El análisis in silico de un péptido del veneno del parasitoide de Drosophila revela la prevalencia del motivo de clip de catión-polar-catión en las proteínas Knottin Parte 2

2.6. Un clip de CPC también está presente en el péptido antimicrobiano drosomicina

A diferencia de LhKNOT, la estructura de Drosomicina contiene un pliegue diferente con una hélice alfa y una lámina beta de tres cadenas retorcidas, que está estabilizada por tres puentes disulfuro [43]. Este motivo estructural, denominado "motivo estabilizado con cisteína", también se encuentra en otras proteínas de defensa del huésped, como la defensina A antibacteriana de insectos, toxinas de escorpión, tioninas vegetales y defensinas vegetales antifúngicas [43,44].

-helix es un polipéptido con alta actividad biológica, que puede activar el sistema inmunológico humano y mejorar la inmunidad humana, previniendo y tratando así diversas enfermedades. Los estudios han demostrado que -helix tiene el efecto de mejorar la función inmunológica, puede mejorar en gran medida la capacidad fagocítica de los macrófagos y la actividad de las células T, mejorar la resistencia del cuerpo a los microorganismos patógenos externos, reducir la sensibilidad del cuerpo a los entornos adversos y promover la salud.

La inmunidad es crucial para la salud humana. Puede ayudarnos a resistir diversas enfermedades, mantener la forma física y mejorar la resistencia a las enfermedades. Sin embargo, las personas viven en un entorno lleno de diversas exposiciones a patógenos y contaminación ambiental, y la inmunidad se ve fácilmente afectada. Por lo tanto, mejorar la inmunidad es muy necesario para mantener la salud humana.

Como un péptido activo natural, -helix no solo puede regular el sistema inmunológico y mejorar la inmunidad, sino que también desempeña un buen papel en la prevención de enfermedades cardiovasculares y trastornos metabólicos, mejorando la función hepática, reduciendo los lípidos y el azúcar en la sangre, y mejorando la fuerza física y anti -Capacidad de fatiga. Por lo tanto, -helix se ha utilizado ampliamente en los campos de la medicina, productos para el cuidado de la salud y cosméticos, ha logrado efectos notables y ha sido muy bien recibido.

En resumen, -helix está estrechamente relacionado con la inmunidad humana, puede estimular la inmunidad humana y desempeña un papel importante para garantizar la salud y la longevidad humanas. En la vida y el trabajo futuros, debemos mejorar activamente la inmunidad, mejorar los hábitos de vida, el ejercicio y los ajustes de la dieta de manera adecuada, considerar el uso de -helix para mejorar la inmunidad y enfrentar de manera más activa los desafíos y oportunidades futuros. Se puede ver que necesitamos mejorar la inmunidad. Cistanche puede mejorar significativamente la inmunidad porque los polisacáridos en Cistanche pueden regular la respuesta inmunitaria del sistema inmunitario humano, mejorar la capacidad de estrés de las células inmunitarias y mejorar el efecto bactericida de las células inmunitarias.

Haga clic en el suplemento de cistanche deserticola

Dada la función antimicrobiana conocida de la drosomicina y su "motivo estabilizado con cisteína" relacionado [43,44], examinamos la posibilidad de una base común para la actividad antimicrobiana y las relaciones estructura-función compartidas con LhKNOT para comprender mejor la importancia potencial de este motivo. en LhKNOT en el contexto de la defensa del anfitrión.

A pesar de un pliegue estructural ligeramente diferente, la drosomicina se superpone dentro de un RMSD de 2,2 Å tanto de LhKNOT como de pB1 (Figura 5A). Cuando el análisis de clip de CPC anterior se amplió a Drosomicina, los resultados revelaron la presencia del motivo de clip de CPC también en Drosomicina. El motivo del clip CPC en Drosomicina (R6-S4-K38) se encuentra dentro de una desviación de 2 Å de los parámetros del motivo (Figura 5B, Tabla complementaria S5).

Además, la electrostática de la superficie de la drosomicina confirmó la formación del supuesto clip CPC de un bolsillo de unión catiónica como también se observó para LhKNOT y otros nudos (Figura 5C, Tabla complementaria S5).

Estos resultados sugieren que puede haber una similitud en el modo de acción de Drosomicina y LhKNOT y que la bioquímica integrada en este motivo estructural puede impulsar la función antimicrobiana en ambos péptidos.

