Inhibición De La Agregación Beta Amiloide Y Deposición Del Extracto Acuoso De Cistanche Tubulosa
Mar 02, 2022
Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com
Chien-Liang Chao, Hsin-Wen Huang, Hui-Chi Huang, Hsin-Fan Chao, Shuen-Wen Yu, Muh-Hwan Su, Chao-Jih Wang y Hang-Ching Lin
Resumen
Cistanche tubulosa extracto acuoso(CTE) ya se usa como medicamento recetado botánico para tratar la demencia en China. Nuestros estudios previos informaron que los glucósidos feniletanoides de CTE (Cistanche tubulosa extracto acuoso) tienen actividad contra la enfermedad de Alzheimer (AD) mediante la inhibición de la agregación y el depósito del péptido amiloide (A). Sin embargo, estudios recientes consideraron que los glucósidos feniletanoides pueden ser metabolizados por las bacterias intestinales porque todos los resultados de los análisis mostraron que la biodisponibilidad de los glucósidos feniletanoides es extremadamente baja. En este estudio, demostramos cómo la quelación del hierro juega un papel crucial en el mecanismo de inhibición de la agregación y deposición de Aglucósidos de feniletanoidedel CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso). Además, demostramos además que los glucósidos feniletanoides (1-3) podrían llegar al cerebro. CTE activo(Cistanche tubulosa extracto acuoso)La confirmación de componentes y mecanismos de acción será de gran ayuda para el control de calidad del producto y los estudios de biodisponibilidad en el futuro. Al mismo tiempo, proporcionamos un nuevo método de análisis útil para determinar los glucósidos feniletanoides (1–3) en plantas, alimentos, sangre y tejidos para la investigación de huellas químicas y farmacocinéticas.
Palabras clave: Cistanche tubulosa; glucósidos de feniletanoide; enfermedad de Alzheimer; quelación de hierro
1. Introducción
La demencia es una de las enfermedades crónicas más comunes del envejecimiento. En 2015, el Informe Mundial sobre el Alzheimer estimó que alrededor de 46,8 millones de personas padecían demencia, y se espera que la cifra sea de 74,7 millones en 2030 y 131,5 millones en 2050 [1]. La población global de demencia aumentará año tras año y estará fuera de control en el futuro. Los gastos globales de atención médica para tratar la demencia fueron de casi 604 mil millones de dólares estadounidenses en 2010 y se espera que la cantidad sea de 1000 mil millones en 2030 [2]. Los pacientes con demencia tienen un mayor riesgo de muerte accidental [3] y, por lo tanto, requieren más atención médica. Esta es una carga pesada para los cuidadores familiares de pacientes con demencia. El impacto de la demencia en los cuidadores, la familia y la sociedad puede producir un gran estrés físico, psicológico, vital y económico. Hay dos formas principales de demencia, la enfermedad de Alzheimer (EA) y la demencia vascular [4,5]. La EA es la demencia más común y es un trastorno neurodegenerativo irreversible y progresivo [4–6]. AD fue la sexta causa principal de muerte en los Estados Unidos en 2015 [6].
Estudios recientes respaldan que la toxicidad neuronal inducida por la agregación del péptido amiloide (A) (placas) y la proteína tau (marañas) está estrechamente relacionada con la patogénesis de la EA. La acumulación de A y proteína tau en el cerebro puede provocar daño neuronal y pérdida de memoria [7]. Los oligómeros A insolubles se agregan en placas extracelulares y se informó que conducen a disfunción sináptica, toxicidad neuronal y muerte celular [8]. Desafortunadamente, no existe un tratamiento eficaz disponible hasta el momento para eliminar A y la proteína tau, o inhibir la formación u oligomerización de A, y suspender o curar el daño neuronal irreversible. Los agentes terapéuticos actuales, como la galantamina y el donepezil, que son inhibidores de la acetilcolinesterasa, solo pueden mejorar temporalmente la pérdida de memoria elevando el nivel de neurotransmisores. En 2012, ningún fármaco candidato pudo reducir el efecto A en grandes estudios clínicos en pacientes con EA [9]. Por lo tanto, se necesita con urgencia la investigación de un tratamiento novedoso para suprimir la prevalencia de la enfermedad de Alzheimer. Los iones metálicos se consideraron recientemente como un factor clave estrechamente relacionado con la agregación de A [10]. Los quelantes de metales considerados como posibles compuestos de plomo proporcionan una estrategia completamente nueva para el enfoque anti-AD [9,11–15].
