El análisis in silico de un péptido del veneno del parasitoide de Drosophila revela la prevalencia del motivo de clip de catión-polar-catión en las proteínas Knottin Parte 1

Abstracto:

Como avispas parasitoides generalistas, el heteroátomo de Leptopilina tiene un gran éxito en muchas especies de moscas de la fruta del género Drosophila. Los parasitoides producen estructuras similares a vesículas extracelulares (EV) de múltiples estrategias especializadas en su veneno. El análisis proteómico identificó varias proteínas asociadas con la inmunidad, incluido el péptido knottin, LhKNOT, que contiene el pliegue del nudo de cisteína (ICK) del inhibidor estructuralmente conservado, que está presente en proteínas de diversos taxones. Nuestro análisis estructural y de acoplamiento del 36-pliegue de nudos del núcleo residual de LhKNOT reveló que, además del propio motivo de nudos, también posee un clip de catión-polar-catión (CPC).

El inhibidor de cisteína es una sustancia natural utilizada para prevenir el daño oxidativo y promover el crecimiento celular. Para la inmunidad, el papel de la cisteína se refleja principalmente en mejorar la inmunidad del cuerpo y prevenir la inflamación y la infección.

En los últimos años, cada vez más estudios han demostrado que la cisteína puede desempeñar un papel importante en el sistema inmunitario. Puede promover la proliferación de células inmunitarias, mejorar la resistencia del cuerpo a los patógenos y reducir el riesgo de infección. Además, la cisteína también puede reducir la producción de radicales libres y mejorar la salud general del sistema inmunológico, mejorando así la inmunidad del cuerpo.

Aunque el efecto de la cisteína sobre la inmunidad es muy significativo, cuando se usa un inhibidor de cisteína, debe usarse con precaución. Debido a que el inhibidor cisteína generalmente se usa para tratar ciertas enfermedades, como enfermedades cardiovasculares, artritis, etc., si se abusa, afectará la inmunidad y hará que el sistema inmunológico del cuerpo se debilite, aumentando así el riesgo de infección.

En conclusión, existe una relación inextricable entre el inhibidor de cisteína y la inmunidad. Aunque los inhibidores de cisteína pueden promover la salud del cuerpo, también deben usarse bajo la supervisión de un médico, y se debe prestar atención para mantener una dosis razonable para mantener la salud del cuerpo. Se puede ver que necesitamos mejorar la inmunidad. Cistanche puede mejorar significativamente la inmunidad, porque la ceniza de carne contiene una variedad de ingredientes biológicamente activos, como polisacáridos, dos hongos, Huang Li, etc. Estos ingredientes pueden estimular varios sistemas inmunológicos. células similares a células, aumentando su actividad inmunológica.

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Se cree que el motivo del clip CPC facilita la actividad antimicrobiana en las proteínas de unión a heparina. Sorprendentemente, la mayoría de los ICK probados también poseen el motivo de clip CPC, incluidas 75 proteínas de nudos de plantas y artrópodos de buena fe que comparten una secuencia alta y / o una similitud estructural con LhKNOT. Al igual que LhKNOT y estas otras proteínas de 75 nudos, incluso el péptido antifúngico Drosophila Drosomicina, un gen objetivo canónico de la vía inmune TollNF-kappa B de la mosca, contiene este motivo de clip CPC. Juntos, nuestros resultados sugieren una posible función defensiva para el parasitoide LhKNOT.

La prevalencia del motivo de clip CPC, intrínseco al nudo de cisteína dentro de las proteínas knottin examinadas aquí, sugiere que la topología 3D resultante es importante para sus funciones bioquímicas. El clip de CPC es probablemente un motivo estructural altamente conservado que se encuentra en muchas proteínas diversas con capacidad de unión a heparina informada, incluidas las proteínas amiloides. Los nudos son objetivos para el desarrollo de fármacos terapéuticos, y la comprensión de sus relaciones estructura-función impulsará el diseño de nuevos fármacos.

Palabras clave:

Huésped-parásito; drosófila; leptopilina; nudo de cisteína; pliegue anudado; Clip de catión-polar-catión; péptido antimicrobiano; motivo de unión a heparina; mini proteínas.