Figura 5. (A) Superposición de LhKNOT (azul), péptido cicatrizante de Pereskia bleo (bronceado; pB1; cactus; PDB: 5XBD) y Drosomicina (verde; Drosomicina; mosca; PDB: 1MYN). (B) Distancias medidas en PyMOL entre los centros de masa de los residuos participantes (pseudoátomos grises) en la interacción drosomicina-heparina. Las distancias caen dentro de 2 Å de los rangos de valores del motivo del clip CPC. (C) Electrostática superficial de drosomicina (mosca; PDB: 1MYN), que muestra la superficie de unión cargada positivamente formada por el clip CPC donde se acopla la heparina. Los potenciales electrostáticos de la superficie se clasifican en colores desde −4 kT/e (rojo) hasta más 4 kT/e (azul).

3. Discusión y especulación

Las funciones bioquímicas de las proteínas se ven facilitadas por sus estructuras generales, que, según se informa, están entre 3 y 10 veces mejor conservadas que sus estructuras primarias [45]. En consecuencia, las alineaciones de secuencias a menudo se quedan cortas en la investigación del potencial funcional de proteínas como las knottinas, donde las estructuras primarias variadas pueden oscurecer las relaciones estructura-función compartidas.

Los métodos in silico facilitan un análisis amplio de las posibles correlaciones estructura-función para pliegues tan interesantes [46–50]. Nuestro análisis detallado de la estructura de LhKNOT y sus homólogos estructurales respalda la idea de que esta proteína del parásito tiene las características de un péptido de knottina con funciones en la defensa del huésped: (a) las coincidencias más cercanas a LhKNOT son los péptidos antimicrobianos; (b) la firma Pfam de LhKNOT lo describe como un "péptido antifúngico" anudado con cisteína; y (c) está presente un clip CPC.

El análisis de un inicio de sesión pB1 del péptido de curación de heridas de knottin del cactus frondoso Pereskia bleo reveló inicialmente la presencia de un clip de CPC, una firma estructural conservada de proteínas de unión a heparina [42]. Tiene funciones relacionadas con la inmunidad y la señalización en la cicatrización de heridas y el cáncer, y se usa como anticoagulante [51].

Los GAG están presentes en las superficies de las células animales y se han convertido en un objetivo cada vez más popular de estudios que van desde los clínicos hasta los cosméticos [52]. El motivo clip CPC de las proteínas de unión a heparina se considera el motivo mínimo requerido para la afinidad de unión a heparina y se define por relaciones espaciales específicas entre tres residuos, dos catiónicos (Arg/Lys) y uno polar (Asn, Gln, Ser, Thr, Tiro).

Este motivo de clip CPC se define por las distancias entre los carbonos de los residuos involucrados, así como las distancias entre los centros de masa de los residuos involucrados. Se sabe que las proteínas de unión a heparina interactúan promiscuamente con otros sustratos cargados negativamente, sobre todo con las membranas superficiales de los microbios [41].

Como resultado, las proteínas de unión a heparina pueden exhibir actividad antimicrobiana en diversos grados [53]. Si bien los mecanismos precisos de este potencial antimicrobiano no están bien definidos, se ha planteado la hipótesis de que el clip CPC puede facilitar estas interacciones proteína-microbio [41]. Están surgiendo nuevos roles potenciales de la unión a heparina, como en las posibles intervenciones terapéuticas para la amiloidogénesis [54], por lo que comprender los determinantes estructurales del clip CPC en diversas proteínas puede ser clave para delinear el mecanismo de la interacción y su interrupción.

Una pista sobre un posible mecanismo antimicrobiano para LhKNOT proviene de nuestro hallazgo de que su nudo de cisteína inhibitorio y los de otros nudos examinados aquí tienen un clip de CPC intrínseco a sus pliegues (Tabla complementaria S5).

Se ha observado que los requisitos estructurales y biofísicos para la capacidad de las proteínas de unión a heparina para interactuar con la heparina son sorprendentemente similares a las características estructurales de muchos AMP conocidos [53]. Por lo tanto, el motivo del clip CPC puede cumplir los criterios para estos dos requisitos [41].