El tallo seco de Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, se cosecha ampliamente en el desierto de Xinjiang, China. Es una importante medicina tradicional china que pertenece a la medicina china tónica indexada en la Farmacopea China y utilizada durante miles de años para el tratamiento de la debilidad física, la deficiencia renal, la infertilidad, el olvido, la impotencia y el estreñimiento senil [16,17].Extracto acuoso de Cistanche tubulosa(CTE) las cápsulas han sido aprobadas como medicamento botánico para la demencia vascular en China. Según un ensayo clínico de 18 pacientes diagnosticados con EA leve a moderada, CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)Las cápsulas dieron a los pacientes una condición de memoria más estable en comparación con los inhibidores de la acetilcolinesterasa [18]. En nuestro estudio anterior, el CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)disminución de la deposición de péptido amiloide (A) y mejora de la pérdida de memoria en ratas similares a la enfermedad de Alzheimer [19]. Los glucósidos feniletanoides, el equinacósido (1), el actósido (2) y el isoactósido (3) se consideran los componentes principales de la ETC.(Cistanche tubulosa extracto acuoso)[20]. El compuesto 1 tiene actividad neuroprotectora frente a la toxicidad de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) [21], 1-metil -4-ion de fenilpiridinio (MPP plus) [22], y 6-hidroxidopamina (6-OHDA) [23]. Nuestro informe anterior mostró que 1 suprimió la oligomerización y la toxicidad de A en un estudio in vitro e inhibió la deposición de A, mejorando la memoria deteriorada y la disfunción cognitiva en ratas inducidas por A [24]. Los compuestos 2 y 3 aumentaron la degradación de A y disminuyeron la oligomerización de A in vitro [25]. El compuesto 3 disminuyó la deposición de A en ratas inducidas por A [25]. Según estos estudios, C. tubulosa ya ha demostrado que tiene el potencial para tratar la EA. CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)está estrechamente relacionado con la agregación y el depósito de anti-A [24,25]. Para entender mejor claramente el CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)mecanismo, necesitamos tener un método conveniente y eficiente para identificar el componente activo, así como el contenido en muestras de tejido cerebral. La mayoría de los estudios se diseñaron para la determinación cuantitativa de echinacósido, acteósido e iso-acteósido en hierbas o alimentos mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) [26–28], pero solo dos estudios fueron para la determinación en suero o tejidos [29, 30]. Sin embargo, no existe un informe sobre el análisis simultáneo de 1-3 en tejidos cerebrales después de CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)administracion oral. Además, aún no está claro a partir de estudios recientes si el CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)los componentes activos o sus metabolitos atravesaron con éxito la barrera hematoencefálica y actuaron sobre las neuronas cerebrales. Por lo tanto, esta investigación proporciona un método avanzado y sensible con evidencia convincente que ilustra claramente el mecanismo subyacente de la ETC.(Cistanche tubulosa extracto acuoso)contra una agregación y deposición.
Cistanche tubulosa extracto acuoso
2. Resultados
2.1. Aislamiento e identificación de tres compuestos principales (1–3)
Los tallos secos de C. tubulosa se extrajeron con EtOH al 75 por ciento a temperatura ambiente. El extracto de EtOH al 75 por ciento condensado se sometió a cromatografía en columna de resina y C18 para proporcionar tres compuestos principales, equinacósido (1), acteósido (2) e iso-actósido (3). Sus estructuras se dilucidaron mediante el análisis de la espectroscopia de RMN (resonancia magnética nuclear) y ESI-MS (masa de ionización por electropulverización) y por comparación con los datos de la literatura [31–33] (Figura 1, Figuras de materiales complementarios S3–S11).