1. Introducción

En las interacciones huésped-parásito, el parásito debe proporcionar una presión ofensiva y, al mismo tiempo, mantener vivo al huésped para mantener una descendencia viable [1,2]. Estos objetivos contradictorios han llevado a la evolución de factores de virulencia con diversas estrategias moleculares manteniendo una alta especificidad de huésped. Los himenópteros parásitos constituyen más de un millón de especies, son ubicuos en el planeta y parasitan una variedad de artrópodos, principalmente insectos [3].

Las avispas que atacan a los insectos huéspedes han desarrollado una variedad de estrategias bioquímicas y de comportamiento para tener éxito y permanecen bajo una presión coevolutiva constante con sus huéspedes [4–7].

El sistema Leptopilina/Drosophila es un modelo emergente para comprender los fundamentos moleculares de las respuestas anti-avispas y las estrategias de virulencia de las avispas [8]. Para suprimir la inmunidad del huésped, las hembras de Leptopilina introducen factores de veneno en sus huéspedes larvarios durante la oviposición [4,9,10]. Los mecanismos inmunitarios innatos bien definidos en Drosophila [11–13] brindan un contexto valioso para estudiar los efectos de estos factores del veneno de avispa.

La infección por el especialista L. boulardi activa los brazos inmunes humoral y celular controlados por la vía de señalización Toll-NF-κB conservada de la mosca. La expresión de genes de péptidos antimicrobianos (AMP), como la drosomicina, se activa después de la infección por L. boulardi [14]. La señalización Toll-NF-κB también controla la división y el desarrollo de las células sanguíneas [15,16], pasos que controlan la encapsulación y la muerte de los huevos de avispa [17,18].

Por el contrario, la infección por el heteroátomo generalista de L. suprime ambas vías inmunitarias [9,14] y casi todas las células sanguíneas de las larvas son destruidas por factores del veneno de avispa [19,20].

En este estudio, analizamos la estructura teórica de un péptido heteroátomo de L., llamado LhKNOT, identificado dentro de secreciones similares a orgánulos en el veneno de heteroátomo de L. pero no en el veneno de L. boulardi [21]. Estos orgánulos inmunosupresores incluyen más de 350 proteínas y poseen un perfil proteómico de microvesículas eucariotas y una plétora de proteínas relacionadas con la inmunidad [21–23].

LhKNOT adopta el motivo "Inhibidor Cysteine ​​Knot" (knottin) [24]. El motivo knottin está ampliamente conservado en una variedad de taxones, desde plantas [25,26] hasta caracoles [27]. Estos pequeños péptidos (<60 residues) are functionally diverse. Knottins are used offensively, in spider toxins [28] and cone snail venom [27], as well as defensively, e.g., in wound healing activities of cacti [26], and antimicrobial host defense in plants [25,26,29] and invertebrates [30].

La amplia gama de actividad de knottin se atribuye a la estructura general de su pliegue, que se basa únicamente en un motivo conservado de seis residuos de cisteína que aprovecha la capacidad única de estas cisteínas para formar puentes disulfuro. El motivo knottin ocurre cuando se observan residuos de cisteína en un patrón C1-C2-C3-C4-C5-C6 (donde "-" representa varios residuos muy variables).

Luego se forman puentes disulfuro de manera conservada de manera similar (C1-C4, C2-C5 y C3-C6), lo que da como resultado C1-C4 y C{{ 8}}C5 formando un macrociclo, mientras que C3-C6 ocurre dentro de este macrociclo, lo que resulta en una topología "anudada". Como esta topología anudada depende en gran medida de la conservación de los seis residuos de cisteína, el motivo knottin permite una variación significativa en la secuencia general [30]. La combinación de su pequeño tamaño, alta tolerancia a la variación de la secuencia y la estabilidad estructural observada ha convertido a los knottins en un andamio popular para el diseño de fármacos [30], potencialmente incluso para tratamientos contra el cáncer [31].

Varias líneas de evidencia experimental demuestran o sugieren capacidades antimicrobianas para diferentes nudos [25,26,29,30,32,33] o interacciones de canales iónicos controlados [28,34], aunque los mecanismos moleculares por los cuales se llevan a cabo estas funciones no están claros. bien entendido. Además, no se sabe si estas funciones antimicrobianas comparten un mecanismo de acción común.

