Las nanozimas que imitan catalasas que detectan la inflamación alivian la lesión renal aguda al revertir el estrés oxidativo local

Abstracto

Antecedentes: Elespecies reactivas de oxígeno (ROS)y es bien sabido que la inflamación, un factor fundamental que contribuye al daño tisular, está asociada con diversas enfermedades. El riñón es susceptible a la hipoxia y vulnerable a las ROS. Así, el círculo vicioso entreestrés oxidativoy renalla hipoxia contribuye críticamentea la progresión deenfermedad renal crónicay finalmente,enfermedad renal terminal. Por lo tanto, administrar agentes terapéuticos al sitio de inflamación rico en ROS y liberar los agentes terapéuticos es una solución factible.

Nuevas hierbas para la enfermedad renal

Resultados: Desarrollamos una nanoplataforma versátil de eliminación de ROS, con detección de inflamación y de circulación más prolongada mediante la carga estable de Mn3O4 estabilizado con dodecanotiol (dMn) que imita la catalasa.3O4) nanopartículas dentro de nanomi‑celles (PTC), lo que da como resultado una nanozima sensible a ROS (PTC-M). dMn hidrofóbico3O4Las nanopartículas se cargaron en el interior.Micelas de PTC para prevenir la liberación prematura durante la circulación y actuar como agente terapéutico al responder a ROS.liberación de dMn cargado3O4una vez que llegó al sitio de la infamación.

Palabras clave:Nanopartículas de Mn3O4, Nanozimas, Infamación,Isquemia-reperfusión, Riñón

Fondo

Acute kidney injury (AKI) is the term that covers a broad spectrum of renal function deterioration ranging from small changes in serum creatinine level to conditions requiring renal replacement therapy [1]. The KDIGO (Kidney disease: improving global outcomes) guidelines define AKI as an increase in serum creatinine of either>0.3  mg/dL within 48  h,>1,5 veces desde el inicio dentro de los siete días o una reducción en el volumen de orina de<0.5 ml/kg/hour for six hours [1]. AKI is one of the rising global health problems that cause high morbidity and mortality and economic burden [2]. The incidence of AKI defined by the KDIGO guidelines was 21.6% in adults in in-hospital settings [3]. AKI may lead to several complications, including metabolic acidosis, hyperkalemia, uremia, volume overload, and damage to other organ systems, including death. Despite advances in medicine, mortality from AKI is still high. According to a meta-analysis of studies in in-hospital settings, AKI-associated mortality was reported to be 23.9% in adults [3]. The mortality rate of dialysis-requiring AKI patients exceeds 50% [4]. AKI increases the long-term risk of subsequent AKI, progressive chronic kidney disease (CKD), and end-stage renal disease (ESRD) [5]. Eventually, AKI increases socioeconomic and healthcare burdens. Nevertheless, there is no clear treatment for AKI to date. When AKI occurs, conservative treatments such as removing the causative factors, controlling water and electrolyte imbalances, performing renal replacement therapy, if necessary, and waiting for renal function to recover are applied.

Lesión por isquemia-reperfusión (IRI)Es una lesión de órganos causada por la reducción o el cese transitorio del flujo sanguíneo, seguida de reperfusión, y puede ocurrir en una variedad de situaciones clínicas, como shock, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular isquémico, cirugía mayor y trasplante de órganos. La IRI renal es una de las principales causas de IRA, que provoca una rápida disminución de la función renal. El riñón es un órgano particularmente susceptible a las agresiones isquémicas y las células epiteliales tubulares lesionadas provocan alteraciones en la excreción de productos de desecho y en el control del equilibrio de agua, electrolitos y ácido-base [6]. Se sabe que el mecanismo de lesión de las células tubulares renales en la IRI implica la inflamación causada por especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas durante la reperfusión [6-8]. Por lo tanto, ha habido intentos de aplicar la eliminación de ROS al tratamiento de la IRI. Sin embargo, su uso clínico real ha sido limitado debido a preocupaciones sobre los efectos secundarios sistémicos, que incluyen reacciones de hipersensibilidad [9]. La administración de antioxidantes como la edaravona ya se ha utilizado para eliminar las ROS en el IRI. Sin embargo, estuvo acompañado de varios efectos secundarios y, por lo tanto, se han solicitado antioxidantes nuevos y eficaces, como las nanozimas (nanomateriales que exhiben actividad similar a una enzima natural) [9-13]. Yao et al. descubrieron que las partículas de Mn3O4 nan poseían múltiples actividades de imitación de enzimas, es decir, actividades de imitación de superóxido dismutasa y catalasa, así como actividad eliminadora de radicales hidroxilo [11]. Se demostró que Mn3O4 poseía una mayor capacidad de eliminación de ROS que otras enzimas como V2O5, CeO2, Co3O4, MnFe2O4 y Fe3O4 y era mejor que la de otros tipos de óxido de manganeso (MnOx (MnO2, MnO y Mn2O3).

