Los glucósidos feniletanoides de Paraboea Martinii protegen las células de feocromocitoma de rata (PC12) de la lesión celular inducida por peróxido de hidrógeno
Mar 04, 2022
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Xue Gong†a, Yan Xu†b, Kai Renc, Xiaorong Baid
Se sabe que el estrés oxidativo juega un papel esencial en la patogénesis de varias enfermedades. Está relacionado con la etiología de la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP), la epilepsia y otras enfermedades [1–3]. En la actualidad, se han realizado progresos continuos en el estudio de la patogenia de la EA, la EP y otras enfermedades. Sin embargo, debido al conocimiento limitado de los mecanismos moleculares subyacentes a la EA, la EP y otras enfermedades, no se han realizado estrategias preventivas o curativas eficaces para estas enfermedades [4]. H2O2 es un componente importante de las especies reactivas de oxígeno (ROS). En consecuencia, la lesión celular PC12 inducida por H2O2-es el modelo de estrés oxidativo más utilizado y se utiliza ampliamente en estudios experimentales de efectos neuroprotectores [5]. La hemooxigenasa 1 (HO-1) y la subunidad catalítica de glutamato-cisteína ligasa (GCLC) son enzimas antioxidantes celulares importantes, y ambos genes están regulados aguas abajo del factor nuclear eritroide 2 (Nrf2), que está emergiendo como una terapia prometedora. diana para la neuroprotección [6,7]. Los glucósidos feniletanoides, derivados de la unidad C-6-C-3, contienen muchos grupos hidroxilo fenólicos y tienen importantes actividades antioxidantes y antienvejecimiento. En los últimos años, los estudios han indicado que muchas plantas medicinales contienen glucósidos feniletanoides que muestran una importante actividad antioxidante. Por ejemplo, los glucósidos feniletanoides derivados deCistanche de hierbasse sabe que ejercen efectos protectores sobre los déficits cognitivos en la EA. Ese estudio investigó el mecanismo de protección asociado utilizando un modelo de ratón 8 propenso a la senescencia acelerada por AD (SAMP8). Los resultados indicaron que la capacidad de los glucósidos de feniletanoide para mejorar los déficits cognitivos en ratones SAMP8 podría estar relacionada con la promoción de la plasticidad sináptica que implica procesos antioxidantes [8]. En este estudio, se separaron y purificaron dos glucósidos de feniletanoide a partir de nudos de madera de Tectona grandis (teca); estos compuestos mostraron notables efectos antioxidantes que se determinaron mediante un método amperométrico [9]. Además, los compuestos de glucósido de cafeoil feniletanoide de Lindernia ruellioides ejercen efectos antioxidantes dependientes de la dosis y de eliminación de radicales libres de anión superóxido in vitro [10]. Los mecanismos de acción de los glucósidos feniletanoides están relacionados con la regulación de la vía de señalización Nrf2/ARE, que influye en la síntesis de SOD, CAT, GSH-PX y otras enzimas antioxidantes [11]. La familia Gesneriaceae, que contiene 150 géneros y aproximadamente 3700 especies, se distribuye principalmente en las regiones tropicales y templadas del este y sur de Asia, Oceanía, América del Sur, África, el sur de Europa y México [12].