2.2. El ensayo de contenido de glucósidos feniletanoides (1–3) de CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)
El método de ensayo fue validado para el análisis de glucósidos de feniletanoide. Los compuestos 1–3 (5,0 mg) se pesaron con precisión y se mezclaron con 50 por ciento de metanol (40 ml). Las mezclas se sonicaron durante 5 min. Se mezcló una solución estándar de tres glucósidos de feniletanoide (1–3) como solución madre estándar (100 µg/mL). La solución madre estándar se usó para preparar cinco concentraciones diferentes (5, 10, 25, 50 y 100 µg/mL) de las soluciones indicadas, respectivamente, diluyéndolas con volúmenes en serie de metanol al 50 por ciento. Las curvas de glucósidos de feniletanoide (1–3) se establecieron mediante cromatografía líquida de ultrarresistencia (UPLC) de 5–100 µg/mL y fueron lineales respectivamente (1, r2=0.9999; 2, r{{25} }.9999; 3, r2=0.9998). La precisión intradiaria e interdiaria [porcentaje RSD (desviación estándar relativa) fue de 0,1 a 1,8 por ciento] y la precisión (95,6–104,2 por ciento) fue aceptable por UPLC para 1–3. La UPLC cuantificó el 1, 2 y 3 del CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)contenido de 254, 38 y 41 mg/g, respectivamente (Figura S2)
2.3. Validación UPLC/MS/MS
Los glucósidos de feniletanoide (1-3) se mezclaron y enriquecieron con homogeneizado de tejido cerebral de rata y se analizaron mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento-espectrómetro de masas en tándem (UPLC/MS/MS) con extracción en fase sólida. El límite inferior de detección (LLOQ) de 1 a 3 fue 0,2 ng/mL. La recuperación de glucósidos de feniletanoide aumentó con homogeneizado de tejido cerebral (10 ng/mL) al 91,39 % para 1, 89,54 % para 2 y 96,81 % para 3, respectivamente (Figura 2).
2.4. Análisis de tejidos cerebrales de rata similares a AD
Después de 14 días de CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)administración oral (200 mg/kg/día), se recolectaron tejidos cerebrales de ratas similares a AD y se dividieron en dos partes, hipocampo y cuerpo estriado, y ambas se homogeneizaron [19]. Debido a que los homogeneizados de hipocampo y cuerpo estriado de cada rata eran demasiado escasos para cargarlos en la extracción en fase sólida y para evitar errores experimentales excesivos, los homogeneizados de hipocampo y cuerpo estriado de cuatro ratas individuales se mezclaron en una muestra analizada para UPLC/MS/MS usando el método de extracción en fase sólida (Figura 3A, B). Los glucósidos feniletanoides (1–3) se observaron en el hipocampo (Figura 3A) y el cuerpo estriado (Figura 3B). No hubo un pico significativo en los tejidos cerebrales en blanco (Figura 3C). En el hipocampo el contenido de equinacósido fue de 11,97 ± {{20}},34 ng/mL, el contenido de acteósido fue de 1,25 ± 0,16 ng/mL y el contenido de isoactósido fue de 1,38 ± 0,08 ng/ ml. En el cuerpo estriado el contenido de equinacósido fue de 22,60 ± 1,69 ng/mL, el contenido de acteósido fue de 2,03 ± 0,61 ng/mL y el contenido de isoactósido fue de 4,90 ± 0,64 ng/mL. Como se muestra en la Figura 4, el CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)pasaría a través de la barrera hematoencefálica de acuerdo con las cantidades significativas detectables de 1 a 3 en el hipocampo y el cuerpo estriado. El contenido de 1 es muy superior a 2 y 3 en CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)por análisis UPLC (Figura S2). Por lo tanto, es razonable observar que 1 es el más alto en el tejido cerebral después de la ETC oral.