Evaluación in vitro de interacciones fármaco-fármaco mediadas por P‑gp mediante el modelo de células renales humanas RPTEC/TERT1
Mar 01, 2022
Introducción La evaluación in vitro del potencial inhibidor de la glicoproteína P (P-gp) es un tema importante durante el proceso de desarrollo de fármacos, ya que permite la predicción de interacciones farmacológicas clínicamente relevantes (IDD) [1–3]. La gp-P pertenece a la superfamilia de transportadores del casete de unión a ATP (ABC) y está codificada por el gen de resistencia a múltiples fármacos MDR1 (también conocido como ABCB1). Se sabe que este transportador de membrana se sobreexpresa en las células tumorales y causa resistencia a muchos medicamentos contra el cáncer [4]. Situado dentro de todas las barreras fisiológicas, incluidos el intestino, el hígado yriñones, P-gp protege contra los xenobióticos al limitar la absorción de estos sustratos del tracto digestivo y facilitar su salida a la bilis y la orina. Por lo tanto, la P-gp juega un papel importante en la farmacocinética de varias clases terapéuticas [5–7]. Se sabe que una plétora de fármacos, como agentes anticancerígenos, antifúngicos y fármacos cardiovasculares, son sustratos y/o inhibidores de la P-gp, y muchos de ellos están implicados en interacciones clínicamente relevantes [8-10]. Por lo tanto, la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) exige que el potencial inhibidor de la gp-P se evalúe durante las primeras etapas del desarrollo del fármaco. Los ensayos in vitro llevados a cabo con este propósito se basan comúnmente en estudios de transporte de fármacos utilizando líneas celulares que expresan P-gp. Más precisamente, las directrices de la FDA recomiendan la determinación de los valores de la concentración inhibitoria media máxima (IC50) in vitro para evaluar el riesgo de DDI clínicas resultantes de la inhibición de la P-gp. Con este fin, se han realizado muchos ensayos experimentales, y la mayoría de ellos se han centrado en las interacciones farmacológicas relacionadas con la absorción intestinal utilizando los modelos Caco-2 o MDCK-MDR1 [11–13]
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Ya querenalLa eliminación también es una ruta de eliminación común para varias clases de fármacos, la secreción tubular activa a través de los transportadores ABC también puede desempeñar un papel clave en estas interacciones [14]. Sin embargo, los datos in vitro sobrerenalLos DDI mediados por P-gp son limitados. Esto se debe en parte a la falta de desarrollo y caracterización de modelos in vitro para la predicción derenaltransporte de drogas. Entre varias líneas celulares humanas, el modelo RPTEC/TERT1 parece prometedor para la evaluación derenalinteracciones con la drogas. Esta línea celular se deriva de un donante humano sano y se ha generado a partir de células del túbulo proximal inmortalizadas. Además, la expresión y funcionalidad de P-gp se ha demostrado utilizando este modelo, lo que confirma su capacidad para predecirrenalefluvios de drogas [15, 16]. En este contexto, el presente estudio fue diseñado para investigar el potencial inhibidor de la P-gp utilizando el modelo RPTEC/TERT1. En primer lugar, se realizó un ensayo de selección de acumulación de rodamina 123 (R123) para obtener un perfil de inhibición para cada fármaco probado. Sobre la base de esta selección, se seleccionaron cuatro fármacos para evaluar sus efectos dependientes de la concentración sobre la acumulación intracelular de dos fármacos sustrato de la P-gp: apixabán y rivaroxabán.
Palabras clave:célula renal, modelo renal, fármaco renal, eliminación renal, riñones.
Materiales y métodos
reactivosApixabán, [2H71 3C ] - api xa ban , ri va r oxa ban ,[13C6]-rivaroxabán, nilotinib, crizotinib, erlotinib, axitinib, idelalisib, warfarina y etexilato de dabigatrán se adquirieron de Alsachim (Illkirch, Francia). El verapamilo, el ketoconazol, la simvastatina, la amiodarona, la rodamina 123, la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y la solución de HEPES se adquirieron de Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Francia).