Gesneriaceae en China. Se informó que aproximadamente 100 especies tienen eficacia médica y la mayoría de ellas se distribuyen principalmente en las provincias de Guangxi y Guizhou [13]. En los últimos años, la investigación sobre las plantas de Gesneriaceae se ha incrementado gradualmente en diferentes áreas del mundo y se han encontrado algunos constituyentes nuevos con actividades fisiológicas [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt pertenece a Parabola (Gesneriaceae) y es una planta herbácea. Basado en "Los registros de recursos de medicina tradicional china", se registró que toda la planta se usa como medicina. Además, puede ejercer muchas actividades farmacológicas en afecciones como hematemesis, edema, disentería, lesiones traumáticas y fracturas [15]. Bai demostró que los glucósidos feniletanoides son uno de los principales constituyentes químicos de las plantas Gesneriaceae [16]. Algunos investigadores también han encontrado que los glucósidos feniletanoides tienen actividades antioxidantes significativas [17]. Li demostró que los glucósidos feniletanoides deCistanche desertica have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 por ciento) de ocho glucósidos de fenilpropanoide se midió mediante el método de normalización del área del pico de HPLC. Como ejemplo, los gráficos de cromatografía de parabosido B y parabosido II se muestran en la Figura 1, y se encontró que su contenido relativo era 98,23 por ciento y 99,20 por ciento, respectivamente. La línea celular de feocromocitoma suprarrenal de rata pobremente diferenciada (PC12) se adquirió del Banco de células de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China). El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y el suero de caballo se adquirieron de Gibco (Gaithersburg, MD, EE. UU.). El suero bovino fetal (FBS) se adquirió de Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, EE. UU.). El H2O2 se obtuvo de Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tianjin, China). Trizol se adquirió de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.). El kit de reactivos PrimeScriptTM RT (Perfect Real Time) se obtuvo de TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, China). Los cebadores para HO-1, GCLC y GAPDH fueron sintetizados por Sangon Biotech (Shanghai, China). El kit de ensayo de proliferación celular (MTS) CellTiter 96® Aqueous One Solution se obtuvo de Promega Corp. (Madison, EE. UU.). Los inhibidores de la protoporfirina de zinc HO-1 (ZnPP) se adquirieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). También se utilizaron una incubadora de CO2 Thermo311 (Thermo, EE. UU.), un bloque de ciclos térmicos del instrumento de PCR en tiempo real StepOnePlusTM (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo) y xCELLigence RTCA DPlus Analyzer y E-Plate 16 (ACEA Biosciences, EE. UU.) .
Cistanche desertica
Cultivo celular y tratamiento.
Las células PC12 se cultivaron en DMEM que contenía 5 por ciento de FBS y 5 por ciento de suero de caballo a 37 grados en una atmósfera humidificada con 5 por ciento de CO2. Las células PC12 se dividieron en tres grupos de la siguiente manera: un grupo de control, un grupo modelo y un grupo de tratamiento. Se disolvieron ocho glucósidos de fenilpropanoide en DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">
Determinación de H2O2
Determinamos la concentración adecuada de H2O2 mediante análisis celular en tiempo real (RTCA). Las células PC12 se sembraron en una microplaca CIM-plate-16 a un volumen de 100 µl y luego se incubaron durante 12 horas a 37 grados en una atmósfera con un 5 por ciento de CO2. Las células PC12 se dividieron en grupos de control y modelo. Luego, se agregaron 10 μL de H2O2 (50, 100, 200 y 400 μM) a los grupos modelo y los grupos de control se trataron con 10 μL de DMEM completo, configurado en tres pozos complejos. La E-Plate 16 se colocó en xCELLigence RTCA, se controló cada 15 min y los resultados se registraron durante 32 h. El efecto del H2O2 en las células PC12 se analizó utilizando el software de análisis de datos xCELLigence RTCA. El valor del índice celular (IC) se utilizó para determinar la concentración óptima de H2O2 y la duración de la acción.
Extracción y aislamiento de compuestos
Las fracciones se separaron en función de su polaridad utilizando los métodos descritos anteriormente. P. martini en polvo secado al aire (4 kg) se extrajo sucesivamente tres veces con una solución acuosa de etanol al 75 por ciento [20]. Los extractos obtenidos luego se concentraron utilizando un evaporador rotatorio para eliminar el etanol y se obtuvieron extractos crudos. Las muestras se disolvieron en agua desionizada y luego se extrajeron sucesivamente con éter de petróleo, acetato de etilo, n-butanol y agua. El extracto de n-butanol (400 g) se fraccionó utilizando una columna de resina macroporosa AB-8 y una solución de etanol-H2O2 (0, 1{{47} }, 30, 50, 70 y 95 por ciento). Finalmente se obtuvieron seis fracciones (fracciones 1–6). Las fracciones 3 y 4 se sometieron a separación usando una columna MCI con un gradiente escalonado de MeOH-H2O2 (10-100 por ciento). A continuación, los productos se aislaron usando Sephadex LH-20 con 50 por ciento de MeOH como eluyente. Los compuestos 1 (41,0 mg) y 6 (15,6 mg) se aislaron de la fracción 3. Los compuestos 2 (62,0 mg), 3 (34,7 mg), 7 (11,0 mg) y 8 (26,0 mg) se obtuvieron de la fracción 4 utilizando Sephadex. cromatografía LH-20 con 50 por ciento de MeOH como eluyente. Los aislamientos finales se realizaron mediante HPLC semipreparativa de fase inversa (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) con 50 % de MeOH y detección UV a 280 nm para producir los compuestos 4 (39,0 mg) y 5 (9,0 mg) [20].