(Cistanche tubulosa extracto acuoso)administración. Moléculas 2019, 24, x PARA REVISIÓN POR PARES 4 de 12 2.4. Análisis de tejidos cerebrales de rata similares a AD después de 14 días de CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)administración oral (200 mg/kg/día), se recolectaron tejidos cerebrales de ratas similares a AD y se dividieron en dos partes, hipocampo y cuerpo estriado, y ambas se homogeneizaron [19]. Debido a que los homogeneizados de hipocampo y cuerpo estriado de cada rata eran demasiado escasos para cargarlos en la extracción en fase sólida y para evitar errores experimentales excesivos, los homogeneizados de hipocampo y cuerpo estriado de cuatro ratas individuales se mezclaron en una muestra analizada para UPLC/MS/MS usando el método de extracción en fase sólida (Figura 3A, B). Los glucósidos feniletanoides (1–3) se observaron en el hipocampo (Figura 3A) y el cuerpo estriado (Figura 3B). No hubo un pico significativo en los tejidos cerebrales en blanco (Figura 3C). En el hipocampo el contenido de equinacósido fue de 11,97 ± {{20}},34 ng/mL, el contenido de acteósido fue de 1,25 ± 0,16 ng/mL y el contenido de isoactósido fue de 1,38 ± 0,08 ng/ ml. En el cuerpo estriado el contenido de equinacósido fue de 22,60 ± 1,69 ng/mL, el contenido de acteósido fue de 2,03 ± 0,61 ng/mL y el contenido de isoactósido fue de 4,90 ± 0,64 ng/mL. Como se muestra en la Figura 4, el CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)pasaría a través de la barrera hematoencefálica de acuerdo con las cantidades significativas detectables de 1 a 3 en el hipocampo y el cuerpo estriado. El contenido de 1 es muy superior a 2 y 3 en CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)por análisis UPLC. Por lo tanto, es razonable observar que 1 es el más alto en el tejido cerebral después de la ETC oral.(Cistanche tubulosa extracto acuoso)administrador.
2.5. La actividad quelante de metales de los glucósidos feniletanoides (1–3)
En la literatura, la determinación de los compuestos libres y su complejo metálico se realizó mediante HPLC [34,35]. La medida de la actividad de quelación fue analizada por UPLC en este estudio. Las soluciones de 50 µg/mL de cada glucósido feniletanoide (1–3) se agregaron a una solución de 10 µg/mL de cobre (Cu), calcio (Ca), magnesio (Mg), zinc (Zn), hierro (Fe) o suero de rata respectivamente. Cada compuesto con cada solución de metal o suero fue analizado por UPLC. Los glucósidos de feniletanoide (1–3) exhibieron actividad quelante de metales con hierro y suero (Figura 5, Materiales complementarios Figura S1). Moléculas 2019, 24, x PARA REVISIÓN POR PARES 5 de 12 muestras de ratas similares a AD después de CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)administración oral (200 mg/kg, po) [1 (tR= 4.19 min), 2 (tR= 5.13 min) y 3 (tR= 5.68 min)] . (c) Tejido cerebral en blanco. Figura 4. Los glucósidos de feniletanoide (1–3) fueron detectables en tejidos cerebrales de rata [19] usando UPLC/MS/MS. Los datos representaron la media ± SD, n=3 para cada grupo. 2.5. La actividad quelante de metales de los glucósidos feniletanoides (1-3). En la literatura, la determinación de los compuestos libres y su complejo metálico se realizó mediante HPLC [34,35]. La medida de la actividad de quelación fue analizada por UPLC en este estudio. Las soluciones de 50 ug/mL de cada glucósido feniletanoide (1–3) se agregaron a una solución de 10 ug/mL de cobre (Cu), calcio (Ca), magnesio (Mg), zinc (Zn), hierro (Fe) o suero de rata respectivamente. Cada compuesto con cada solución de metal o suero fue analizado por UPLC. Los glucósidos feniletanoides (1–3)
2.6. Análisis de echinacósido (1) en suero de rata in vivo
Para comprender la distribución de equinacósido en suero de rata, se recogió el suero desde el momento inicial hasta 720 min después de la administración oral de echinacoside (1) (100 mg/kg) y se recogió el suero desde el momento inicial hasta 720 min después de echinacoside (1) administración oral (100 mg/kg) y analizado por UPLC. La figura 6 muestra los perfiles de concentración frente al tiempo de equinacósido en suero de rata.