Cultivo de células Las células RPTEC/TERT1 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Molsheim, Francia) y se cultivaron en un medio libre de suero, definido hormonalmente, que consiste en medio de Eagle modificado F12 (ATCC) de Dulbecco complementado con un kit de factor de crecimiento (ATCC) y un 1 por ciento de mezcla antibiótica/antimicótica (penicilina-estreptomicina, anfotericina B) a 37 grados y 5 por ciento de CO 2. Para todos los experimentos, las células se sembraron en 96-placas de pocillos a una densidad de 50,000 células por pozo y se usaron para crecer después de 14 días de cultivo. El medio se renovó cada 2 días y las células se usaron desde el paso 27 hasta el paso 34. Las células Caco-2 también se adquirieron de la ATCC. Las células se mantuvieron en un medio de cultivo que consistía en medio esencial mínimo de Eagle (Sigma-Aldrich, Missouri, EE. UU.) complementado con 10 por ciento de FBS, 1 por ciento de aminoácidos no esenciales y una mezcla de antibiótico/antimicótico al 1 por ciento (penicilina-estreptomicina, anfotericina B ) a 37 grados y 5 por ciento de CO2. Se sembraron células Caco-2 en placas de 96-pocillos a una densidad de 5 × 10 3 células por pocillo y se usaron para crecer después de 14 días de cultivo. Se obtuvieron células epiteliales tubulares proximales humanas (HPTEC) de BIOPREDIC (Rennes, Francia) y se cultivaron en DMEM/F12 suplementado con hidrocortisona, EGF, insulina, transferrina y selenito de sodio. Las células se sembraron en 96-placas de cultivo recubiertas de colágeno a una densidad de 6600 células por pocillo y se usaron para crecer después de 11 días de cultivo.
Ensayo de detección de acumulación de rodamina 123 El potencial inhibidor de P-gp se determinó midiendo la acumulación intracelular de rodamina 123 en células RPTEC/TERT1 en presencia y ausencia de varias clases de fármacos. Entre los 14 fármacos probados, se usaron ciclosporina A (10 µM), ketoconazol (50 µM), verapamilo (100 µM) y amiodarona (50 µM) como inhibidores de la P-gp. Apixabán, rivaroxabán y etexilato de dabigatrán, tres anticoagulantes orales directos (DOAC), se utilizaron como sustratos de P-gp (10 µM). Se usó warfarina (50 µM) como no inhibidor y se usaron cinco medicamentos contra el cáncer, incluidos nilotinib, crizotinib, erlotinib e idelalisib, sin conocer sus perfiles de inhibición a una concentración de 10 µM. Se reprodujeron varias condiciones con las células Caco-2, que están aprobadas por la FDA para estudios de transporte de fármacos. De esta forma se determinó la retención intracelular de rodamina 123 en células Caco-2 en presencia y ausencia de verapamilo (100 µM), ciclosporina A (10 µM), nilotinib (10 µM) y DOACs (10 µM ). Brevemente, después de 14 días de cultivo en 96-placas de pocillos, las células se preincubaron durante 10 min a 37 grados con cada fármaco disuelto en HBSS con HEPES 10 mM (v/v). Luego, las células se incubaron con rodamina 123 10 µM durante 45 minutos a 37 grados. Finalmente, después de tres lavados en solución fría de HBSS/HEPES, las células se lisaron a temperatura ambiente durante 45 min en una solución de dodecilsulfato de sodio (SDS) que contenía borato de sodio al 1 por ciento. La cantidad de rodamina intracelular 123 se cuantificó usando un nanoespectrofuorómetro Infnite M (Life Sciences, TECAN, Suiza), ajustando las longitudes de onda a 485/535 nm. Los datos se expresaron como porcentajes de la acumulación de rodamina 123 en células de control no expuestas a ningún inhibidor potencial de la gp-P y se establecieron arbitrariamente en una acumulación del 100 por ciento.