Ensayo de viabilidad celular
Las células PC12 se sembraron en 96-placas de pocillos a una densidad de 2 × 1{{10}}4 células/pocillo a un volumen final de 100 µL . Las células PC12 se incubaron a 37 grados con 5 por ciento de CO2 durante 12 h. A continuación, las células se trataron con varias concentraciones de extractos crudos (0.025, 0.05, 0.1, 0.2 y 0.4 mg/mL) y compuestos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 a cinco concentraciones (3,125, 6,25, 12,5, 25 y 50 μM). Después del pretratamiento durante 24 h, se determinó la viabilidad celular mediante ensayos MTS. Las células PC12 se preincubaron con o sin el inhibidor de HO-1 sin ZnPP (15 μM) durante 30 min, luego se incubaron con o sin caleolarioside B, paraboside B y paraboside II (3,125 μM) durante 12 h y finalmente se incubaron con 400 μM H2O2 por otras 6 h. Después del tratamiento, se determinó el número de células supervivientes mediante un ensayo MTS [6].
Efectos protectores de extractos crudos y compuestos monoméricos en células PC12 tratadas con H2O2-
Las células se cultivaron en una placa de {{0}}pocillos a un volumen final de 100 µL. Se añadieron diluciones en serie de extractos crudos (0.025, 0,05, 0,1, 0,2 y 0,4 mg/ml) al grupo tratado. Después del pretratamiento durante 12 h, se añadió 400 μM de solución de H2O2 (concentración óptima) al grupo tratado y al grupo H2O2 de cada pocillo durante 6 h. A continuación, se añadió solución de MTS a cada pocillo y las placas se incubaron durante 3 ha 37 grados C. Las placas se hicieron oscilar a baja velocidad durante 5 min a temperatura ambiente hasta que todos los cristales se disolvieron por completo. La protección celular se determinó en base a los resultados del ensayo MTS de acuerdo con el 2204 X del fabricante. GONG ET AL. Descargado de https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 por invitado el 27 de agosto de 2021instrucciones. La densidad óptica se determinó a una longitud de onda de absorbancia de 490 nm. Realizamos un seguimiento adicional de la actividad de los compuestos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 aislados de las fracciones 3 y 4. Diluciones en serie de los compuestos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 (3,125, 6,25, 12,5, 25 y 50 μM) se añadieron al grupo tratado para determinar sus respectivos efectos protectores sobre las células PC12 inducidas por H2O2-.
glucósidos feniletanoides de Cistanche deserticola: Protege las neuronas y anti-envejecimiento
PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
Las células PC12 se recogieron 12 h después del tratamiento con caleolarioside B, paraboside B y paraboside II 3,125 μM. El ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol y las alícuotas del ARN total se transcribieron inversamente con un kit maestro Primescript RT de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se emplearon los siguientes cebadores para los experimentos de acuerdo con un informe anterior [21]. HO-1: avance 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG-3′, retroceso 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: Adelante 5′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′, Inversa 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: Adelante 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, Reversa 5′- GAAGCGCCAGTAGACTCCACG-3′. A continuación, se amplificaron mediante PCR alícuotas de los ADNc obtenidos. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 grados (30 s), seguida de 40 ciclos de 95 grados (5 s), 60 grados (34 s) y 72 grados (35 s). Se probaron todos los cebadores y se detectó la señal fluorescente FL; luego, se calculó el valor de △Ct y se compararon los valores relativos con los del grupo control utilizando la siguiente ecuación: △Ct=Ct (muestra) − Ct (control endógeno), △△Ct {{36} } △Ct (muestra) −△Ct (sin tratar) y cambio de pliegue=2−△△Ct. Se utilizó gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control interno.
extracción de proteínas
Las células PC12 se sembraron en placas de 100- mm a razón de 1 × 107 células/placa. Después de la unión, las células se trataron respectivamente con caleolarioside B, paraboside B y paraboside II (3,125 µM) durante 12 h. Luego se eliminaron los glucósidos y las células se incubaron con H2O2 durante otras 6 h. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS frío y se rasparon de las placas con 1 ml de PBS. Los homogeneizados celulares se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 min. Después del tratamiento, las proteínas celulares se extrajeron utilizando un tampón de lisis celular Beyotime RIPA con PMSF 1 mM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Además, se aislaron proteínas citoplasmáticas y nucleares como se describe en el protocolo del kit de extracción nuclear y citoplasmática de Beyotime. Las concentraciones de proteínas de las muestras se detectaron utilizando un kit de ensayo de proteínas Beyotime BCA, y todas las muestras se almacenaron a -80 grados para el análisis de transferencia Western [6].