3. Discusión
La demencia, especialmente la EA, es una enfermedad crónica y de envejecimiento irreversible que conduce a un nudo gordiano de interrogantes. Esta enfermedad insuperable conduce a graves problemas económicos con una enorme y creciente carga financiera. En todo el mundo, los investigadores de la EA se esfuerzan mucho por investigar nuevos fármacos contra la EA, pero fracasaron en varios ensayos clínicos grandes dirigidos a la A en 2012 [9]. Excepto por apuntar directamente a A, la homeostasis de iones metálicos en el cerebro se considera la razón clave relacionada con la agregación y depósito de A que conduce a la formación de AD [9,10]. Por lo tanto, los iones metálicos juegan un papel esencial en la patogenia de la EA, y la hipótesis de la quelación de metales se ha convertido en una importante dirección de investigación [9,13-15].
Según nuestros estudios previos [18,19,24,25], CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)mostró actividad potencial contra la demencia. Incluso en estudios clínicos en humanos, después de 1 año de tratamiento con CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)cápsulas para pacientes con EA moderada, la puntuación de la subescala cognitiva de la Escala de evaluación de la enfermedad de Alzheimer (ADAS-cog) no mostraría un deterioro significativo en comparación con antes del tratamiento [18]. CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)mantuvo estable la puntuación ADAS-cog de los pacientes con EA, pero otros medicamentos recetados no lo hicieron. La única opción de medicamentos recetados autorizados para el tratamiento de la EA son los inhibidores de la acetilcolinesterasa (AChEI), como el donepezilo y la galantamina, que mejoran los síntomas de la EA a corto plazo, pero se produce un deterioro después de 1 año de tratamiento [36]. Basado en estudios clínicos, CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)tiene la oportunidad de ser un tratamiento potencial para el desarrollo de agentes anti-AD. Según nuestros informes anteriores [24,25], el echinacósido (1), el acteósido (2) y el iso-actósido (3) protegerían a las neuronas del daño por A, disminuirían la oligomerización de A in vitro y mejorarían significativamente la disfunción cognitiva inducida por A. en vivo. El estudio in vitro indicó que las dosis activas de 1–3 eran de hasta 50 ug/mL [24,25]. Pero estudios previos consideraron que la biodisponibilidad oral de 1 y 2 era muy baja (0.83 por ciento para 1 y 0.12 por ciento para 2) en ratas [29,30]. El compuesto 1 ni siquiera pudo identificarse en el suero humano después de la administración oral de tabletas de equinácea [37]. Los estudios actuales muestran que 1–3 tenían una permeabilidad de membrana y absorción deficientes en las células intestinales [38] y la mayoría de 1 se metabolizaría en los conductos gastrointestinales [39]. El contenido del compuesto 2 en el suero de la rata fue de solo alrededor de 4,5 ug/mL después de 15 minutos de inyección intravenosa con una dosis de 10 mg/kg de acteósido [30]. Sin embargo, este estudio muestra que se detectarían de 1 a 3 en el hipocampo y el estriado de los tejidos cerebrales de rata después de la ETC.(Cistanche tubulosa extracto acuoso)administración oral (Figuras 3 y 4). Además, la Figura 6 mostró que el contenido del compuesto 1 en suero de rata aumentó aproximadamente 5 veces desde 15 min hasta 720 min después de la administración oral del compuesto 1 (100 mg/kg). Consideramos los glucósidos feniletanoides de CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)pasaría a través de la barrera hematoencefálica y habría una acción de quelación entre CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso)y el metal La quelación es una reacción química reversible. El hierro es el elemento esencial en el suero y el cerebro [10,40]. La Figura 5 muestra que tres glucósidos de feniletanoide tendrían actividad quelante de metales con hierro y suero. El hierro y el suero obviamente cambian el área de tiempo de retención máxima de tres glucósidos feniletanoides. La quelación del hierro puede ser la razón crucial que conduce a la identificación errónea de la muy baja biodisponibilidad de los glucósidos feniletanoides. Por lo tanto, la actividad quelante de metales debe ser considerada en análisis de suero sanguíneo y cerebro de los tres CTE.(Cistanche tubulosa extracto acuoso)glucósidos de feniletanoide para recuperar la biodisponibilidad real y la farmacocinética. Además, los resultados indicaron que tres glucósidos feniletanoides (1-3) atravesarían la barrera hematoencefálica y llegarían a los tejidos cerebrales a través de la circulación corporal. Este estudio desarrolló un método más rápido y sensible para el análisis 1-3 utilizando UPLC/MS/MS y proporcionó evidencia poderosa para demostrar que los glucósidos feniletanoides (1-3) son los principales constituyentes bioactivos de CTE(Cistanche tubulosa extracto acuoso).