Fig. 1 Ilustración esquemática que muestra la preparación y el modo de acción de PTC-M A Síntesis de PTC-M, B Mecanismo de acción de PTC-M (1) inyección intravenosa de PTC-M (2) el PTC-M inyectado circula en la sangre y se acumula en el sitio de infamación (3) la desestabilización de PTC-M debido a las ROS intrínsecas presentes en el sitio de infamación (4) la liberación del dMn 3O4 cargado en el sitio de infamación (5) el dMn3O4 liberado cataliza la eliminación de ROS que conduce a (6) reducción de la inflamación, apoptosis y fibrosis (7) alivio del daño renal y (8) mejora de las funciones renales

Resultados

Síntesis y caracterización de nanopartículas de dMn3O4 y conjugados de polímeros.

Las NP de dMn3O4 se sintetizaron mediante el método de coprecipitación y se estabilizaron utilizando grupos tiol de 1-dodecanotiol (Fig. 2A). El análisis de microscopía electrónica de transmisión de emisión de campo (FE-TEM) demostró que las NP de dMn3O4 tenían un tamaño promedio inferior a 2{{10}} nm (18,0±0,6 nm) (Fig. 2B ). Archivo adicional 1: Las figuras S1A y S1B muestran las imágenes y la representación esquemática del dMn3O4 preparado. Los datos de espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDS) mostraron la presencia de Mn de Mn3O4 y azufre y carbono de SH-C12 (Fig. 2C y archivo adicional 1: Figura S1C). Los resultados del análisis de espectroscopía de fotones de rayos X (XPS) representaron el espectro XPS de Mn 2p, que constaba de dos picos ubicados en 641,42 eV y 653,23 eV y estos picos se atribuyeron a Mn 2p3/2 y Mn 2p1/2, respectivamente (Fig. 2D y archivo adicional 1: Figura S2). La brecha de energía entre estos dos picos fue de 11,81 eV, lo que concordaba con la literatura reportada para Mn3O4. En el patrón de difracción de rayos X en polvo (XRD) de las NP dMn3O4, como se muestra en la Fig. 2E, todos los picos de difracción medidos coincidieron bien con el patrón estándar de hausmannita Mn3O4 [ICDD: #001–1127], lo que confirma su alta cristalinidad. naturaleza. El conjugado de PTC sensible a ROS se preparó mediante reacciones químicas graduales en las que primero se midió el tamaño del conector tiocetal (TK) con un grupo carboxilato terminal. Luego se conjugó el grupo carboxílico del conector TK con el grupo amino de metoxi-PEG amina (PEG-AM) usando la reacción EDC/NHS para formar PEG-TK. Finalmente, el otro grupo carboxílico de PEG-TK se conjugó nuevamente con el grupo amino de la estearamina mediante la reacción EDC/NHS [15]. El conjugado de PC que no responde a ROS se preparó conjugando ácido esteárico con PEG-AM. La composición de PTC y PC se analizó mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1 H (archivo adicional 1: Figura S3). Los espectros de RMN mostraron picos característicos en δ 0,83 y 1,23 ppm correspondientes a los protones metilo y metileno del C18. El pico en δ 3,6 correspondió a O –CH2 –CH2- de PEG. El grado de sustitución (DS%) de C18 en PTC y PC se calculó como 78% y 46%, respectivamente.