Ensayo de acumulación intracelular de DOAC y determinación de IC50 A partir del ensayo de detección de rodamina 123 anterior, se eligieron cuatro fármacos para investigar sus efectos dependientes de la concentración en la acumulación intracelular de apixabán y rivaroxabán (10 µM) en células RPTEC/TERT1. Se seleccionaron ketoconazol, crizotinib y nilotinib como inhibidores de la P-gp, y se eligió warfarina como no inhibidor. Se usó ciclosporina A (10 µM) como inhibidor de transportadores de amplio espectro. Los estudios de las interacciones entre los DOAC y el nilotinib para determinar los valores de IC50 se reprodujeron en células Caco-2 para comparar los dos modelos celulares. Todos los compuestos se diluyeron solos o con el inhibidor asociado en tampón de transporte HBSS suplementado con HEPES al 1 por ciento (v/v) y DMSO al 1 por ciento (v/v). Antes de la incubación, todas las soluciones se precalentaron a 37 grados y el pH se ajustó a 7,4. Para los fármacos contra el cáncer crizotinib y nilotinib, debido a su escasa solubilidad y potencial citotóxico, las concentraciones oscilaron entre 0,1 y 25 µM. Para ketoconazol y warfarina, las concentraciones oscilaron entre 0,1 y 100 µM. Brevemente, después de 14 días de cultivo, todos los fármacos disueltos en HBSS con HEPES al 1 por ciento (v/v) se preincubaron durante 10 minutos a 37 grados. Luego, las células se incubaron con 10 µM de apixabán o rivaroxabán durante 60 min a 37 grados. Finalmente, después de tres lavados en solución fría de HBSS/HEPES, las células se lisaron a temperatura ambiente durante 45 min en una solución al 0,2 por ciento de Triton X-100. A continuación, se cuantificó la cantidad de DOAC intracelular mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Los datos se expresaron como aumentos porcentuales en la acumulación de DOAC, y la acumulación intracelular de DOAC se fijó arbitrariamente en 100 por ciento en las células de control. Los valores de IC50 para la inhibición de la actividad de la gp-P, que corresponden a los valores de la mitad de la concentración efectiva máxima (EC50) para el aumento de la acumulación de DOAC, se determinaron a partir de un modelo de regresión de mínimos cuadrados no lineal no ponderado del aumento de la acumulación con la función 'nls()' en R software, de acuerdo con la siguiente ecuación (Ec. 1):
Análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masasLa cuantificación de apixaban (m/z 460.19793) y rivaroxaban (m/z 436.07285) se realizó utilizando un Ultimate U300{{18 }} sistema de cromatografía líquida (Dionex, Sunnyvale, CA, EE. UU.) acoplado con un espectrómetro de masas Q-Exactive Plus (ThermoFisher, Bremen, Alemania). Las separaciones por CL se lograron utilizando una columna analítica Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2,1 mm) (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, EE. UU.) y un caudal de 0,6 ml/min. . La fase móvil A era agua con 0,1 por ciento de ácido fórmico (FA) y la fase móvil B era acetonitrilo con 0,1 por ciento de FA. Para rivaroxaban, el gradiente fue: 0–0.3 min, 10 por ciento B; 0,3 a 1 min, lineal del 10 al 70 por ciento de B; 1–1.5 min, 70 por ciento B; 1.51 min, regreso a condiciones iniciales hasta 3 min. Para apixaban, el gradiente fue: 0-0,3 min, 10 por ciento B; 0,3 a 0,7 min, lineal de 10 a 90 por ciento B; 0.7–1.5, 90 por ciento B; 1.51 min, retorno a condiciones iniciales hasta 3 min. La detección se realizó en modo de monitorización de reacción en paralelo (PRM) con electropulverización positiva a una resolución de 35,000 (a m/z 200). Los patrones internos (IS) fueron [13C,2H7]-apixabán (m/z 468,2452) para apixabán y [13C6]-rivaroxabán (m/z 442,09297) para rivaroxabán. Para cada fármaco y su respectivo IS, se monitorizaron un ión diana (para cuantificación) y un ión de confirmación. Para rivaroxaban y su IS, el ion objetivo fue m/z 144,95125 y los iones de confirmación fueron m/z 231,11280 y m/z 237,13298, respectivamente. Para apixaban y su IS, el ion objetivo fue m/z 199,08656 y los iones de confirmación fueron m/z 282,12387 y m/z 241,06062, respectivamente.