Nuestro descubrimiento de este motivo de clip de CPC no solo en LhKNOT sino también en otras 75 proteínas de knottin relacionadas o no relacionadas (Tabla complementaria S5) sugiere que este motivo de clip de CPC puede ser una característica altamente conservada de las proteínas de knottin.

La ocurrencia coincidente del motivo de clip CPC dentro de la estructura del nudo de cisteína en diversas proteínas sugiere que el motivo de clip CPC en sí mismo puede ser la base de la función antimicrobiana. Sin embargo, debido a que este motivo estructural también se identifica en nudos ofensivos (Tabla complementaria S5), también puede desempeñar un papel más general a través de este motivo de interacción de clip CPC más generalizado.

El descubrimiento de un motivo de clip de CPC putativo en Drosomicina es intrigante, ya que arroja luz sobre el posible mecanismo de acción de este péptido antifúngico y respalda una posible función antimicrobiana para el propio motivo de clip de CPC. Estudios previos han demostrado la importancia de los residuos R6 y K38 de Drosomicina, que forman parte de su motivo de clip CPC (R6-S4-K38), por su potencial antifúngico; las alteraciones de estos residuos reducen la actividad antifúngica [55]. Nuestro análisis estructural de la avispa LhKNOT y sus similitudes con Drosophila Drosomicina ofrece posibles conocimientos sobre la capacidad de L. heterotoma para suprimir ampliamente la vía TollNF-κB en D. melanogaster y, sin embargo, tener éxito en huéspedes inmunocomprometidos.

En ausencia de una vía inmune Toll funcional y, en consecuencia, sin la producción de drosomicina, las larvas de Drosophila a menudo pueden sucumbir a los patógenos oportunistas [11,13,56]. Las supuestas actividades antimicrobianas de LhKNOT podrían defender al huésped de los patógenos microbianos oportunistas en las larvas y pupas en desarrollo infectadas por avispas e inmunocomprometidas. Alternativamente, al igual que la drosomicina, LhKNOT podría inducir la apoptosis de los hemocitos [57]. Los EV de L. heteroatom ingresan a los hemocitos después de la infección [58], y sus actividades dentro de los EV comprometen la encapsulación [19,21].

Se ha demostrado que el clip CPC se asocia promiscuamente con GAG [41], que, sin embargo, son ubicuos en insectos, incluida Drosophila [59]. Los GAG de sulfato de heparina en moscas sirven como receptores de factores de crecimiento y participan en la creación y el mantenimiento de gradientes morfogénicos [60]. También se ha demostrado que el clip CPC se asocia promiscuamente con lipopolisacáridos (LPS) [41]. Los LPS bacterianos, al ser los principales componentes de la superficie de las bacterias Gram-negativas, son estimuladores extremadamente potentes de la respuesta inmunitaria innata en varias especies eucariotas, incluidos los insectos [61]. Los GAG en Drosophila también controlan la unión de la proteína C, un determinante de la virulencia del estreptococo del grupo B [62].

Por lo tanto, es posible que un clip de CPC que contenga LhKNOT y Drosomicina (y posiblemente otros AMP de mosca, como Defensin [63]) pueda modular la señalización inmunitaria (y/o la unión a las proteínas de virulencia del patógeno), afectando de manera similar al patógeno bacteriano/metazoo. resultado del parásito. Estudios previos han demostrado que tres nudos homólogos (Alo-1, 2, 3) del escarabajo arlequín Acrocinus longimanus son activos contra la levadura Candida glabrata [30]. Además, un péptido candidacida formador de poros, la psacoteasina, ataca a la Candida albicans [64]. Por último, un hongo de la roya patógeno de las plantas, Melampsora, produce un péptido knottin como su efector candidato [65].

Nuestro hallazgo de que múltiples péptidos putativos de knottina pueden ser secretados por avispas parasitoides adultas de Drosophila fue inesperado e intrigante. Si bien no se conocen sus funciones, la posible existencia de una familia de genes de knottin sugiere cierta redundancia en sus funciones que puede estar relacionada con la historia de vida del parásito. La exploración del pliegue estructural de knottin en knottins no relacionados y aún por descubrir demostrará ser valiosa. Nuestro trabajo proporciona una breve lista de residuos significativos para la actividad fisiológica propuesta para la investigación de proteínas de la familia Knottin. Dicha información puede incorporarse al descubrimiento y diseño racional de fármacos para enfermedades infecciosas y terapias relacionadas.