Extracto de Cistanche tubulosa
4. Materiales y Métodos
4.1. Material vegetal
Se recolectaron tallos de C. tubulosa en mayo de 2016 en Hangzhou, China. La planta fue identificada por el Dr. Lin HC. Los especímenes de vales (No. 20016CT) se depositaron en Sinphar Tian-LiPharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, China.
4.2. Aislamiento y Purificación
El tallo seco de C. tubulosa se molió hasta convertirlo en polvo y luego se extrajo cinco veces con EtOH al 75 por ciento. Después de la evaporación del solvente a presión reducida, el extracto crudo se sometió a cromatografía en columna de resina macroporosa AB-8 con sistemas de solventes en gradiente H2O/EtOH. desde 20 por ciento de EtOH hasta 100 por ciento de EtOH. Según la cromatografía en capa fina, se recogieron cuatro fracciones (Fr.1~Fr.4) para su posterior separación. Padre 2 se sometió a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) preparativa en una columna COSMOSIL® 5C18-AR-II (250 mm × 20 mm de d.i., 5 µm) utilizando acetonitrilo al 18 % como sistema de fase móvil. La velocidad del compañero fue de 15 ml/min. Se recolectaron selectivamente tres picos principales de interés. Las fracciones que contenían los compuestos objetivo se condensaron aún más hasta la sequedad y produjeron 1, 2 y 3, respectivamente.
4.3. Análisis experimental
Los espectros de RMN de 1H y 13C se obtuvieron utilizando espectrómetros Bruker Avance DRX de 500 MHz (Billerica, MA, EE. UU.) con tetrametilsilano (TMS) como estándar interno. La HPLC preparativa se realizó utilizando una columna de fase inversa (columna Cosmosil C18-AR-II, 250 mm × 20 mm id; NacalaiTesque, Inc., Kyoto, Japón) en una serie Shimadzu LC-6AD aparato con Prominence HPLC UV-Visdetectors (Kyoto, Japón).
Echinacósido (1):polvo blanco; ESI-EM m/z: 785 [M-H]-; RMN de 1H (CD3OD, 500 MHz):δ 1.07 (1H, d, J=6,2 Hz, Rha-H{{10} }), 2,79 (2H, t, J=5,2 Hz, H-7), 3,56 (1H, m, Ha{{20}}), 3,79 (1H, m, H-30 ),3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7,7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J=7,9 Hz, H-10 ), 5.00 (1H, t, J=9,6 Hz, H-40 ), 5,17(1H, d, J=1,5 Hz, Rha-H-1), 6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-800 ), 6,58 (1H, dd, J=8,1,2,0 Hz,H-6), 6,67 (1H, d, J=8,1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,77 (1H, d, J=8,2 Hz, H{ {86}} ), 6,94 (1H,dd, J=8,3, 2,0 Hz, H-600 ), 7,05 (1H, d, J=2,0 Hz, H{ {100}} ), δ 7,59 (1H, d, J=15,9 Hz, H-700 ); RMN 13C (CD3OD, 125 MHz): δ 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C{{ 124}} ), 70,5 (C-40 ), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3) , 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50 ), 75,1 (Glc-C -2), 76,1 (C-20 ), 77,8 (Glc-C-5), 77,9 (Glc-C-3), 81,7 (C-30 ) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10 ), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200 ), 115,3 (C{{ 188}} ), 116,3 (C-500 ), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 203}} ), 127,6 (C-100 ), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{ 218}} ), 148,2 (C-700 ), 149,8 (C-300 ), 168,5 (C-900 ) (Figura S3–S5)