Análisis de Western Blot
La electroforesis SDS-PAGE se realizó después de la extracción y posterior desnaturalización de la proteína total de diferentes grupos. Después de la electroforesis, la proteína se transfirió a membranas de PVDF, que luego se bloquearon con leche en polvo descremada al 5 por ciento durante 4 h. Después del lavado, anticuerpo primario (anticuerpo policlonal de conejo GAPDH (dilución 1:10,000), anticuerpo policlonal de conejo HO-1 (dilución 1:1000) o anticuerpo policlonal de conejo GCLC (dilución 1:1000) Se añadió a las membranas, que se incubaron durante la noche a 4 grados. Al día siguiente, las membranas de PVDF se lavaron tres veces en TTBS. A continuación, un anticuerpo secundario (IgG anti-conejo de cabra pura de afinidad conjugada (dilución 1:1000) marcado con Se agregó peroxidasa de rábano picante a las membranas, que luego se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h. Las membranas de PVDF se lavaron y se sometieron al reactivo de detección de quimioluminiscencia ECL para señalar la exposición en la película de rayos X, que luego se fijó y se escaneó [22].
análisis estadístico
Los datos se analizaron con SPSS 19.0 y los resultados se presentan como medias con desviación estándar (DE) de tres experimentos independientes. Se consideró que los valores de p < 0.05="" indicaban="" diferencias="" estadísticamente="">
Resultados Establecimiento del modelo H2O2
Como se muestra en la Figura 2, el H2O2 a 50, 100 y 200 μM no provocó el nivel adecuado de muerte celular. Sin embargo, 400 μM de H2O2 actuó sobre las células PC12 en un plazo de 2 a 6 h y el daño oxidativo de las células tendió a ser estable. Por lo tanto, consideramos que la inducción con H2O2 a una concentración de 400 μM durante 6 h era apropiada para imitar el daño inducido por el estrés oxidativo en las células PC12.
Efectos protectores de extractos crudos sobre células PC12 tratadas con H2O2
En comparación con el grupo modelo H2O2 (Figura 3), el extracto de n-butanol en concentraciones de 0.05, 0.1, {{10} }.2 y 0.4 mg/mL mejoraron significativamente el daño oxidativo a las células PC12 inducido por H2O2 (p < 0.05)="" de="" una="" manera="" dependiente="" de="" la="" concentración.="" estos="" datos="" sugirieron="" que="" la="" fracción="" de="" n-butanol="" contenía="" una="" actividad="" protectora="" más="" potente.="" sin="" embargo,="" los="" extractos="" de="" éter="" de="" petróleo="" y="" acetato="" de="" etilo="" mostraron="" actividad="" protectora="" solo="" a="" altas="" concentraciones="" (éter="" de="" petróleo:="" 0.1="" y="" 0.2="" mg/="" ml,="" p="">< 0.{{31}="" }5,="" acetato="" de="" etilo:="" 0,2="" y="" 0,4="" mg/ml,="" p="">< 0,05).="" además,="" diferentes="" concentraciones="" de="" extractos="" en="" fase="" acuosa="" no="" mostraron="" efectos="" protectores="" (p=""> 0,05). Además, hemos agregado datos de un estudio de validación que utiliza líneas celulares de neuroblastoma humano SH-SY5Y (SH-SY5Y) en el archivo complementario. El tratamiento con H2O2 250 μM resultó en una disminución de la viabilidad celular; sin embargo, el tratamiento con caleolarioside B, paraboside B y paraboside II (3.125, 6.25, 12.5, 25 y 50 μM) atenuó significativamente la muerte celular SH-SY5Y. Los resultados del experimento demostraron que el caleolarioside B, el paraboside B y el paraboside II protegían a las células SHSY5Y de la lesión celular inducida por H2O2-.