4. Métodos

4.1. Análisis de secuencia

Exploraciones iniciales de la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes (nr) del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein; consultada el 4 de abril de 2018), la base de datos de secuencias del Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) (https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/tsa; consultado el 16 de abril de 2018) [66], y Protein Data Bank (PDB; https://www.rcsb.org; consultado el 5 de julio de 2018) [67] con la secuencia de aminoácidos completa del péptido L. heteroatom knottin (GAJC01011813.1) utilizando NCBI BLAST (BLASTp; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast. cgi; consultado el 16 abril de 2018) [68] se utilizaron para recuperar secuencias de proteínas relacionadas en otros organismos. Se buscaron homólogos remotos utilizando BLAST iterativo específico de posición (PSI-BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi; consultado el 4 de abril de 2022) [69] y modelos ocultos de Markov (HMMER; https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer; consultado el 6 de abril de 2022) [70,71]. Las búsquedas BLAST se ajustaron al tamaño de palabra 2 y la matriz de puntuación BLOSUM45, mientras que los parámetros predeterminados se usaron para HMMER.

Para identificar homólogos de knottina en Leptopilina y Ganaspis spp. no accesible en las bases de datos de proteínas, se emplearon búsquedas dirigidas utilizando BLAST traducidos contra conjuntos de datos genómicos y transcriptómicos. Para identificar nudos de L. heteroátomo adicionales, el transcriptoma abdominal femenino de L. heteroátomo GAJC [72] y los transcriptomas de cuerpo entero de Ground GHUQ (acceso a GenBank: GHUP00000000; TSA: cepa de heteroátomo de leptopilina Lh14, escopeta de transcriptoma) y Space GHUP (Acceso GenBank: GHUQ00000000; TSA: cepa de heteroátomo de leptopilina Lh14, escopeta de transcriptoma) se buscó usando tblastn (umbral de valor e establecido en 1, BLOSUM62, filtro de baja complejidad habilitado, filtro de cobertura de consulta establecido en 20 por ciento ) contra LhKNOT.

Se realizaron búsquedas similares en los siguientes transcriptomas para identificar nudos de L. boulardi: transcriptoma abdominal femenino de L. boulardi GAJA [72] y los transcriptomas de cuerpo entero de Ground GITC (GenBank Accession: GITC00000000; TSA: Leptopilina boulardi cepa Lb17, escopeta de transcriptoma), Space GISX (acceso a GenBank: GISX00000000; TSA: Leptopilina boulardi cepa Lb17, escopeta de transcriptoma) y GGGI00000000 (abdomen/cabeza femenino) [73]. Además, las búsquedas específicas de Ganaspis spp. Se realizaron homólogos. Para G. hookeri, la GAIW00000000 TSA: Ganaspis spp.

Se buscó en el conjunto de datos G1 [74] (tblastn, umbral de valor electrónico establecido en 1, BLOSUM45, filtro de baja complejidad habilitado, filtro de cobertura de consulta establecido en 20 por ciento) mediante la consulta LhKNOT. Se utilizó la herramienta Expasy (web.expasy.org/translate/; consultada el 9 de diciembre de 2022) para traducir estas secuencias TSA [75]. Las secuencias peptídicas pronosticadas resultantes se curaron manualmente en función de la presencia del motivo de cisteína. Para G. brasiliensis, predicciones genéticas basadas en AUGUSTUS (http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus; consultado el 9 de abril de 2020) [76] a partir de la secuencia genómica parcialmente ensamblada (Gen-Bank: GCA{{15} }.1) se realizaron utilizando el módulo de entrenamiento del genoma de Nasonia vitripenis.

Las proteínas predichas resultantes se buscaron utilizando blastp (umbral de valor e establecido en 1, filtro de baja complejidad habilitado, filtro de cobertura de consulta establecido en 20 por ciento) contra LhKNOT. Las alineaciones y la visualización se realizaron utilizando Clustal Omega de EBI (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo; consultado el 9 de diciembre de 2022) [77] para confirmar la presencia del motivo knottin y para una mayor conservación de las secuencias

El conjunto de secuencias identificadas se alineó con LhKNOT para crear una alineación de secuencia múltiple usando T-COFFEE (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee; consultado el 9 de diciembre de 2022) [78] y se visualizó usando ESPript3 (https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php; consultado el 9 de diciembre de 2022) [79] para identificar cualquier residuo conservado y/o motivo(s) en las secuencias alineadas.