Dado su descubrimiento a partir de partículas inmunosupresoras de parásitos de moscas, nuestros objetivos fueron (a) identificar secuencias relacionadas con LhKNOT de diversos organismos, incluidos los parasitoides L. heteroatom, L. boulardi y Ganaspis, que atacan a Drosophila y (b) identificar cualquier motivo(s) estructural(es) novedoso(s) presente(s) en los homólogos de LhKNOT conocidos o nuevos con la esperanza de que la predicción de tal motivo conservado pueda sugerir posibles funciones para LhKNOT y guiar futuras investigaciones experimentales.

Mostramos que un modelo teórico de LhKNOT posee las características del pliegue de knottin con tres láminas beta antiparalelas, restringidas por puentes disulfuro. El modelo LhKNOT contiene un clip CPC, capaz de interactuar con la heparina, un glicosaminoglicano (GAG) cargado negativamente de valor médico significativo. LhKNOT también tiene el potencial de interactuar con otros GAG, como el queratán sulfato (un GAG altamente sulfatado, similar a la heparina) y el ácido hialurónico (el único representante de GAG ​​que no requiere sulfatación) [35].

Además, los homólogos estructurales de LhKNOT (es decir, proteínas de motivo de nudos de buena fe) también poseen el motivo de clip CPC que puede acoplarse con heparina. Sorprendentemente, al igual que LhKNOT y estas otras proteínas de nudos de buena fe, incluso el péptido antifúngico Drosophila Drosomicina comparte este motivo de clip CPC en su estructura. Este motivo también se identificó en 41 de los 46 homólogos de LhKNOT adicionales de L. heteroatom, L. boulardi y Ganaspis spp. avispas con éxito en D. melanogaster.

Estas observaciones basadas en silico sugieren que el motivo del clip CPC, inherente a muchos nudos, puede proporcionar la base estructural para modificar las funciones inmunitarias o de virulencia. Especulamos sobre una posible función antimicrobiana o relacionada con la virulencia de la avispa LhKNOT. La abundancia del pliegue de knottina y su concurrencia con el motivo de clip CPC en la mayoría de los péptidos de knottina recientemente identificados de tres parasitoides de Drosophila sugiere un papel importante aún por determinar para ellos en la fisiología del parasitoide y/o en el huésped-parásito. interacciones.

2. Resultados
2.1. La secuencia LhKNOT muestra similitud con los péptidos antimicrobianos de insectos y plantas

Una búsqueda BLASTp de las bases de datos nr y TSA utilizando la secuencia LhKNOT de longitud completa (60 aminoácidos) mostró un número limitado de aciertos significativos, principalmente anotados como "péptidos antimicrobianos", de plantas e insectos. También se identificaron algunas secuencias fúngicas. Todos los resultados mostraron menos del 60 por ciento de identidad de aminoácidos con LhKNOT. La principal coincidencia para LhKNOT en la base de datos nr fue un péptido antimicrobiano del escarabajo común, Callosobruchus maculates, mientras que la principal coincidencia en la base de datos de la TSA fue un péptido antimicrobiano del ácaro del rizo del trigo Aceria Coachella.

La conservación fue más prominente en la región del único motivo de secuencia asociado con LhKNOT, la firma del 'péptido antifúngico' anudado con cisteína (dominio pfam11410, E=2.8 × 10-3). Después de ejecutar PSI-BLAST para la detección de homólogos remotos, se revelaron secuencias adicionales. PSI-BLAST mostró resultados similares con la planta de hielo común, Mesembryanthemum crystallinum; ácaros rojos, Dinothrombium tinctorium; avispa parasitoide, Trichogramma pretiosum; haga clic en escarabajo, Ignelater luminoso; avispa parasitoide, Trichogramma brassicae; escarabajo común del polen, Brassicogethes aeneus; barrenador del fresno, Agrilus planipennis; y mosca de sierra, Neodiprion lecontei.