Resultados
Ensayo de detección de acumulación de rodamina 123El ensayo de cribado de acumulación de rodamina 123 se realizó en células RPTEC/TERT1 con 14 fármacos con diferentes perfiles de inhibición (Fig. 1). Como era de esperar, la acumulación intracelular de rodamina 123 en presencia de ciclosporina A, un inhibidor de amplio espectro, estuvo entre las más altas, con un aumento en la acumulación del 75 por ciento en comparación con las células de control. La presencia de verapamilo, un inhibidor específco de la P-gp, condujo a un aumento en la acumulación de rodamina 123 del 57 por ciento, lo que demuestra la participación de la P-gp. De la misma forma, el ketoconazol, descrito como un potente inhibidor de la P-gp, provocó un mayor aumento (66 por ciento) en la acumulación intracelular de rodamina 123 en comparación con el verapamilo, confrmando su perfil de inhibición. Por el contrario, la adición de amiodarona, caracterizada como un inhibidor moderado de la gp-P, provocó un aumento en la acumulación del 59 por ciento, similar al causado por el verapamilo. Se observaron diferentes perfiles de inhibición para los agentes anticancerosos nilotinib, axitinib, crizotinib, erlotinib e idelalisib. La adición de nilotinib provocó un fuerte aumento en la acumulación de rodamina 123 (71 por ciento), lo que sugiere un potencial inhibidor signifcativo, seguido por axitinib, que provocó un aumento en la retención del 57 por ciento. Por otro lado, crizotinib y erlotinib demostraron potenciales inhibitorios de moderados a bajos, con aumentos en la acumulación de rodamina 123 del 23 % y 16 %, respectivamente. Idelalisib no afectó la acumulación de rodamina 123; lo mismo ocurría con la warfarina, que era
elegido como no inhibidor. Entre los tres DOAC, apixabán y rivaroxabán provocaron ligeros aumentos en la retención de rodamina 123: 33 por ciento y 12 por ciento, respectivamente. Curiosamente, el etexilato de dabigatrán, un profármaco de dabigatrán y un sustrato conocido de P-gp, provocó un aumento en la retención de rodamina 123 de alrededor del 50 por ciento, aunque no se describe como un inhibidor potencial de P-gp. Finalmente, la adición de simvastatina provocó solo un ligero aumento en la acumulación del sustrato fluorescente (32 por ciento). Sobre la base de esta selección, se seleccionaron cuatro fármacos para evaluar sus efectos dependientes de la concentración sobre la acumulación intracelular de apixabán y rivaroxabán dentro del modelo RPTEC/TERT1. Se eligió ketoconazol como condición de control positivo para la inhibición de P-gp, y se seleccionó warfarina como no inhibidor de P-gp para la condición de control negativo. Se seleccionaron nilotinib y crizotinib como inhibidores potentes y moderados de la P-gp, respectivamente. Se reprodujeron varias condiciones con el modelo de referencia, Caco-2. La acumulación intracelular de R123 en las células se determinó después de la combinación (o no) con apixabán y rivaroxabán (10 µM), nilotinib (10 µM) y con ciclosporina A (10 µM) y verapamilo (100 µM) para las condiciones de control de inhibición. (Fig. 2A). Como era de esperar, el verapamilo y la ciclosporina A causaron grandes aumentos en la retención de R123 de 297 por ciento y 275 por ciento, respectivamente. De la misma forma, nilotinib provocó un elevado incremento en la acumulación intracelular de R123 (229 por ciento), confrmando su potencial inhibitorio. La combinación de R123 con DOAC resultó en aumentos menores en la acumulación de R123 (40 a 44 por ciento) en comparación con los otros medicamentos. Además, la acumulación intracelular de rodamina 123 en ausencia y presencia de ciclosporina A enrenalEn este estudio también se investigaron células humanas primarias para comprobar la fiabilidad de los resultados obtenidos con células RPTEC/TERT1 (Fig. 2B). Estos análisis mostraron que la presencia de ciclosporina A aumentó la retención de R123 en un 71 por ciento. Este valor fue cercano al obtenido en las mismas condiciones con células RPTEC/TERT1 (un aumento del 75 por ciento con ciclosporina A). Por lo tanto, la actividad de la glicoproteína P fue similar en el modelo RPTEC/TERT1 y en las células humanas primarias.