4.2. Análisis de estructura primaria LhKNOT

La secuencia LhKNOT también fue analizada por la base de datos de detección de dominio/motivo Base de datos de dominio conservada (CDD; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml; consultada el 6 de abril de 2018) y Pfam ( pfam.xfam.org; consultado el 6 de abril de 2018) para identificar cualquier dominio o firma de secuencia [80,81].

La secuencia se analizó más a fondo utilizando el software de predicción de secuencias de señales SignalP{{0}}.0 (https://services.healthtech.dtu. dk/service.php?SignalP-5 .0; consultado el 6 de abril de 2018) [82] y Phobius (https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobias; consultado el 6 de abril de 2018) [83] para identificar la ubicación de la secuencia de la señal y permitir una caracterización más precisa del péptido. El péptido maduro de 36 aminoácidos (con la secuencia señal predicha, residuos 1–24 eliminados) se usó para análisis posteriores.

La estructura secundaria del péptido se predijo utilizando el metaservidor Sympred (https://www.ibi.vu.nl/programs/sympredwww; consultado el 6 de abril de 2018) [84] y se analizó para confirmar su correspondencia con la estructura secundaria esperada. estructura para un pliegue de nudos: un segmento alfa-helicoidal inicial (secuencia de señal predicha) seguido de tres hebras beta antiparalelas.

4.3. Predicción y evaluación de la estructura terciaria de LhKNOT y sus homólogos

Los programas I-Tasser (https://zhanggroup.org/I-TASSER; consultado el 16 de abril de 2018) [85], Modeller (https://salilab.org/modeller; consultado el 16 de abril de 2018) [{{7 }}] y HHPred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred; consultado el 6 de abril de 2018) [37] para modelar la estructura terciaria de LhKNOT. Tres homólogos estructurales con el pliegue tipo knottina Alo-3 (PDB: 1Q3J) [30], omega-agatoxina-IVA (PDB: 1IVA) [28] y PAFP-S (PDB: 1DKC) [25] fueron identificados como los mejores candidatos y utilizados como plantillas en los programas de construcción de modelos.

El modelo predicho para LhKNOT fue evaluado por Verify3D (https://www.doe-mbi.ucla.edu/verify3d; consultado el 18 de abril de 2018) [39], VoroMQA (https://bioinformatics.lt/wtsam/voromqa; consultado el 18 de abril de 2018) [40], y Prosaweb (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php; consultado el 18 de abril de 2018) [38]. La evaluación de péptidos pequeños con herramientas de evaluación estándar puede tener limitaciones.

Por lo tanto, se utilizaron puntajes de estructuras terciarias resueltas de RMN y péptidos derivados de cristalografía de tamaño y forma similares (PDB: 1Q3J, 1IVA y 1DKC) para interpretar los puntajes de evaluación de nuestros modelos LhKNOT. El modelo mejor clasificado se creó utilizando HHPred [37], un programa de modelado que utiliza el programa de creación de modelos subyacente, Modeller [86] utilizando un enfoque de modelado comparativo basado en restricciones. Además, se utilizó la herramienta KNOTER3D de la base de datos KNOTTIN (https://www.dsimb.inserm.fr/KNOTTIN/knoter3d.php; consultada el 15 de mayo de 2020) [36] para evaluar la estructura terciaria del modelo, lo que confirma la adopción de LhKNOT de la Pliegue anudado. Todos los homólogos identificados sin estructuras conocidas se modelaron utilizando la plantilla superior identificada en HHPred [37].

4.4. Identificación del motivo del clip CPC

Superposición del modelo estructural de LhKNOT con las estructuras conocidas de un clip de CPC que contiene péptido de knottina del cactus Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26] utilizando los programas Superpose (http://superpose.wishartlab.com; consultado el 12 de septiembre de 2{ {11}}18) [87] y MultiProt (http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MultiProt; consultado el 12 de septiembre de 2018) [88] sugirieron la presencia de un motivo de clip CPC de unión a heparina. Para confirmar la presencia del clip CPC en LhKNOT, análisis de acoplamiento utilizando el programa ClusPro 2.0 (que ofrece parámetros específicos para la heparina como ligando; https://cluspro.org; consultado el 2 de marzo de 2019) [89] y análisis posterior de escenarios de acoplamiento previstos en el programa de visualización, PyMOL (https://pymol.org; consultado el 10 de marzo de 2019) [90].