Utilizando el servidor web HMMER basado en modelos ocultos de Markov como método alternativo para detectar homólogos remotos, identificamos cinco ataques de hongos de Akanthomyces lecanii, Cordyceps javanica, Cordyceps confragosa, Rosellinia necatrix y Beauveria bassiana.

Una búsqueda de secuencias similares en el PDB recuperó solo dos resultados significativos, uno para un péptido antifúngico de tipo knottin Alo-3 del insecto Acrocinus longimanus y el segundo del péptido pB1 de cicatrización de heridas limitado por disulfuro de Pereskia bleo. Los detalles de todos los homólogos cercanos y remotos identificados utilizando los diferentes enfoques de similitud de secuencia se resumen en la Tabla complementaria S1.

Una alineación de LhKNOT con las estructuras conocidas de las knottinas típicas, así como con los homólogos identificados, mostró la conservación de las seis cisteínas que forman los tres puentes disulfuro en LhKNOT (Figura 1A). En su extremo N, LhKNOT contiene un segmento helicoidal largo que se prevé que funcione como una secuencia señal; internamente, contiene tres hojas beta, como se esperaba de la estructura secundaria de los péptidos de knottina (Figura 1B).

Además, una evaluación de la similitud de secuencia de LhKNOT dirigida a los transcritos disponibles de L. heteroatom y L. boulardi y de otro parasitoide de Drosophila, Ganaspis spp. (ver Métodos), reveló una gran cantidad de secuencias relacionadas. Para L. heterotoma (Lh14), identificamos 16 proteínas de nudos Lh14 adicionales (Tabla complementaria S2).
Para L. boulardi, identificamos 22 proteínas de nudos (Tabla complementaria S3). De manera similar, se identificaron seis homólogos de LhKNOT de Ganaspis hookeri (G1) y se encontraron dos homólogos de LhKNOT en las predicciones de proteínas realizadas a partir del genoma de G. brasiliensis (VA) (Tabla complementaria S4). La Figura 2 muestra la conservación de estas secuencias de nudos del parasitoide con LhKNOT. Por lo tanto, al menos los pocos parasitoides de Drosophila muestreados en este estudio parecen codificar múltiples proteínas de knottina. Estas avispas pueden codificar péptidos de knottina adicionales, y se necesitan enfoques proteómicos/bioinformáticos sistemáticos para obtener una lista completa. Las funciones de estos nudos putativos en la fisiología del parásito siguen siendo desconocidas.

Figura 1. (A) Alineación de secuencias múltiples de LhKNOT (arriba) y homólogos en la familia knottin (de arriba a abajo): Mesembryanthemum crystallinum (planta; antimicrobiano; NCBI ID: AAC19399), Aceria tosichella (ácaro; antimicrobiano; NCBI ID :MDE48292.1), Callosobruchus maculatus (escarabajo; desconocido; NCBI ID:VEN35376.1), Dinothrombium tinctorium (ácaro; desconocido; NCBI ID:RWS16713.1), Trichogramma pretiosum (Alo{{10}} como; avispa parasitoide; antimicrobiano; ID de NCBI: XP_014233229.1), Ignelater luminosus (escarabajo; desconocido; ID de NCBI: KAF2884324.1), Trichogramma brassicae (avispa parasitoide; desconocido; ID de NCBI: CAB{{27 }}{{30}}31014.1), Brassicogethes aeneus (escarabajo; desconocido; NCBI ID: CAH0563829.1), Agrilus planipennis (barrenador del fresno; antimicrobiano; NCBI ID : XP_018321119.1), Neodiprion lecontei (mosca de sierra; desconocido; NCBI ID: XP_015517007.2), Akanthomyces lecanii (hongo; antifúngico; Uniprot ID: A0A168C5L6), Cordyceps javanica (hongo; antifúngico ; ID de Uniprot: A0A545VVU1), Cordyceps confragosa (hongo; desconocido; ID de Uniprot: A0A179IJT7), Rosellinia necatrix (hongo; desconocido; Uniprot ID: A0A1S8A723), Beauveria bassiana (hongo; desconocido; Uniprot ID: A0A0A2VUF6), Acrocinus longimanus (Alo-3; escarabajo; antifúngico; PDB ID: 1Q3J) y Pereskia bleo (pB1; cactus; PDB ID: 5XBD). Los residuos idénticos se resaltan en rojo, mientras que los residuos químicamente similares se resaltan en amarillo. Las flechas negras denotan los residuos de cisteína conservados que son responsables del pliegue estructural de knottin, y la conectividad del puente disulfuro de los tres puentes disulfuro está marcada con números de color verde neón.