Ensayo de acumulación intracelular de DOAC: determinación de la relación IC50 e I1/IC50 Se realizaron estudios de acumulación intracelular para evaluar el transporte mediado por P-gp de apixabán y rivaroxabán a una concentración constante de 10 µM en células RPTEC/TERT1 in vitro y en presencia de concentraciones crecientes de nilotinib, crizotinib, ketoconazol , y warfarina (Figs. 2, 3). Se evaluó el modelado del aumento de la retención de apixabán y rivaroxabán para determinar los valores de IC50. La combinación de DOAC con nilotinib condujo a los valores IC50 más bajos: 0,85 µM y 1,37 µM para rivaroxabán y apixabán, respectivamente (Figs. 4, 5). La combinación con crizotinib produjo valores de IC50 de 10,1 µM y 12,2 µM para rivaroxaban y apixaban, respectivamente. Sorprendentemente, la combinación de DOAC con cetoconazol no produjo los valores IC50 más bajos (16,5 µM y 16,9 µM para rivaroxabán y apixabán, respectivamente). Finalmente, como era de esperar, la combinación con warfarina, que fue
elegido como no inhibidor, no afectó las retenciones intracelulares de los dos DOAC. Por lo tanto, se investigó la acumulación intracelular de apixabán y rivaroxabán dentro de las células Caco-2 en presencia de concentraciones crecientes de nilotinib para compararlas con los modelos celulares. Curiosamente, como se observó con el modelo RPTEC/TERT1, el valor IC50 para rivaroxaban (4,16 µM) fue menor que el obtenido para apixaban (9,35 µM). También es interesante señalar que los valores de IC50 observados en las células Caco-2 fueron superiores a los obtenidos en las células RPTEC/TERT1 para el mismo inhibidor. La relevancia clínica de los DDI se puede predecir a partir de datos in vitro. De acuerdo con las pautas de la FDA, se calcularon las relaciones [I1]/IC50 para cada combinación de medicamentos. Esta relación permite comparar las concentraciones in vivo con aquellas que se sabe que producen un efecto relevante in vitro. Para apixabán en células RPTEC/TERT1, las proporciones fueron 3,1, 0,06 y 17,4 con nilotinib, crizotinib y ketoconazol, respectivamente (Tabla 1). En células Caco-2, la relación [I1]/IC50 fue de 0,46 para la interacción entre apixabán y nilotinib (Tabla 1). Para rivaroxabán, las proporciones fueron ligeramente superiores a las obtenidas para apixabán en células RPTEC/TERT1: 5,1, 0,08 y 17,7, respectivamente, para nilotinib, crizotinib y ketoconazol (tabla 2). Del mismo modo, la relación [I1]/IC50 observada para la interacción entre rivaroxabán y nilotinib en células Caco-2 fue de 1,03, superior a la obtenida para apixabán (tabla 2).