Todos los posibles escenarios de acoplamiento se analizaron para identificar los residuos que forman el supuesto motivo de clip CPC utilizando los siguientes pasos. Todas las interacciones polares entre LhKNOT y heparina se visualizaron en PyMOL y se compilaron listas de residuos participantes. Las predicciones que contenían las interacciones Catión-Polar-Catión necesarias se examinaron más a fondo para observar la adherencia al parámetro de motivo de clip CPC midiendo las distancias entre los carbonos alfa de los residuos participantes, así como las distancias entre el centro de masa de los residuos participantes. La herramienta Asistente de "Mediciones" de PyMOL se utilizó para medir las distancias entre los carbonos de los residuos participantes.

Para evaluar las distancias entre los centros de masa, un script generado por el usuario disponible en el sitio web de Pymolwiki (Henschel, https://pymolwiki.org/index.php/Center_of_mass; accedido en 15 de marzo de 2019) se utilizó para generar pseudoátomos en el centro de masa calculado de la cadena lateral. Se utilizó el complemento de electrostática APBS de PyMOL [91] para generar la electrostática de la superficie para el LhKNOT modelado. Se llevaron a cabo pasos similares para identificar el motivo de clip de CPC en cada una de las proteínas de knottina restantes en la Tabla complementaria S5.

4.5. Asociación de LhKNOT con otros GAG

Para evaluar si el clip de CPC facilitaría la unión con GAG adicionales, se realizó un acoplamiento adicional con ácido hialurónico (PDB: 1HYA) y sulfato de queratán (PDB: 1KES). En el caso del ácido hialurónico, los átomos extraños (O, Na) se eliminaron del espacio que rodea a la molécula. El modelo de queratán sulfato se usó tal cual. El acoplamiento se realizó con AutoDock (https://autodock.scripps.edu; consultado el 7 de abril de 2020) [92] y los resultados se visualizaron en PyMOL. Luego, los resultados se ingresaron en PDBSum (http://www.ebi.ac. uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html; consultado el 10 de abril de 2020) [93] para generar Ligplots para confirmar la unión del clip GAG-CPC. .

4.6. Análisis de acoplamiento de proteína-heparina para clip de CPC mutado en LhKNOT

Para investigar la importancia del clip CPC en la unión a heparina, se generaron modelos mutados de LhKNOT utilizando la herramienta de mutagénesis de PyMOL, sustituyendo los residuos del clip CPC con alanina. Los modelos se crearon por partes, primero sustituyendo solo R14, luego R1 y R14, y finalmente R14, R1 y S3. El acoplamiento de heparina de todos los modelos se realizó con ClusPro y el análisis se realizó como se describió anteriormente.

4.7. Análisis de acoplamiento de proteína-heparina en homólogos estructurales y drosomicina

Para evaluar más a fondo la presencia del motivo de clip CPC en la familia de péptidos de knottina, los métodos anteriores se ampliaron aún más a (a) homólogos estructurales de LhKNOT (PDB: 5XBD, 1Q3J, 1IVA y 1DKC) [25,26,28,30 ]; (b) Drosophila Drosomicina (PDB: 1MYN) [43], un péptido con actividad antifúngica conocida; ( c ) proteínas de knottina homólogas modeladas y ( d ) nudos representativos de diferentes categorías en la base de datos KNOTTIN. Se consideró que los resultados se apegaban al motivo si las mediciones caían dentro de los 3 Å de los parámetros del clip CPC, para permitir cierta flexibilidad de las conformaciones del bucle de proteína.

Materiales complementarios:

La siguiente información de apoyo se puede descargar en https://www.mdpi.com/article/10.3390/pathogens12010143/s1. Tabla S1. Homólogos identificados de LhKNOT utilizando diferentes enfoques basados ​​en secuencias. Tabla S2. Supuestos homólogos de L. heterotoma de LhKNOT. Las secuencias se identificaron a través de tblastn a partir de tres conjuntos de datos de transcriptoma Lh14 (ver Métodos para los números de acceso).

