (HR-ESI-qTOF-MS) se realizó en un LC/MS Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF equipado con la serie Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, EE. UU.), y la columna utilizada fue una columna Jasco SFCpak Crest C18T-5 (di 150 4,6 mm, 5 um). Se utilizó el software MassHunter Workstation para la adquisición de datos.
Los espectros de RMN 1D (1H y 13C) y 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) se obtuvieron con un Jeol LA 300 (Jeol, Tokio, Japón), Bruker AVANCE-400, Bruker Espectrómetros AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 y Bruker AVANCE 800 HD acoplados a una criosonda (Bruker, Ettlingen, Alemania). Se usó DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, en Cistanche Andover, MA, EE. UU.) como disolvente de RMN y picos de referencia (kH 2,50 y kC 39,5). La cromatografía en columna (CC) se realizó con Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Suecia) o gel de sílice Kieselgel 60 (40–63 um, malla 230–400, Art. 9385; Merck, Darmstadt , Alemania). La cromatografía en capa fina (TLC) se llevó a cabo en placas de gel de sílice F254 Kieselgel 60 previamente recubiertas (Art. 5715; Merck). Las manchas en TLC se detectaron utilizando una lámpara UV a 254 nm y 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Francia). La cromatografía líquida de presión media (MPLC) se realizó en una columna flash de sílice RediSep de 120 g (Isco, Lincoln, NE, EE. UU.) y gel de sílice Kiesegel 60 (40–63 um, malla 230–400, Art. 9385; Merck) Acompañante Combiflash (Isco). El sistema de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) fue un Gilson HPLC equipado con bomba Gilson 321 y detector UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, EE. UU.), utilizando columnas ODS semipreparativas (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, EE. UU. Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Alemania; Inno C18 columna 120 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Corea). El sistema analítico RP-HPLC fue un sistema de alianza Waters 2695 con un detector 996 Photodiode Array (PDA) (Waters Corp, Milford, MA, EE. UU.), y la columna utilizada fue una columna Hypersil™ BDS C18 (130 Å, id 150: 4,6 mm, 5 um, Thermo Scientific™). El ácido fórmico se adquirió de Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seúl, Corea). Los disolventes de grado HPLC se adquirieron de Fisher Scientific Korea Ltd. (Seúl, Corea). H2SO4, Na2CO3 y solventes de primer grado para extracción, fraccionamiento y aislamiento se adquirieron de Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seúl, Corea). El clorhidrato de éster metílico de L- y D-cisteína y el o-tolilisotiocianato se adquirieron de Tokyo Chemical Industry (Tokio, Japón).
3.2. Planta Material
Las plantas enteras deSalsa Cistanche, que se recolectaron de Shinjang Uyghur, se importaron a través de Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Corea). Fueron identificados por el Prof. Dr. Jehyun Lee (Universidad de Dongguk, Seúl, Corea). El espécimen del comprobante (SNUPH2016-03) se depositó en el Herbario del Jardín de Plantas Medicinales de la Facultad de Farmacia de la Universidad Nacional de Seúl.
3.3. Extracción y Aislamiento
Las plantas enteras secas deSalsa Cistanche(5,7 kg) se trocearon y se extrajeron tres veces con MeOH (20 L) a temperatura ambiente con sonicación durante 99 min. Después de eliminar el disolvente al vacío, el extracto bruto (1,35 kg) se suspendió en H2O (5 l), luego se repartió con EtOAc (5 l). El residuo de EtOAc (55,3 g) se separó en 16 fracciones (E01-16) mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con CHCl3/MeOH (50:1–0:1, sistema de gradiente escalonado).
E08 (611,7 mg) se sometió a cromatografía líquida de presión media en gel de sílice (25 g) y se eluyó con CHCl3/MeOH (18:1–0:1, sistema de gradiente escalonado) y dio 11 fracciones (E08a-k). A partir de E08g, los compuestos 13 (0,7 mg) y 18 (0,6 mg) se purificaron usando una columna de HPLC Luna de 5 um y elución isocrática con 28 por ciento ac. MeCN. La purificación por HPLC (Hypersil GOLD, MeCN acuoso al 25 por ciento) de E08h (138,5 mg) proporcionó los compuestos 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) y 17 (4,9 mg).