Acteósido (2):polvo blanco; ESI-EM m/z: 623 [M-H]-; RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz): δ 0,94(3H, d, J =5,9 Hz, H{{1{{ 156}}}} ), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7,8 Hz, H{{20}} ), 4,70 (1H, t, J=9,0 Hz, H-400 ), 5,01 (1H, s, H-1000 ), 6,18 (1H, d, J=15 0,9 Hz, H-80 ), 6,48 (1H, día, J=7,9, 1,4 Hz, H-6), 6,62 (1H, día, J=7 0,1 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,75 (1H, d, J=7,9 Hz , H-50 ), 6,97 (1H, d, J=8,1 Hz, H-60 ), 7,01 (1H, s, H-20 ), 7,44 (1H , d, J=15.8 Hz, H-70 ); RMN de 13C: (DMSO-d6, 125 MHz): δ 18,2 (C-6000 ), 35,1 (C-7), 60,8 (C-600 ), 68,8 (C{{94} } ), 69,2 (C-400 ), 70,3 (C-3000 ), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000 ), 70,6 (C{{109} } ), 71,7 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 79,2 (C-300 ), 101,3 (C-1000 ), 102,3 (C{{124} } ), 113,6 (C-80 ), 114,7 (C-20 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C{{139} }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60 ), 125,6 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,6 (C{{154} }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30 ), 145,6 (C-70 ), 148,5 (C-40 ), 165,7 (C{{169} } ) (Figuras S6–S8).
Iso-actósido (3):polvo blanco; ESI-EM m/z: 623 [M-H]-; RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz):δ 1.07 (3H, d, J=6,1 Hz, H{{10} } ), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J=10,0 Hz, H-100 ), 5,10 (1H, s, H{{ 24}} ), 6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-80 ), 6,45 (1H, dd, J=8,0, 1,8 Hz, H{{ 38}}), 6,58 (1H, d, J=8,8 Hz, H-5), 6,73(1H, d, J=1,6 Hz, H{{50} }), 6,74 (1H, d, J=8,1 Hz, H-50 ), 6,94 (1H, d, J=8,2 Hz, H-60 ) , 7,04 (1H, s, H-20 ),7,46 (1H, d, J=15,8 Hz, H-70 ); RMN de 13C (DMSO-d6, 125 MHz): δ 17,9 (C-6000 ), 35,2 (C-7), 63,5 (C-600 ),68,2 (C-5000 ), 70,4 (C-400 ), 70,6 (C-3000 ), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000 ), 73,7 (C-4000 ), 74,1 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 80,9 (C-300 ), 100,7 (C-1000 ), 102,7 (C-100 ), 113,9 (C-20 ), 114,9 (C-80 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50 ), 116,3 (C-2 ), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60 ), 125,5 (C-10 ), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4 ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30 ), 145,6 (C-70 ), 148,5 (C-40 ), 165,6 (C-90 ) (Figuras S9–S11).
4.4. Preparación del Extracto Acuoso de Cistanche Tubulosa (CTE)
El tallo del polvo de Cistanche tubulosa se extrajo dos veces a reflujo con agua durante 1,5 hy la solución del extracto se filtró. el filtradoCistanche tubulosaextracto acuoso(CTE) se almacenó a 4 ◦C antes de su uso.
5. Conclusiones
Este estudio demostró que 1–3 es el componente activo de CTE para la actividad anti-AD. La quelación de hierro se ha convertido en el nuevo concepto para diseñar una nueva generación de fármacos para el tratamiento de la EA [41]. La CTE es una posible medicina botánica china anti-EA que se enfoca en la agregación y depósito de A inducida por la quelación de hierro. Además, probamos además que 1-3 llegarían al cerebro a través de la barrera hematoencefálica (BBB). La confirmación de los componentes activos y el mecanismo subyacente de CTE ayudará en gran medida al control de calidad y la biodisponibilidad de los estudios de productos en el futuro. Al mismo tiempo, el método de análisis avanzado y eficiente presentado será útil para determinar 1–3 en plantas, alimentos, sangre y tejidos cerebrales para la investigación de huellas químicas y farmacocinéticas.
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