Preparación y caracterización de la enzima PTC-M.

Las nanomicelas sensibles a ROS (PTC) se cargaron con dMn3O4, lo que dio como resultado PTC-M. La proporción de alimentación de dMn3O4 (20%) de PTC se utilizó para la preparación de PTC-M. El diámetro hidrodinámico, el potencial zeta y las imágenes FE-TEM de los PTC y PTC-M preparados se muestran en la Fig. 3A y en el archivo adicional 1: Figura S4A. Las imágenes FE-TEM de PTC demostraron nanomicelas esféricas con tamaños de partículas uniformes. El diámetro hidrodinámico de PTC-M aumentó ligeramente después de la carga de dMn3O4 debido al empaquetamiento de dMn3O4 en el espacio hidrofóbico, mientras que el potencial zeta se mantuvo negativo en ambas nanomicelas debido al blindaje de PEG. Las imágenes FE-TEM de PTC y PTC-M mostraron partículas distribuidas uniformemente. El contenido de carga y la eficiencia de encapsulación se calcularon mediante análisis espectrométrico de masas y se calcularon en 10 ± 3% y 17 ± 6%, respectivamente. La presencia de dMn3O4 fue visible en las imágenes FE-TEM de PTC-M (Fig. 3A), que se confirmó aún más mediante el análisis EDS de PTC-M, que muestra Mn de Mn3O4, azufre y carbono de SH-C12, y carbono. , nitrógeno y oxígeno de PEG (archivo adicional 1: Figura S5). Se realizó un análisis termogravimétrico (TGA) y se calculó que la carga de dMn3O4 era del 12% (archivo adicional 1: Figura S6B). También se prepararon micelas no sensibles a ROS cargadas con dMn3O4 (PC-M) como controles mediante el mismo método.

Para confirmar el papel del enlace TK en la desestabilización de PTC-M en respuesta a ROS y la liberación de dMn3O4, PTC-M se expuso a condiciones de ROS agregando H2O2. Como controles, utilizamos el PC-M no sensible a ROS. Tanto el PTC-M como el PC-M exhibieron una morfología esférica con dMn3O4 muy empaquetado en las nanomicelas, pero después del tratamiento con H2O2, el supraensamblaje del PTC-M se distorsionó, seguido de la liberación de dMn3O4, que luego fue agregados como se muestra en las imágenes FE-TEM, mientras que PC-M mostró estructuras estables incluso después de la exposición a H2O2 (Fig. 3B y archivo adicional 1: Figura S4B). La susceptibilidad a ROS de PTC-M se confirmó aún más al comparar los cambios en el diámetro hidrodinámico y el potencial zeta con el PC-M, como se muestra en el archivo adicional 1: Figura S7. El diámetro hidrodinámico y el potencial zeta del PC-M no sensible a ROS no mostraron diferencias perceptibles después de la adición de H2O2. Sin embargo, el PTC-M sensible a ROS mostró tamaños hidrodinámicos reducidos, probablemente debido a la eliminación del blindaje de PEG mediante la rotura de TK, lo que resultó en la desestabilización de la estructura. Después de la adición de H2O2, el potencial zeta volvió de una carga negativa a una positiva, lo que podría deberse a la eliminación del PEG y la exposición al vapor. Además, estudiamos la variación de tamaño verificando la estabilidad a lo largo del tiempo mediante el seguimiento de los diámetros hidrodinámicos en presencia o ausencia de H2O2 (Fig. 3C). Después de la adición de H2O2, los diámetros hidrodinámicos disminuyeron significativamente en 10 s sin más cambios con el tiempo hasta seis días, mientras que el PTC-M solo mostró tamaños estables durante el experimento, lo que sugiere una buena estabilidad coloidal del PTC-M. También verificamos la estabilidad en FBS al 10% y observamos que el PTC-M mostró una buena estabilidad por hasta 4 días (archivo adicional 1: Figura S9). Los diámetros dinámicos hidroxi y la variación del potencial zeta también se confirmaron con nanomicelas vacías sensibles y no sensibles a ROS (PTC y PC) (archivo adicional 1: Figura S8). Todos estos estudios comparativos en presencia o ausencia de ROS demostraron la estabilidad y la sensibilidad a ROS de los nanomoles preparados o de la enzima dMn3O4 PTC-M final.