Estructuras de compuestos aislados de la fracción n-butanol
Para confirmar que el extracto de n-butanol contenía componentes activos, fraccionamos más ocho compuestos de la extracción. Las estructuras de los compuestos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 se identificaron mediante diferentes datos espectrales (1 H-NMR, 13C-NMR y ESI-MS) basados en comparaciones con los datos publicados para el parabosido A. , parabosido B, parabosido I, parabosido II, parabosido III, nuomiosido A, caleolariosido B e isonuomiosido A, respectivamente [20]. Por ejemplo, los datos para el parabosido B fueron los siguientes: goma marrón; ½ 20 D −55,7 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (logε): 220 (3,61), 291 (3,54), 330 (3,66) [20]; IRKBr max cm−1 : 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm−1 [20]; para los datos espectroscópicos detallados de RMN de 1H y 13C que se muestran en la referencia 20; HR-ESI-MS (negativo) m/z 741,2231 [MH]− (calculado para C33H41O19, 741,2242) [20]. Los datos para el parabosido II fueron los siguientes: polvos amorfos blancos; ½ 20 D −80,5 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (logε): 229 (3,74), 322 (3,73) [20]; IRKBr máx cm−1: 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm−1 [20]; para los datos espectroscópicos detallados de RMN de 1H y 13C que se muestran en la referencia 20; ESI-MS (negativo) m/z 637
Efectos protectores de compuestos aislados contra la toxicidad inducida por H2O2-en células PC12
Se utilizaron ensayos MTS para investigar el efecto de los compuestos aislados sobre la viabilidad de las células PC12 expuestas a la toxicidad inducida por H2O2-. Como se muestra en la Figura 5, en comparación con el grupo de control, las células PC12 se trataron previamente con cinco concentraciones diferentes de caleolarioside B, paraboside B, paraboside II o paraboside A (3.125, 6.25, 12.5, 25 y 50 μM) durante 24 h no mostró diferencias significativas en la viabilidad celular (p > 0.05). Por lo tanto, el pretratamiento de células PC12 con caleolarioside B, paraboside B y paraboside II no produjo citotoxicidad. Como se muestra en la Figura 6, el H2O2 400 µM disminuyó significativamente la viabilidad celular en comparación con el grupo de control. Además, la viabilidad celular de las células PC12 tratadas con H2O2- aumentó notablemente después del pretratamiento de las células PC12 con diferentes concentraciones de caleolariosido B, parabosido B y parabosido II; además, la viabilidad celular fue máxima después del tratamiento con caleolariosido B 50 µM, parabosido B 50 µM y parabosido II 12,5 µM. Los otros cinco compuestos no mostraron efectos protectores significativos en las células PC12 tratadas con H2O2-. Para ilustrar este hallazgo, discutimos uno de estos como ejemplo, mientras que los otros no se describen en el manuscrito.
Niveles de transcripción de HO-1 y GCLC
A continuación, probamos los niveles transcripcionales de HO{{0}} y GCLC en células PC12 tratadas con caleolarioside B, paraboside B y paraboside II. El ARNm total se recolectó de células PC12 tratadas y no tratadas durante 12 h y luego se sometió a análisis de expresión mediante qRT-PCR. Como se muestra en la Figura 7(a,c,e), los niveles transcripcionales de HO-1 aumentaron significativamente después de que las células PC12 se pretrataron con las concentraciones indicadas de caleolarioside B, paraboside B y paraboside II durante 12 h (p < 0.05).="" como="" se="" muestra="" en="" la="" figura="" 7(b),="" los="" niveles="" transcripcionales="" de="" gclc="" también="" aumentaron="" significativamente="" en="" las="" células="" pc12="" pretratadas="" con="" las="" concentraciones="" indicadas="" de="" caleolarioside="" b="" durante="" 12="" h.="" sin="" embargo,="" los="" niveles="" de="" gclc="" en="" células="" pc12="" pretratadas="" con="" parabosido="" b="" durante="" 12="" h="" disminuyeron="" significativamente="" en="" comparación="" con="" los="" del="" grupo="" modelo="" (p="">< 0,05;="" figura="" 7(d)).="" además,="" con="" el="" tratamiento="" con="" paraboside="" ii,="" los="" niveles="" de="" gclc="" en="" las="" células="" pc12="" no="" fueron="" significativamente="" diferentes="" en="" comparación="" con="" los="" del="" grupo="" modelo="" (p=""> 0,05; Figura 7(f)).