E09 (1,15 g) se purificó adicionalmente en una columna de sílice-MPLC (20 g) eluyendo con CHCl3/MeOH (10:1–0:1, etapa- sistema de gradiente) para dar 11 subfracciones (E09a-k). E09e (398,7 mg) se sometió a Sephadex LH-20 (MeOH) y produjo ocho subfracciones (E09e1-8). E09e6 se purificó posteriormente utilizando una columna de HPLC Hypersil GOLD (MeCN acuoso al 22 por ciento) para proporcionar el compuesto 11 (0,4 mg). A partir de E09e7, el compuesto 5 (0,6 mg) se purificó mediante elución isocrática en una columna de HPLC Luna de 5 um con 40 por ciento ac. MeOH.
Se separó E10 (1,20 g) en nueve fracciones (E10ai) en una columna Sephadex LH-20 eluyendo con MeOH. A partir de E10g (147,5 mg), los compuestos 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) y 15 (5,0 mg) se aislaron mediante separación por HPLC (Inno, MeCN acuoso al 23 por ciento). La fracción E10h (470,0 mg) se purificó en una columna Hypersil GOLD mediante elución isocrática (MeOH acuoso al 40 por ciento) para producir los compuestos 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) y 16 (3,0 mg).
E11 (2,96 g) se sometió a Sephadex LH-20 eluyendo con MeOH para dar nueve fracciones (E11a-i). E11e se separó con un cartucho Sep-Pak C18 eluyendo paso a paso con 10 por ciento, 20 por ciento, 30 por ciento, 50 por ciento y 100 por ciento ac. MeOH para producir siete fracciones (E11e1-7), seguido de HPLC Luna 5 um (MeCN acuoso al 28 por ciento) para dar los compuestos 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) y 12 (1,2 mg).
E12 (19.0 g) se sometió a MPLC de sílice (120 g) usando un sistema de gradiente escalonado de CHCl3/MeOH para dar seis fracciones (18:1–0:1 , E12a-f). E12f se cromatografió en una columna Sephadex LH-20 (MeOH), dando siete fracciones (E12f1-7). La purificación por HPLC (Hypersil GOLD, MeCN acuoso al 25 por ciento) de E12f7 proporcionó el compuesto 2 (3,3 mg). Todos los disolventes utilizados para HPLC fueron tampón de ácido fórmico al 0,05 por ciento. La velocidad de flujo común para la cromatografía HPLC y MPLC fue de 3 y 40 ml/min, respectivamente.
3.4.Caracterización
Cistansalside A (5): polvo amorfo marrón; [|20 x33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3,18); IR (puro) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; Datos de 1H-NMR (800 MHz) y 13C-NMR (200 MHz), consulte la Tabla 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M más Na] más 645,2146 (calculado para C30H38O14Na, 645,2154).
Cistansalside B (6): polvo amorfo marrón; [|20 x72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3,32); IR (puro) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; Datos de 1H-NMR (500 MHz) y 13C-NMR (125 MHz), véase la Tabla 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M más Na] más 579,2054 (calculado para C26H36O13Na, 579,2048).
Cistansalside C (12): polvo amorfo marrón; [|20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3,25); IR (puro) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; Datos de 1H-NMR (800 MHz) y 13C-NMR (200 MHz), véase la Tabla 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M más Na] más 581,2213 (calculado para C26H38O13Na, 581,2205).
Cistansalside D (17): polvo amorfo marrón; [|20 x51,1 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (puro) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; Datos de 1H-NMR (400 MHz) y 13C-NMR (75 MHz), consulte la Tabla 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M más Na] más 657,2147 (calculado para C31H38O14Na, 657,2154).