Discusión
Numerosos estudios llevados a cabo en las últimas décadas han informado de un papel notable de la P-gp en la farmacocinética de los fármacos [17-19]. En vista del creciente interés regulatorio en las interacciones farmacológicas mediadas por P-gp, los ensayos in vitro para investigar el potencial inhibitorio de los fármacos son un aspecto importante del desarrollo de fármacos y la práctica clínica. Con este fin, se han realizado muchos ensayos in vitro y la mayoría de los datos asociados sobre la absorción intestinal prevista se han generado a partir de las líneas celulares Caco-2 y MDCK-MDR1 [20–22]. Sin embargo, hay pocos datos disponibles sobre la secreción tubular activa de fármacos, que también juega un papel clave en la disposición de fármacos y depende de la presencia de transportadores ABC. Esta observación está claramente relacionada con la falta de caracterizaciónrenallíneas celulares para predecir drogasrenalefluvio Este objetivo requiere un estudio in vitrorenalmodelo que imita de cerca la barrera fisiológica. La línea celular humana RPTEC/TERT1, que expresa varios transportadores ABC (particularmente P-gp), parece ser una buena alternativa, como se demostró en un estudio previo [16]. En este contexto, el presente trabajo investigó la aplicación del modelo RPTEC/TERT1 para evaluar el potencial inhibidor de la P-gp. Hasta donde sabemos, este trabajo es el primero en proporcionar datos de estudios de inhibición de la gp-P en humanos.renalcélulas.
Los ensayos in vitro para determinar el potencial inhibidor de la gp-P suelen basarse en el uso de un sustrato específico de la gp-P de referencia, como la digoxina o la rodamina 123 [23–25]. Debido a su facilidad de uso, las sondas fluorescentes son ventajosas para ensayos de alto rendimiento. Además, la rodamina 123 se ha aplicado ampliamente a la detección de la actividad de la gp-P en una amplia gama de estudios [26-28]. De esta forma, en este estudio se realizaron ensayos de acumulación de rodamina 123 en células RPTEC/TERT1 para identificar los perfiles de inhibición de 14 fármacos. Entre estos fármacos, la ciclosporina A, el ketoconazol y el verapamilo fueron elegidos como inhibidores potentes de la P-gp. Estos inhibidores se han caracterizado ampliamente por su importante potencial inhibidor de la P-gp, que conduce a la modulación del transporte de digoxina y rodamina 123 [27, 29, 30]. Como era de esperar, estos fármacos provocaron las mayores retenciones de rodamina 123 en las células RPTEC/TERT1. Por el contrario, no se observó un aumento en la retención de R123 con warfarina, que se utilizó como control negativo, lo que confirma la confiabilidad del modelo RPTEC/TERT1. Curiosamente, entre todos los fármacos probados, los DOAC, incluidos el etexilato de dabigatrán, el apixabán y el rivaroxabán, causaron aumentos distintos en la retención de R123, aunque no se caracterizaron previamente como inhibidores, solo como sustratos de P-gp [31, 32]. Esta observación puede deberse a la existencia de la denominada inhibición "competitiva", en la que los fármacos pueden interactuar con los mismos sitios de unión en la P-gp. Los sitios mejor caracterizados para P-gp son el sitio H (para unir Hoechst 33342) y el sitio R (para unir rodamina 123). Sin embargo, muchos otros sitios de unión a fármacos desconocidos podrían desempeñar un papel en estas interacciones, lo que podría explicar los diferentes efectos de los DOAC en la acumulación de R123 [33, 34]. La inhibición de la gp-P observada para un fármaco determinado depende, por lo tanto, del sustrato utilizado durante los estudios in vitro [28, 35]. Por lo tanto, se debe considerar el uso de diferentes sustratos de P-gp que interactúan con diferentes sitios de unión a fármacos para describir con precisión las supuestas potencias inhibidoras de P-gp de los fármacos. También es interesante señalar que también se realizaron varias condiciones del cribado de rodamina 123 en células Caco-2 para comparar las células RPTEC/TERT1 con un modelo de referencia en estudios de transporte de fármacos. Como era de esperar, la ciclosporina A, el verapamilo y el nilotinib provocaron los mayores aumentos en la retención de rodamina. Se observaron los mismos perfiles de inhibición con las células Caco-2 y RPTEC/TERT1. Sin embargo, los aumentos en la retención de rodamina 123 generados por las interacciones en el modelo Caco-2 fueron mayores que los observados en las células RPTEC/TERT1, lo que sugiere una posible diferencia en la expresión de la glicoproteína P entre los modelos. Por lo tanto, en el presente estudio, se utilizó un segundo método para evaluar y confrmar la inhibición potencial de P-gp por fármacos.