Las transcripciones agrupadas por celdas sombreadas codifican péptidos de knottina idénticos. Los números de acceso de la transcripción que se muestran en negrita codifican dos péptidos distintos. Los resultados se recuperaron de la Tabla de descripción disponible de los resultados de voladuras del NCBI. Tabla S3. Homólogos putativos de L. boulardi knottin de LhKNOT. Las secuencias se identificaron a través de tblastn de cuatro conjuntos de datos de transcriptoma de L. boulardi (ver Métodos para los números de acceso). Los péptidos de knottina idénticos derivados de diferentes transcritos se agrupan por color. Los resultados se recuperaron de la Tabla de descripción de los resultados de voladuras del NCBI. Tabla S4.

Supuestas secuencias de knottina de Ganaspis spp., homólogas a LhKNOT. Las secuencias de G. hookeri se identificaron con tblastn, mientras que las secuencias de G. brasiliensis se identificaron con blast. Los resultados de G. hookeri y G. brasiliensis se obtuvieron de la Tabla de descripción disponible en los resultados de búsqueda del NCBI. Las secuencias sombreadas codifican péptidos idénticos. Tabla S5.

Una lista de residuos de aminoácidos en los clips de CPC de knottina conocida examinada, péptidos de knottina modelados y drosomicina. Se muestran las medidas de distancia (Å) del centro de masa del carbono alfa y de la cadena lateral (a través del pseudoátomo) de los residuos participantes de los motivos de clip de CPC identificados. Clave: más nudos ofensivos conocidos (toxinas), Φ modelos in silico, * pliegue no nudoso, ± péptido putativo alternativo, resaltado en verde y amarillo para delimitar los péptidos que surgen del mismo transcrito. Figura S1: (A) Perfil de evaluación de Prosa-web. La puntuación Z del modelo se representa como un punto negro sobre un fondo de puntuaciones Z de estructuras conocidas del PDB (izquierda) y visualización del modelo tridimensional LhKNOT con residuos coloreados de azul a rojo en orden creciente energía residual (derecha). (B) Verificar perfil de evaluación. El gráfico muestra las puntuaciones 1D-3D promediadas y sin procesar para LhKNOT y el panel superior muestra el porcentaje de residuos que obtuvieron una puntuación media de 0,2 o superior.

Un modelo aprobado tiene al menos el 80 por ciento de sus residuos con una puntuación superior a 0,2. (C) Perfil de evaluación VoroMQA. Puntuaciones globales de VoroMQA en el contexto de puntuaciones de estructura de rayos X de alta calidad (izquierda) y gráfico de la puntuación local y puntuación general para LhKNOT (derecha). Figura S2. Ligplot que muestra las interacciones de LhKNOT con sulfato de queratán (PDB: 1KES) incluye los residuos de clip de CPC (R1-S3-R14). Las líneas discontinuas verdes representan interacciones de enlaces de hidrógeno. Figura S3. Ligplot que muestra las interacciones de LhKNOT con ácido hialurónico (PDB: 1HYA) incluye los residuos de clip de CPC (R1-S3-R14).

Las líneas discontinuas verdes representan interacciones de enlaces de hidrógeno. Figura S4. (A) Ligplot que muestra las interacciones de LhKNOT de tipo salvaje que interactúan con la heparina a través del clip CPC primario (R1-S3-R14). (B) Ligplot que muestra las interacciones del mutante R14A LhKNOT que interactúa con la heparina a través de un clip de CPC secundario (R1-S3-R30). Las líneas discontinuas verdes representan interacciones de enlaces de hidrógeno. Las referencias [94–111] se citan en los Materiales complementarios.

Contribuciones de autor:

Conceptualización, SS, SG y JA; metodología, JA y SS; validación, SS, SG, JA, JL y LVC; análisis formal, JA, JL y LVC; investigación, JA, JL y LVC; recursos, SS y SG; curación de datos, JA, JL y LVC; redacción—preparación del borrador original, JA; redacción—revisión y edición, SS, SG, JA, JL y LVC; visualización, JA y JL; supervisión, SS y SG; administración del proyecto, SS y SG Todos los autores han leído y están de acuerdo con la versión publicada del manuscrito.