X y XX denotan el número variable de residuos en el extremo N y C, respectivamente. Los elementos de la estructura secundaria del LhKNOT modelado se muestran en la parte superior. y T representan -hebra y -vuelta, respectivamente. (B) Predicción de estructura secundaria para LhKNOT, que muestra un segmento helicoidal largo (cilindro rosa; péptido señal) seguido de tres cadenas beta (flechas amarillas). Esta estructura secundaria sigue la firma canónica de Knottin [36]. (C) Un prototipo del pliegue estructural knottin de la base de datos KNOTTIN [36] (permiso para reproducir esta imagen otorgado por el Dr. Jean-Christophe Gelly, INSERM, octubre de 2019). Los dos puentes disulfuro (verde) forman un macrociclo, mientras que un tercero (azul) pasa por el centro dando a la proteína su topología anudada homónima. (D) La estructura terciaria predicha de LhKNOT, que muestra la topología anudada y el motivo de cisteína conservado, los residuos de cisteína forman puentes disulfuro en el patrón conservado que se observa en toda la familia de nudos (C1 -C4 y C2 -C5 forman el macrociclo, C3 -C6 pasa por el centro).

Figura 2. (A) Alineación de secuencias múltiples de LhKNOT (arriba) y homólogos en Lh14. (B) Alineación de secuencias múltiples de LhKNOT (arriba) y homólogos en L. boulardi. La X marcada en el recuadro verde corresponde a las siguientes inserciones en dos secuencias Lb17: Lb: GISX01151661.1 X=SQAPPPTPEPFHPPGTPP; Lb: GISX01151653.1 X=SQLTSPRSTFPPTGSTIPSIITT. (C) Alineación de secuencias múltiples de LhKNOT (arriba) y homólogos en Ganaspis spp. Los residuos idénticos se resaltan en rojo, mientras que los residuos químicamente similares se resaltan en amarillo.

Las flechas negras denotan los residuos de cisteína conservados que son responsables del pliegue estructural de knottin, y la conectividad del puente disulfuro de los tres puentes disulfuro está marcada con números de color verde neón. Los elementos de la estructura secundaria del LhKNOT modelado se muestran en la parte superior. y T representan -hebra y -vuelta, respectivamente. Se agregan estrellas grises en la parte superior de los bloques de secuencias, los residuos anteriores representan residuos modelados con conformaciones alternativas.

2.2. La estructura tridimensional de LhKNOT

El pliegue estructural típico de un péptido de knottina se define por seis cisteínas involucradas en tres enlaces disulfuro para formar una hoja beta antiparalela de tres cadenas anudadas con cisteína [25]. Una característica importante de este pliegue es la conectividad de los residuos de cisteína para formar los puentes disulfuro y el puente disulfuro de las cisteínas 3 y 6 pasando por los disulfuros 1–4 y 2–5 para formar un nudo especial de disulfuro a través de disulfuro (Figura 1A, C ).

Este disulfuro, a través de una característica de nudo de disulfuro, distingue el pliegue de nudos de otras proteínas de nudo de cisteína. Además de las cisteínas conservadas, el resto de la secuencia de aminoácidos puede ser bastante variable y, por lo tanto, solo se identifica un número limitado de nudos mediante enfoques de similitud de secuencia para LhKNOT (consulte la sección anterior y la Tabla complementaria S1).

Los algoritmos de reconocimiento de pliegues y los enfoques de modelado basados ​​en plantillas, por otro lado, recuperaron varios nudos diversos como candidatos adecuados para modelar LhKNOT. Entre los diversos modelos de LhKNOT generados, el mejor modelo fue un modelo de LhKNOT basado en varias plantillas creado con el programa HHpred [37] con restricciones estructurales derivadas de las tres plantillas principales, Alo-3 (PDB: 1Q3J) [ 30], omega-agatoxina-IVA (PDB: 1IVA) [28] y PAFP-S (PDB: 1DKC) [25]. Los perfiles de energía basados ​​en el conocimiento calculados con ProSA-web [38] para este modelo seleccionado mostraron bajas energías y una puntuación z de −4,53, que es comparable a las estructuras resueltas.