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Sobre la base del ensayo de acumulación de rodamina 123, se eligieron cuatro fármacos para determinar sus efectos dependientes de la concentración sobre la acumulación intracelular de apixabán y rivaroxabán. Se ha demostrado que la gp-P desempeña un papel principal en el eflujo de apixabán y rivaroxabán [32, 36]. Por lo tanto, se evaluaron los valores de CI50 de nilotinib, crizotinib y ketoconazol, y se seleccionaron los DOAC como fármacos "víctimas". Hasta donde sabemos, este estudio es el primero en realizar estudios de acumulación intracelular con DOAC en humanos.renalcélulas. Los valores de CI50 obtenidos para nilotinib y crizotinib coincidieron con sus perfiles de inhibición obtenidos del ensayo de acumulación de rodamina 123. Nilotinib, que provocó un fuerte aumento en la retención de R123, presentó el valor de IC50 más bajo para los dos ACOD, lo que confirma su alto potencial de inhibición. Este resultado también está de acuerdo con un estudio previo que mostró un aumento dependiente de la concentración en la acumulación intracelular de [3 H]-paclitaxel en células transfectadas con MDR1-, lo que sugiere que tiene un perfil inhibidor [37]. Para crizotinib, el ensayo R123 mostró un potencial inhibidor moderado, con un aumento menor en la retención de R123 que el causado por nilotinib. Esta observación está respaldada por un estudio anterior en el que crizotinib aumentó la acumulación intracelular de R123 y doxorrubicina en células transfectadas con MDR1- [38]. Este resultado también está de acuerdo con los valores de IC50 determinados con ACOD, que fueron superiores a los valores correspondientes para nilotinib, lo que confrma su perfil de inhibición moderado. Sin embargo, es interesante notar que una concentración de 10 µM de nilotinib o crizotinib no provocó los mismos aumentos en la retención de rodamina 123 y ACOD. En la detección de rodamina, nilotinib aumentó la retención del sustrato en aproximadamente un 71 por ciento, mientras que para los DOAC fue de aproximadamente un 40 por ciento. Por el contrario, crizotinib provocó un pequeño aumento en la retención de rodamina (23 por ciento) pero mayores aumentos en la retención de DOAC (alrededor del 50 por ciento) a la misma concentración. Como se discutió anteriormente, esta observación podría explicarse por las diferencias en los sitios de unión en P-gp. Se sabe que muchos fármacos interactúan y compiten con el sitio de unión H en lugar del sitio de unión R (que es donde se une la rodamina 123), y viceversa [39]. Curiosamente, el ketoconazol, que se sabe que es un potente inhibidor de la gp-P, provocó un aumento ligeramente menor en la retención de rodamina 123 que el nilotinib (66 % frente a 71 %, respectivamente). Sin embargo, se observó un valor similar con las células Caco-2, donde la presencia de ketoconazol provocó un aumento del 60 por ciento en la acumulación de R123 [40]. La acumulación intracelular de DOAC para determinar los valores de IC50 también mostró valores más altos en comparación con nilotinib y crizotinib. Curiosamente, la mayoría de los valores de IC50 encontrados en los modelos LLC-PK1 o Caco-2 que utilizan digoxina como sustrato de P-gp estaban entre 3 y 4 µM para ketoconazol [41, 42]. Estos valores son bastante diferentes a los encontrados en el presente estudio (16,5 µM y 16,9 µM con apixabán y rivaroxabán, respectivamente). Esta observación confrma que la elección del sustrato y el modelo utilizado son infuencias