Fig. 2 Síntesis y caracterización de dMn3O4 Una ilustración esquemática de la síntesis de dMn 3O4, imágenes B FE-TEM, análisis C EDS, espectro D XPS y patrones E XRD de NP de dMn3O4

Además, verificamos la propiedad de eliminación de H2O2 de la enzima PTC-M final debido a la carga de NP de dMn3O4. Esto se probó utilizando ácido tereftálico (TA) como sonda de centavos de futuros. TA reaccionó con H2O2 para formar ácido 2-hidroxitereftálico con un pico fluorescente a 425 nm. dMn3O4 convertirá H2O2 en agua y oxígeno y, por lo tanto, la intensidad fluorescente disminuye, lo que confirma la actividad catalasa, como se muestra en la Fig. 3D. El PTC-M mostró una fuerte reducción en la intensidad de la fluorescencia en comparación con el PTC de micela vacía en presencia de H2O2 a lo largo del tiempo. La actividad similar a catalasa de PTC-M también dependía de la concentración, como se muestra en el archivo adicional 1: Figura S10. La capacidad de producción de oxígeno de PTC-M se confirmó aún más utilizando una sonda fluorescente específica de O2-Ru(DDP) en presencia de H2O2. La fluorescencia en diez ciudades del Ru(DDP) disminuye en presencia de O2, lo que sugiere la producción eficiente de O2. Como se muestra en la Fig. 3E, la intensidad de fluorescencia de Ru (DDP) disminuyó en presencia de H2O2 en el grupo PTC-M, mientras que la presencia de H2O2 en el grupo de PTC solo mostró una pequeña disminución en la fluorescencia (Fig. 3F). confirmando la actividad catalasa que resulta en la producción de oxígeno en PTC-M. Finalmente, confirmamos la propiedad de eliminación de H2O2 del PTC-M utilizando un medidor de detección de oxígeno. Como se muestra en la Fig. 3G, la producción de oxígeno por PTC-M aumentó dentro del tiempo inicial, seguido de un aumento lento, mientras que las micelas vacías de PTC no mostraron producción de oxígeno. La desproporción de H2O2 se observó mediante la formación de burbujas de oxígeno en el grupo PTC-M como se muestra en el archivo adicional 1: Figura S11A. También se observó que PTC-M mostró una mayor producción de oxígeno en comparación con dMn3O4 solo, probablemente debido al empaquetamiento cercano de dMn3O4 en PTC-M, lo que lo hace más disponible para la reacción en comparación con dMn3O4 libre (archivo adicional 1: Figura S11B). Aunque las nanomicelas se habían aflojado debido al tratamiento con H2O2, como se muestra en FE-TEM, es posible que dMn3O4 todavía estuviera presente dentro del PTC-M, lo que resultó en una alta actividad catalasa en comparación con el dMn3O4 libre. Todos estos resultados en conjunto confirmaron la superior actividad imitadora de catalasa del PTC-M.

Viabilidad celular in vitro y captación celular.