Cistansalside E (18): polvo amorfo marrón; [|20 x59,2 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3,22); IR (puro) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; Datos de 1H-NMR (800 MHz) y 13C-NMR (200 MHz), consulte la Tabla 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M más Na] más 657,2166 (calculado para C31H38O14Na, 657,2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Análisis
El análisis cromatográfico de espectrometría de masas se realizó en un sistema LC de la serie Infinity 1260 de Agilent (Agilent Technologies, Inc., EE. UU.). La columna analítica era una columna SFCpak Crest C18T-5 (id 15{{10}} : 4,6 mm, 5 um, Jasco, Japón). La fase móvil consistió en 0.1 por ciento (v/v) de ácido fórmico en MeCN (A) y agua (B) utilizando un gradiente de elución de 0–35 min (23 por ciento A), 35–45 min ( 23–28 por ciento A), 45–75 min (28 por ciento A) y 75–80 min (90 por ciento A). El caudal se mantuvo en 0,3 ml/min. La absorbancia se midió a 320 nm. Las condiciones de la fuente de ESI fueron las siguientes: caudal de gas de secado (N2), 10 l/min; temperatura del gas de secado, 350 grados; nebulizador, 30 psig; caudal de gas envolvente, 12,0 l/min; temperatura del gas envolvente, 350 grados; capilar, 4000 V; espumadera, 60 V; octapolo RF, 750 V; voltaje del fragmentador, 180 V; modo positivo. El sistema fue operado bajo el software de estación de trabajo Masshunter. El rango de masas se fijó en m/z 50–1000.
3.6.Ácido Hidrólisis
Los compuestos se hidrolizaron usando H2SO4 1 N (100 uL) calentado con un baño de agua a 90 grados durante 2 h, luego se neutralizaron con una solución acuosa saturada de Na2CO3. Después de que las soluciones se secaron bajo una corriente de N2, los productos y los azúcares estándar (D-Glc, L-Glc, L-Rha) se disolvieron en piridina (100 uL) que contenía clorhidrato de éster metílico de L-cisteína (0,5 mg). Una muestra de L-ramnosa se disolvió en piridina (100 uL) que contenía clorhidrato de éster metílico de D-cisteína (0,5 mg). Después de eso, se calentaron a 60 grados durante 1 hora. Las soluciones se trataron con 1 uL (1,11 mg) de o-tolilisotiocianato, que se calentaron de nuevo a 60 grados durante 1 h. Cada mezcla final se analizó directamente mediante RP-HPLC analítica (columna Hypersil™ BDS C18, MeCN acuoso al 17 por ciento, 0,8 ml/min, 40 min, 35 grados). El tR del pico a los 21,9 y 40,4 min coincidió con el del derivado de tiocarbamoil tiazolidina de D-glucosa y L-ramnosa, respectivamente.
3.7. Célula Cultura
Los macrófagos murinos, RAW 264.7, se obtuvieron del Instituto Coreano de Investigación de Biociencia y Biotecnología (Daejeon, Corea) y se cultivaron en medio RPMI que contenía suero bovino fetal al 10 % y 100 U/mL de penicilina/sulfato de estreptomicina. Las células se incubaron en una atmósfera humidificada con 5 por ciento de CO2 a 37 grados.
3.8.Drogas y Químicos
RPMI, penicilina y estreptomicina se adquirieron de HyClone (Logan, UT, EE. UU.). La albúmina de suero bovino y el LPS se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.).
3.9.Medición de la Producción de NO
Se midió la concentración de nitritos en el medio de cultivo como indicador de la producción de NO según la reacción de Griess. Las células se sembraron a razón de 2:105 células/pocillo en 96-placas de cultivo de pocillos. Después de la preincubación de las células RAW 264.7 durante 18 h, las células se pretrataron con compuestos (50 uM, 10 uM, 5 uM o 1 uM) y se estimularon con LPS (500 ng/mL) durante 24 H. Compuestos de prueba disueltos en DMSO. Las células también se trataron con DMSO al 0,05 por ciento como vehículo de control. Se cultivaron células RAW 264.7 (2: 105 células/pocillo) en 96-placas de pocillos utilizando RPMI sin rojo fenol y se pretrataron con muestras durante 0,5 h. La producción celular de NO se indujo mediante la adición de 500 ng/mL de concentración final de LPS y una incubación de 24 h. Después de la incubación, se mezclaron 100 uL de medio acondicionado con el mismo volumen de reactivo de Griess y se incubaron durante 15 min. La absorbancia de la mezcla a 540 nm se midió con un lector de microplacas ELISA (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EE. UU.). Los valores obtenidos se compararon con los de las concentraciones estándar de nitrito de sodio disuelto en RPMI y se calcularon las concentraciones de nitrito en los medios acondicionados de las células tratadas con la muestra.