Expresión de HO-1 y GCLC
HO{{0}} y GCLC son importantes enzimas antioxidantes celulares, y ambos son genes aguas abajo regulados por Nrf2-. La expresión proteica de HO-1 y GCLC también se observó después del tratamiento [6]. La Figura 8 muestra los niveles de proteína de HO-1 y GCLC en células PC12 después del tratamiento con H2O2 400 μM; los resultados indicaron que las intensidades de fluorescencia FL de HO-1 en los grupos de caleolarioside B y paraboside B fueron mayores que las de los grupos tratados con H2O2- (Figura 8(a,c)). Sin embargo, la expresión de GCLC no cambió significativamente por los compuestos, excepto por el caleolarioside B (Figura 8(b)). A continuación, se utilizaron inhibidores químicos de HO-1 para evaluar más a fondo las funciones de las enzimas antioxidantes en la regulación de los efectos protectores ejercidos por el caleolariosido B, el parabosido B o el parabosido II contra la citotoxicidad inducida por H2O2-. El caleolarioside B, el paraboside B y el paraboside II (3,125 µM) previnieron la citotoxicidad inducida por H2O2-, pero tales efectos protectores fueron revertidos por el inhibidor de HO-1 ZnPP (p < 0,01)="" a="" 15="" µm="" (figura="" 8="">
El beneficio de Cistanche: Aumentar la reproducción masculina
Discusión
El envejecimiento de la población es un grave problema mundial. Muchas enfermedades están relacionadas con la senilidad, como la EA y la EP, que son amenazas graves para la salud pública. La EA y la EP se han convertido en las terceras enfermedades más letales a nivel mundial, después de las enfermedades cardiovasculares y el cáncer. Por ello, la neurodegeneración se ha convertido en un tema de investigación urgente a nivel mundial. Sin embargo, la patogenia de la EA y la EP, enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central, sigue sin estar clara hasta la fecha. Además, solo hay unos pocos fármacos que pueden tratar eficazmente la EA o la EP debido a sus complejos mecanismos patogénicos [23]. Estudios anteriores demostraron que las ERO, como el anión superóxido (O2−) y el H2O2, son los principales factores que contribuyen a las enfermedades neurodegenerativas. Los cambios patológicos durante la EP incluyen la degeneración neuronal y la muerte de la sustancia negra y la dopamina del cuerpo estriado [24,25]. En consecuencia, es importante desarrollar fármacos antioxidantes efectivos para tratar la EP, y dicho descubrimiento de fármacos se ha convertido en una importante dirección de investigación [26]. Actualmente, la vía de señalización Nrf2/ARE parece ser la vía de estrés antioxidante endógeno más importante [27]. Ares se encuentra en las regiones de clasificación 5′ de los genes, como HO-1 y GCLC [28,29]. HO-1 y GCLC son genes relacionados con Nrf2- que están regulados aguas abajo de esta proteína [6]. Posteriormente, los ARE pueden afectar los niveles de antioxidantes y activar la expresión posterior de HO-1 y otros genes protectores, lo que podría mejorar las actividades de protección celular [30,31]. Además, los hallazgos sugirieron que los efectos protectores del resveratrol contra la toxicidad inducida por A {{2{{50}}}} en las células PC12 ocurren a través de la regulación al alza de la expresión de HO-1 a través de la activación del Nrf2 intracelular vía de señalización [32]. Las células PC12 son un modelo aceptado de células neurales y se utilizan ampliamente en estudios de efectos neuroprotectores [33]. El H2O2 puede pasar fácilmente a través de la membrana celular y combinarse con el hierro para formar radicales libres altamente activos, que inducen estrés oxidativo y lesión celular [34]. El H2O2 es un ROS importante, y los radicales libres se generan fácilmente y son relativamente estables, por lo que generalmente se utilizan para establecer un modelo de estrés oxidativo utilizando células PC12 [5]. En este estudio, el pretratamiento de las células PC12 con concentraciones no tóxicas del extracto de la planta protegió a las células de la citotoxicidad inducida por H2O2-al disminuir la generación de ROS. Los glucósidos feniletanoides contienen muchos grupos hidroxilo fenólicos que tienen actividades antioxidantes y antienvejecimiento. En este estudio, encontramos que la extracción de n-butanol produjo una mejor protección que otras fracciones de