Para confirmar la absorción celular y la ciudad susceptible a ROS de PTC sensible a ROS distribuido intracelularmente y el patrón de liberación de la carga útil, comparamos PTC con condiciones in vitro de PC. Primero, verificamos la viabilidad celular de los PTC, PC, PTC-M y PC-M preparados en células HK-2 mediante el ensayo WST-1 (archivo adicional 1: Figura S12). Las micelas vacías sufrieron poca muerte celular, pero después de la carga de dMn3O4-, la viabilidad celular disminuyó, pero el cambio no fue estadísticamente significativo. Dado que las micelas vacías no eran citotóxicas, la ligera variación en la viabilidad celular podría deberse al dMn3O4 adsorbido en la superficie. Se determinó que el valor IC50 de PTC-M y PC-M era 130,41 y 247,17 ug/ml, respectivamente (Fig. 4A). Para examinar más a fondo la captación y distribución intracelular de las nanomicelas, se utilizó IR780 como fármaco modelo y se prepararon nanomicélulas de PTC cargadas con IR780, PTC-IR780 para visualizar la intensidad de fluorescencia de IR780 utilizando microscopía de presencia divertida (Evos FL Auto 2, Thermo Fisher Scientific , EE. UU.) (Fig. 4B). Como grupo de control, también analizamos la absorción de PC-IR780 no sensible a ROS. En comparación con PC-IR780, PTC-IR780 mostró una mayor absorción en las células HK-2 (archivo adicional 1: Figura S13). La razón exacta detrás de la mayor absorción de PTC-IR780 en condiciones sin ROS no está clara; sin embargo, podría deberse a que el PTC podría mostrar una ligera sensibilidad al nivel normal de ROS en condiciones de cultivo celular, lo que lleva a que el PEG abandone la superficie. carga ligeramente positiva. PC-IR780 mostró un patrón de absorción similar independientemente de las ROS inducidas por el tratamiento con H2O2 o las condiciones de ROS inducidas por hipoxia debido a su naturaleza no sensible, mientras que PTC-IR780 mostró un patrón de distribución diferente dentro de las células, lo que podría deberse a la liberación mejorada de IR780. dentro de las células. Los datos de viabilidad celular anteriores (archivo adicional 1: Figura S11) que muestran una mayor muerte celular en PTC-M también se deben a la mayor absorción celular de PTC en comparación con PC. El yoduro IR780 es un tinte altamente hidrofóbico que puede mostrar una alta afinidad hacia la membrana celular y muestra una señal muy brillante independientemente de la exposición a ROS. La captación celular se analizó más a fondo comprobando la intensidad media de fluorescencia (MFI) mediante análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Fig. 4C), que respaldaba los datos obtenidos mediante microscopía de fluorescencia. Como se muestra, el MFI fue más alto en el grupo PTC IR780 sensible a ROS en comparación con los otros grupos, lo que confirma la liberación mejorada de IR780 en las células. Además, Quan vinculó el MFI de varios grupos (Fig. 4D), lo que respaldó los datos de microscopía que sugieren que PC-IR780 no mostró ninguna diferencia significativa en la absorción celular incluso en condiciones inducidas por ROS, mientras que el PTC IR780 mostró un aumento significativo en la absorción celular. absorción cuando se trata en condiciones inducidas por ROS. La absorción celular de PTC también se determinó comprobando el Mn residual en las células después del tratamiento con PTC-M. Como se muestra en la Fig. 4E, PTC-M mostró una absorción dependiente de la concentración en las células HK-2. Por lo tanto, estos resultados resumen la internalización mejorada de las nanomicelas y la liberación acelerada dentro de las células, probablemente debido al desmontaje de nanomicelas mediado por ROS.

Realizamos estudios in vitro en células HK-2 para explorar más a fondo los efectos de PTC-M en las condiciones de estrés oxidativo a nivel celular. Las células HK-2 se estimularon con H2O2, una ROS representativa (Fig. 5A). H2O2 mejoró la expresión de hemo oxigenasa (HO) -1, que mejoró con el tratamiento conjunto con PTC-M (Fig. 5A). El ensayo de diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofuoresceína (DCF DA) se realizó para verificar el patrón de cambio de ROS intracelular. Las células HK-2 estimuladas por H2O2 mostraron una alta intensidad de fluorescencia, pero después del tratamiento conjunto con PTC-M, la intensidad de fluorescencia disminuyó (Fig. 5B). La relación BAX/BCL-2 aumentó con el tratamiento con H2O2, que también se recuperó con el cotratamiento con PTC-M, lo que indica protección contra la apoptosis (Fig. 5C). Las células HK-2 tratadas con H2O2 mostraron un aumento progresivo significativo en la tinción con anexina V+/PI-, que fue evitado por PTC-M (Fig. 5D). La fosforilación de ERK, JNK y p38 inducida por H2O2- también se suprimió mediante el tratamiento conjunto con PTC-M, aunque no se observó una reducción significativa en P38 fosforilada (Fig. 5C). Estos datos sugieren que PTC-M suprimió los procesos apoptóticos inducidos por ROS en las células epiteliales tubulares renales.