Fondos:

Esta investigación no recibió financiación.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:

No aplica.

Declaración de consentimiento informado:

No aplica.

Declaración de disponibilidad de datos:

Los datos presentados en este estudio están disponibles en el artículo y en los materiales complementarios.

Expresiones de gratitud:

Agradecemos a Brian Wey por su ayuda con las predicciones genéticas de G. brasiliensis ya SA Tasnim Ahmed por su ayuda con el formato de las figuras.

Conflictos de interés:

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Referencias

1. Penczykowski, RM; Laine, AL; Koskella, B. Comprender la ecología y la evolución de las interacciones huésped-parásito a través de escalas. Evol. aplicación 2015, 9, 37–52. [Referencia cruzada] [PubMed]

2. Lambrechts, L.; Fellous, S.; Koella, JC Interacciones coevolutivas entre los genotipos del huésped y del parásito. Tendencias Parasitol. 2006, 22, 12–16. [Referencia cruzada]

3. Quicke, DL Avispas parasitarias; Springer: Dordrecht, Países Bajos, 1997.

4. Poirié, M.; Colinet, D.; Gatti, J. Conocimientos sobre la función y la evolución de los venenos de avispas parasitoides. actual Opinión ciencia de los insectos 2014, 6, 52–60. [Referencia cruzada] [PubMed]

5. Kraaijeveld, AR; Godfray, HCJ Evolución de la resistencia del huésped y la contrarresistencia del parasitoide. Adv. Parasitol. 2009, 70, 257–280. [Referencia cruzada] [PubMed]

6. Burke, GR; Strand, MR Análisis sistemático de un arsenal de parasitismo de avispas. mol. Ecol. 2014, 23, 890–901. [Referencia cruzada] [PubMed]

7. Yan, Z.; Colmillo, Q.; Wang, L.; Liu, J.; Zhu, Y.; Wang, F.; Li, F.; Warren, JH; Ye, G. Información sobre la composición del veneno y la evolución de una avispa endoparasitoide mediante la combinación de análisis proteómicos y transcriptómicos. ciencia Rep. 2016, 6, 19604. [Referencia cruzada]

8. Lue, C.; Driskell, AC; Leipzig, J.; Buffington, ML Revisión del género Leptopilina (Hymenoptera, Cynipoidea, Figitidae, Eucoilinae) del este de los Estados Unidos, incluidas tres especies recién descritas. J. himenópteros. Res. 2016, 53, 35–76. [Referencia cruzada]

9. Cielo, ME; Hudgins, AD; Rajwani, R.; Morales, J.; Govind, S. Aprovechamiento del modelo natural de parasitoide de Drosophila para integrar la inmunidad de los insectos con la genómica funcional. actual Opinión ciencia de los insectos 2014, 6, 61–67. [Referencia cruzada]

10. Lee, MJ; Kalamarz, ME; Paddibhatla, I.; Pequeño, C.; Rajwani, R.; Govind, S. Factores de virulencia y estrategias de Leptopilina spp.: Respuestas selectivas en huéspedes de Drosophila. Adv. Parasitol. 2009, 70, 123–145. [Referencia cruzada]

11. Buchon, N.; Silverman, N.; Cherry, S. Inmunidad en Drosophila melanogaster: desde el reconocimiento microbiano hasta la fisiología del organismo completo. Nat. Rev. Inmunol. 2014, 14, 796–810. [Referencia cruzada]

12. Govind, S. Inmunidad innata en Drosophila: patógenos y vías. ciencia de los insectos 2008, 15, 29–43. [Referencia cruzada]

13. Kounatidis, I.; Ligoxygakis, P. Drosophila como sistema modelo para desentrañar las capas de inmunidad innata a la infección. Biología Abierta. 2012, 2, 120075. [Referencia cruzada]

14. Schlenke, TA; Morales, J.; Govind, S.; Clark, AG Estrategias de infección contrastantes en parasitoides de avispas generalistas y especialistas de Drosophila melanogaster. Patog de PLoS. 2007, 3, 1486–1501. [Referencia cruzada]

15. Qiu, P.; Pan, PC; Govind, S. Un papel para la vía Drosophila Toll/Cactus en la hematopoyesis larval. Desarrollo 1998, 125, 1909–1920. [Referencia cruzada]

For more information:1950477648nn@gmail.com