Verify3D [39] evaluó este modelo basado en múltiples plantillas con una puntuación de aprobación (100.00 por ciento de los residuos en el modelo tienen un 3D promedio-1 Puntuación D mayor o igual a 0,2). La puntuación VoroMQA [40] de 0,325 es probablemente un reflejo del pequeño tamaño del péptido y las puntuaciones de las plantillas estaban en el mismo rango (Figura complementaria S1).

Este modelo basado en múltiples plantillas tipifica el pliegue de knottin con tres cadenas beta antiparalelas, restringidas por puentes disulfuro y la conectividad esperada de los puentes disulfuro (Figura 1D). KNOTER3D, una herramienta en la base de datos KNOTTIN [36] corroboró que este modelo tiene un pliegue de nudos de buena fe y confirmó el patrón de enlace disulfuro previamente identificado en la Figura 1D.

2.3. LhKNOT muestra la presencia de un clip CPC, capaz de interactuar con heparina y otros GAG

Para buscar funciones potenciales de LhKNOT, se investigaron las correlaciones estructura-función de homólogos estructurales cercanos de LhKNOT. Una proteína knottin del cactus Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26] posee un motivo de unión a heparina conocido como clip CPC. Este motivo estructural forma un clip restringido geométricamente de dos residuos catiónicos y uno polar que interactúan con la heparina mediante puentes de sal y enlaces de hidrógeno que lo sujetan en su posición dentro de la superficie cargada positivamente del clip [41].

Una superposición estructural del nudo de cactus y LhKNOT mostró que las dos estructuras son muy similares, con una diferencia general de menos de 2 Å. El análisis de acoplamiento de LhKNOT con heparina, usando los parámetros específicos de ClusPro para heparina como ligando, reveló que para LhKNOT, las interacciones polares que se ajustan al motivo de clip CPC ocurren en los residuos R1-S3-R14 (Figura 3A) .

Las distancias medidas (tanto entre los carbonos alfa como los centros de masa de las cadenas laterales de los residuos participantes) diferían de las del clip de CPC en menos de 1Å, lo que sugiere la presencia de un clip de CPC putativo en LhKNOT (Figura 3B). La electrostática superficial del LhKNOT modelado también mostró la presencia del esperado bolsillo de unión catiónica formado por el clip CPC [41,42] (Figura 3C).

Para evaluar la capacidad del clip CPC para interactuar con otros GAG, se realizó un análisis de acoplamiento adicional con LhKNOT y sulfato de queratán (PDB ID: 1KES) y con LhKNOT y ácido hialurónico (PDB ID: 1HYA). En ambos casos, la superficie de unión con carga positiva creada por el clip CPC se une a las moléculas con carga negativa. Ligplots generados por PDBSum confirmaron una asociación de los GAG con los residuos formadores de CPC (Figuras complementarias S2 y S3).

2.4. Otros homólogos estructurales de LhKNOT también contienen el motivo de clip CPC

La presencia del clip CPC tanto en LhKNOT como en su homólogo estructural de Pereskia bleo (pB1) sugirió la posibilidad de una conservación más amplia del clip CPC dentro de la familia knottin. Un análisis de 21 homólogos estructurales cercanos de LhKNOT con PDB resueltos experimentalmente en la base de datos KNOTTIN reveló que, en todos los casos, los péptidos poseen el motivo de clip CPC. Para la mayoría de los péptidos (p. ej., T. tridentatus), los parámetros del motivo se desviaron menos de 1 Å del pliegue del nudo central, mientras que para otros (p. ej., los nudos ofensivos), la desviación fue de hasta un margen de 3 Å (Tabla complementaria S5). De manera similar, las proteínas de knottina modeladas de los homólogos identificados mostraron que casi todos ellos poseían el clip CPC.