polaridad (Figura 3). Por lo tanto, analizamos aún más las actividades protectoras de ocho compuestos aislados de la fracción de n-butanol. Los resultados mostraron por primera vez que Figura 8. Análisis de los niveles de proteína HO-1 y GCLC en células PC12. ( a ) Se utilizó el análisis de transferencia Western de la expresión de HO-1 y GCLC y GAPDH como control de carga. ( b ) Análisis de transferencia Western Expresión de proteínas GCLC. ( c ) Análisis de transferencia Western HO-1 expresión de proteína. (d) El inhibidor de HO-1 ZnPP redujo el efecto neuroprotector. Los datos se presentan como medias ± SD, n=3. ***p < 0.001="" frente="" al="" grupo="" de="" control;="" #p="">< 0,05="" frente="" al="" grupo="" h2o2="" (sin="" tratamiento="" con="" znpp),="" ##p="">< 0,01="" frente="" al="" grupo="" h2o2="" (sin="" tratamiento="" con="" znpp),="" ###p="">< 0,001="" frente="" al="" grupo="" h2o2="" (sin="" tratamiento="" con="" znpp);="" y="" p="">< 0,01,="" frente="" al="" grupo="" h2o2="" (tratado="" con="" znpp),="" y="" &p="">< 0,001,="" frente="" al="" grupo="" h2o2="" (tratado="" con="" znpp).="" (grupo="" de="" control;="" grupo="" modelo:="" h2o2;="" grupo="" znpp="" negativo:="" caleolarioside="" b="" más="" h2o2,="" paraboside="" b="" más="" h2o2,="" paraboside="" ii="" más="" h2o2;="" grupo="" znpp="" positivo:="" znpp="" más="" caleolarioside="" b="" más="" h2o2,="" znpp="" más="" paraboside="" b="" más="" h2o2,="" znpp="" más="" paraboside="" ii="" más="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" y="" al.="" descargado="" de="" https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145="" por="" invitado="" el="" 27="" de="" agosto="" de="" 2021caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" y="" paraboside="" ii="" tienen="" efectos="" protectores="" significativos="" contra="" la="" oxidación="" inducida="" por="" h2o2-="" daño="" en="" las="" células="" pc12.="" los="" resultados="" también="" indicaron="" que="" el="" tratamiento="" con="" h2o2="" indujo="" una="" lesión="" celular="" pc12="" significativa="" y="" disminuyó="" la="" viabilidad="" celular,="" mientras="" que="" el="" tratamiento="" con="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" y="" paraboside="" ii="" mitigó="" significativamente="" estos="" efectos="" (figura="" 6).="" un="" estudio="" anterior="" informó="" que="" la="" vía="" nrf2/are="" es="" una="" de="" las="" vías="" antioxidantes="" endógenas="" más="" importantes="" y="" puede="" aumentar="" la="" expresión="" de="" marcadores="" aguas="" abajo,="" como="" ho-1,="" para="" proteger="" las="" células="" [7].="" los="" resultados="" de="" los="" análisis="" qrt-pcr="" y="" western="" blot="" mostraron="" que="" el="" caleolarioside="" b,="" el="" paraboside="" b="" y="" el="" paraboside="" ii="" aumentaron="" significativamente="" los="" niveles="" de="" ho-1.="" sin="" embargo,="" los="" niveles="" transcripcionales="" de="" gclc="" aumentaron="" significativamente="" en="" las="" células="" pc12="" pretratadas="" con="" caleolarioside="" b="" pero="" disminuyeron="" en="" las="" pretratadas="" con="" paraboside="" b="" en="" comparación="" con="" las="" del="" grupo="" modelo.="" además,="" el="" parabosido="" ii="" no="" alteró="" la="" expresión="" de="" este="" marcador,="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" modelo="" (figuras="" 7="" y="" 8(a–c)).="" además,="" los="" efectos="" protectores="" del="" caleolarioside="" b,="" el="" paraboside="" b="" y="" el="" paraboside="" ii="" contra="" la="" lesión="" celular="" pc12="" inducida="" por="" h2o2-fueron="" revertidos="" por="" el="" inhibidor="" znpp="" de="" ho-1="" (figura="" 8(d)).="" en="" conclusión,="" los="" glucósidos="" feniletanoides="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" y="" paraboside="" ii="" protegieron="" eficazmente="" a="" las="" células="" pc12="" del="" daño="" oxidativo="" inducido="" por="" h2o2-.="" en="" consecuencia,="" estos="" compuestos,="" aislados="" de="" p.="" martini,="" podrían="" representar="" posibles="" candidatos="" a="" fármacos="" para="" el="" tratamiento="" de="" enfermedades="">
El beneficio de Cistanche:tratamiento de enfermedades neurodegenerativas
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