cruciales a la hora de determinar el potencial inhibidor de la P-gp. Además, un estudio reciente informó que los niveles de expresión de los transportadores ABC en modelos celulares in vitro tienen un impacto en los ensayos de transporte de fármacos y, por lo tanto, en la evaluación de DDI relacionados con P-gp [43]. De hecho, la determinación de los valores de IC50 para el verapamilo utilizando rivaroxabán como sustrato de la gp-P reveló una heterogeneidad entre los modelos de células MDCKMDR1 y Caco-2, con valores de IC50 de 6,94 µM y 21,2 µM, respectivamente [43]. Además, en este estudio también se investigó el efecto dependiente de la concentración de nilotinib sobre la acumulación intracelular de apixabán y rivaroxabán en células Caco-2. Curiosamente, los valores de IC50 para nilotinib fueron significativamente más altos en las células Caco-2 que en las células RPTEC/TERT1. Esta observación puede explicarse por la diferencia en la expresión de P-gp entre estos modelos. Además, se sabe que la distribución de P-gp depende del tejido considerado. Fallón et al. demostraron que el nivel de P-gp era mayor enriñónque en el tejido hepático en humanos [45]. Por otro lado, el nivel de expresión de P-gp parece ser mayor en intestino que enriñóntejido [46]. Por tanto, el uso de células humanas como el modelo RPTEC/TERT1, que no sobreexpresan transportadores, podría aportar datos adicionales. Estos datos podrían utilizarse e imputarse en el modelado farmacocinético de base fisiológica (PBPK) mediante la integración de varios parámetros, como la cantidad de P-gp en un tejido o modelo in vitro o valores IC50.
Aunque los valores de IC50 encontrados para ketoconazol en el modelo RPTEC/TERT1 fueron más altos que los observados en la literatura, la relación [I1]/IC50—validada como predictor de DDI clínicamente relevantes potenciales para fármacos administrados por vía oral—mostró valores altos que estaban por encima del umbral de 0,1 defnido por la FDA. Este resultado está de acuerdo con un estudio clínico que mostró un aumento del doble en la exposición a apixabán con la administración conjunta de ketoconazol [44]. En conjunto, todos estos resultados demuestran que el modelo RPTEC/TERT1 es una herramienta prometedora para evaluar el potencial inhibidor de la P-gp.
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Conclusión
Nuestro estudio demostró que la aplicación del modelo RPTEC/TERT1 es conveniente para evaluar los potenciales inhibidores de la P-gp de varias clases de fármacos. Los ensayos de acumulación de rodamina 123 permitieron realizar una selección inicial de fármacos. Sin embargo, los potenciales inhibidores de la gp-P de los fármacos que no interactúan con el sitio R de la gp-P también deben investigarse utilizando sustratos adicionales para confrmar las predicciones. Los valores de IC50 determinados a partir de la acumulación intracelular de apixabán y rivaroxabán están de acuerdo con los perfles de inhibición observados con rodamina 123. Además, el uso de ketoconazol y warfarina como inhibidor fuerte y no inhibidor de la P-gp, respectivamente, confrmó la fiabilidad del modelo RPTEC/TER1 cuando se utiliza para obtener datos in vitro sobre los potenciales inhibitorios de fármacos hacia la P-gp. Finalmente, una comparación de los resultados obtenidos usando el modelo RPTEC/TERT1 con los obtenidos usando células Caco-2 resaltó la importancia de realizar estudios in vitro en diferentes modelos celulares para confrmar el perfl inhibitorio de un fármaco dado.