Dieciséis secuencias adicionales de L. heteroatom, 22 secuencias de L. boulardi y 8 secuencias de Ganaspis spp., sin estructuras 3D conocidas, se modelaron y analizaron para determinar la presencia del motivo de clip CPC. Mientras que 13 de los 16 nudos putativos de L. heteroatom y 20 de los 22 nudos putativos de L. boulardi revelaron un motivo de clip CPC, todas las secuencias de Ganaspis contenían el clip CPC (Tabla complementaria S5). Curiosamente, los siete homólogos que no exhibieron un motivo de clip CPC pertenecen a (a) la secuencia del escarabajo del polen común (B. aeneus (CAH0563829.1), (b) la secuencia fúngica R. necatrix (A0A1S8A723) y (c) tres L. heterotoma knottins 4,5,6 y L. boulardi knottins 3 y 20 (Tabla complementaria S5).

Una encuesta de nudos en la base de datos KNOTTIN, no relacionada con LhKNOT, pero representativa de varios taxones (caracol cono, cangrejo herradura, insecto, planta, escorpión y araña), mostró el motivo del clip CPC. En todos los casos, el perfil electrostático de la superficie del motivo del clip CPC está cargado positivamente, probablemente para facilitar las interacciones con la heparina cargada negativamente (Figura 4). Sin embargo, de manera similar a los nudos de escarabajos, hongos y avispas descritos anteriormente, el clip CPC no se identificó en nudos de la planta ciclotida y esponjas (Tabla complementaria S5).

Figura 4. Resultados del acoplamiento de heparina y electrostática superficial de (A) péptido antifúngico de Phytolacca americana (PFAP-s; planta; PDB: 1DKC), (B) omega-agatoxina selectiva del canal de calcio de Agelenopsis aperta (Omega-agatoxina IV-A ; araña; PDB: 1IVA), (C) péptido antifúngico de Acrocinus longimanus (Alo-3; escarabajo; PDB: 1Q3J), (D) péptido cicatrizante de Pereskia bleo (pB1; cactus; PDB: 5XBD) , (E) LhKNOT, (F) péptido antifúngico "Drosomycin" de Drosophila spp. (drosomicina; mosca; PDB: 1MYN), (G) Conotoxina GS (Conotoxina GS; caracoles cónicos; PDB:1AG7), (H) péptido antimicrobiano Taquistatina A aislado de cangrejos herradura (Taquistatina A; cangrejos herradura; PDB:1CIX) y (I) Clorotoxina, una pequeña toxina de escorpión de Leiurus quinquestriatus (clorotoxina; escorpión; PDB:1CHL) que muestra el motivo de clip catiónico CPC. Cifras orientadas a mostrar mejor la estructura del clip CPC. Los potenciales electrostáticos de la superficie se clasifican en colores desde −4 kT/e (rojo) hasta más 4 kT/e (azul).

2.5. El análisis mutacional in silico del clip de CPC LhKNOT revela un clip de CPC secundario

Se investigaron modelos de tres mutantes LhKNOT in silico (R1A, S3A, R14A) para comparar las interacciones de unión de proteínas de tipo salvaje y mutantes. En el caso del mutante R14A, se demostró que la heparina estaba sorprendentemente asociada con un clip de CPC secundario que involucraba los residuos R1, S3 y R30 en lugar del motivo R1, S3 y R14 en el tipo salvaje (Figura complementaria S4). Sin embargo, los mutantes dobles o triples (R14A-R1A; R14A-S3A-R1A) no mostraron una interacción con ninguno de los residuos de motivo de clip CPC primario o secundario (Figura complementaria S4C, D).

Sin embargo, los mutantes in silico con la mutación R1A (que interrumpieron los motivos de clip de CPC primario y secundario) mostraron heparina asociada con R29 y R30, ya que proporcionan la única superficie catiónica restante (Figura complementaria S4C, D). Curiosamente, el ligando prefiere asociarse con el motivo de clip CPC, tanto en el caso de los clips primarios como secundarios, sobre esta superficie catiónica adicional cuando el motivo está disponible, lo que sugiere que la interacción específica del clip CPC puede permitir una asociación más estable sobre una interacción electrostática no específica.

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