3.10.3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio (MTT) para la viabilidad celular
Las células se sembraron en {{0}}placas de pocillos a una densidad de 5:104 células/pocillo y se incubaron con medio sin suero en presencia de muestras. Compuestos de prueba disueltos en DMSO. Las células también se trataron con DMSO al 0,05 por ciento como vehículo de control. Después de la incubación durante 24 h, se añadieron 10 uL de MTT (5 mg/ml en solución salina) y se continuó la incubación durante 4 h más. La succinato deshidrogenasa mitocondrial en células vivas convierte el MTT en cristales de formazán visibles durante la incubación. A continuación, los cristales de formazán se solubilizaron en dimetilsulfóxido y se midió la absorbancia a 540 nm utilizando un lector de microplacas de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). Se calculó la viabilidad celular relativa en comparación con la absorbancia del grupo de control no tratado. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.
3.11.Análisis de inmunotransferencia
La expresión de proteínas se evaluó mediante transferencia de Western de acuerdo con los procedimientos estándar. Brevemente, las células RAW264.7 se cultivaron en placas de cultivo de 6{{20}} mm (2: 106/mL), seguidas de un pretratamiento de 50 uM de compuestos . Las células se lavaron dos veces en PBS enfriado con hielo (pH 7,4), los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis sobre hielo durante 15 minutos y los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación. La concentración de proteínas se determinó utilizando el reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proteína (20–30 ug) se mezcló 1:1 con 2: tampón de muestra (20 % de glicerol, 4 % de SDS, 10 % de 2- ME, azul de bromofenol al 0,05 % y Tris 1,25 M [pH 6,8]), se cargan en geles de SDS-PAGE al 8 o al 15 % y se ejecutan a 150 V durante 90 min. Las proteínas celulares se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno Immunoblot (Bio-Rad) usando un sistema de transferencia semiseco Bio-Rad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, las membranas se incubaron durante la noche con los respectivos anticuerpos primarios p-NF-入B, NF-入B, pI入B y -actina (Abcam, Cambridge, Reino Unido) en solución salina tamponada con Tris que contenía un 5 % de leche desnatada y un 0,1 % de Tween. 20. Al día siguiente, las transferencias se lavaron tres veces con solución salina tamponada con Tris (0,1 % de Tween 20) y se incubaron durante 1 h con un anticuerpo secundario anti-IgG conjugado con HRP (diluido 1:2000–1 :20.000). Las transferencias se lavaron nuevamente tres veces con solución salina tamponada con Tris (Tween 20 al 0,1 por ciento) y se desarrollaron bandas inmunorreactivas utilizando el sustrato quimioluminiscente ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE. UU.).
3.12.Análisis estadístico
Los datos experimentales se presentan como la media o SEM. El nivel de significación estadística se determinó mediante análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba t de Dunnett para comparaciones múltiples. Los valores de p inferiores a 0.05 se consideraron significativos.
Extracto de salsa cistanche
4. Conclusiones
En este estudio, aislamos y aclaramos las estructuras de cinco nuevos glucósidos sustituidos con fenilpropanoide, denominados cistansalside AE (5, 6, 12, 17 y 18), además de aislar e identificar 13 compuestos conocidos, utilizando una estrategia de desreplicación. Se determinó que los compuestos conocidos eran lipedósido AI (1) [21], 23-acetilactósido (2) [22], isocistanósido C (3) [15], osmanthusido B (4) [21], epimeridinósido A ( 7) [15], cistanosido D (8) [23], salsaside B (9) [6], tubuloside E (10) [16], cistanoside M (11) [15], isomartynoside (13) [24], salsaside C (14) [6], jionósido C (15) [25] y salsaside F (16) [6]. Sus estructuras se establecieron a través del análisis de extensos datos espectroscópicos y por comparación con los datos reportados en la literatura. Se confirmó que las estructuras pronosticadas tentativamente de los glucósidos sustituidos con fenilpropanoide coincidían correctamente con sus estructuras reales.
Beneficio del extracto de salsa Cistanche
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