Investigar el mecanismo por el cual Cistanche Deserticola trata la enfermedad de Alzheimer utilizando la farmacología de la red y la validación experimental
Dec 10, 2024
[Abstracto]
Objetivo: explorar elMecanismo potencial de la desértica de Cistanche en la enfermedad de Alzheimer (AD)a través deFarmacología de la redy experimentos con animales.
Métodos:PredicciónLos objetivos relacionados con la enfermedad de Cistanche y Alzheimer utilizan la farmacología de la red; 40 ratones SAMP8 masculinos 7- de un mes se dividieron aleatoriamente en un grupo de control de modelo (modelo), una dosis baja (L-GC), una dosis media (M-GCS) y un grupo de tratamiento con dosis altas (H-GC) y 10 ratones SAMR1 antienvejecimiento masculinos de la misma edad se utilizaron como el grupo de control SAMR1. Después de 30 días de administración intragástrica de GCS, los experimentos de laberinto de agua Morris y laberinto Y se utilizaron para probar las habilidades de aprendizaje y memoria de cada grupo de ratones. La tinción de NISSL se utilizó para observar el número y la morfología de las neuronas en la región del hipocampo CA1 de los ratones. Se usaron tinción inmunohistoquímica y experimentos de transferencia Western para detectar la expresión de PI3K, P-AKT y P-Tau en el hipocampo de ratones. Resultados: 8 componentes efectivos, incluido el verbascosido, se seleccionaron desde la desértica de Cistanche, y los genes centrales involucrados en el tratamiento con AD fueron Akt1, TNF, CASP3, etc. Las vías de señalización relacionadas con el tratamiento con AD por Cistanche Deserticola incluyeron PI3K-AKT, rutas TNF y vías de edad de edad. Los experimentos con animales mostraron que, en comparación con el grupo modelo, la latencia de escape y la distancia total en la prueba de navegación del laberinto de agua de Morris disminuyeron significativamente (P<0.05), and the number of platform crossings significantly increased (P<0.05) in the spatial exploration test of the GCs group. In the immunohistochemical staining and Western blot experiments, the ratio of PI3K and P-Akt/Akt in the GCs group significantly increased (P<0.05), while the expression of P-Tau/Tau significantly decreased (P<0.05). Conclusion: GCs may improve the learning and cognitive abilities of SAMP8 mice by regulating the PI3K-AkT signaling pathway and regulating the expression of P-Tau protein.
[Palabras clave]Farmacología de la red;Enfermedad de Alzheimer; Desérticola de Cistanche; Ratones samp8; Apoptosis
Suplementos herbales de cistancos de alta calidad
1 Materiales y métodos
1.1 Materiales
1.1.1 bases de datos y plataformas de análisis
Las principales bases de datos y las plataformas de análisis utilizadas en este estudio (Tabla 1).
Tab 1 Plataformas analíticas relevantes y bases de datos utilizadas en este estudio
| Nombre | Sitio web | Versión |
|---|---|---|
| Base de datos de farmacología de Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP) | https://www.tcmsp-e.com/ | 2.3 |
| Uniprot | https://www.uniprot.org/ | |
| Pubchem | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ | |
| Venado | https://bioinfo.cis.cornell.edu/tools/venn/ | |
| Genield | https://www.genecards.org/ | |
| Base de datos NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ | |
| Omim | https://omim.org/ | |
| Base de datos de cadena | https://cytoscape.org/ | 11 |
| Software de cytoscape | https://cytoscape.org/ | 3.8.0 - 3.9.1 |
| MetaScape | https://etascape.org/ |
1.1.2 Animales experimentales
Los animales experimentales utilizados en este experimento fueron ratones propagados de ratón de ratón acelerado de grado SPF masculino, que se elevaron de 2 meses a 7 meses de edad e incluyeron en el experimento. Todos los animales se criaron en la sala de animales de grado SPF del Centro de Experimentos Animales del Colegio Médico Baotou de la Universidad de Ciencia y Tecnología del Interior de Mongolia [SyXK (Meng) 2018-0001], con una temperatura de (24. 0 ± 1. 0) grado y humedad controlada con 62 de 52%. Se proporcionaron suficientes alimentos y agua potable, y los ratones eran libres de comer y beber. El ciclo de luz/oscuridad fue de 12 h/12 h para garantizar el ritmo circadiano normal de los ratones. Todas las operaciones animales y los protocolos experimentales involucrados en este experimento se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité de Ética Animal experimental de Baotou Medical College (Baoyi Ethics 2018 No. 011).
1.1.3 Reactivos e instrumentos principales
El tampón de lisis RIPA de alta eficiencia (R0010), la solución luminiscente ultra sensible (PE0010), el tampón de electroforesis (T1070), el tampón de transferencia (D1060), el tampón de carga de proteínas (P1015), etc., se compraron a partir de Beijing Solebao; El kit de inmunohistoquímica (PV -9000) se adquirió de Beijing Zhongshan Jinqiao; El kit de detección de proteínas BCA (23227) se adquirió de Thermo Scientific, EE. UU. Fosfoinositida 3- quinasa (PI3K) anticuerpo, proteína quinasa B proteína quinasa B (Akt) anticuerpo (AF0016), anticuerpo P -AKT (AF6261) se adquirió de Wuhan Qinke Biological Research CO., LTD., -Actina (52901) de Sab, USA, USA; El anticuerpo secundario anti-conejo de cabra (SA 00001-2) se adquirió de ProteIntech, EE. UU.
Slicer de parafina (Leica, Alemania), Microscopio óptico (Leica, Alemania), Cámara de prueba de campo abierto (Shanghai Xinruan), Morris Water Maze -80 grado de temperatura de temperatura ultra baja (Thermo Fisher, EE. UU.), Aparato de electroforesis (Beijing liuyi Biotechnology Co., Lterization. (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.), Sistema de análisis de imágenes de gel de proteínas (Shanghai Tanon Technology) y Microplate Reader (Thermo Fisher, EE. UU.).
1.2 Métodos
1.2.1 Análisis de farmacología de red
1.2.1.1 Detección de ingredientes activos y puntos objetivo de Cistanche Deserticola
Detección de puntos objetivo de Cistanche Deserticola: todos los ingredientes activos químicos se buscaron en la base de datos TCMSP (https://www.tcmsp-e.com) con la deserticola de Cistanche como la palabra clave, y la biodiebre oral (OB) mayor que o igual a 3 {{2}% y drogas similares (dl) Grande de las condiciones más grandes de los que se limitó o igual a las condiciones iguales a 0. Para detectar los compuestos recolectados; La plataforma Swiss ADME se utilizó para complementar los ingredientes químicos que no se encuentran en la plataforma TCMSP con una puntuación de absorción gastrointestinal (absorción gastrointestinosa) de una imagen "alta" y de fármacos de al menos 2 "sí" como estándar, y junto con los inhebrados activos comunes de la deserticola de Cistanche recolectada por la búsqueda literaria, los nombres estándar de los objetivos se obtuvieron a través de los objetivos a través de la base de datos no de la base de datos no de la base de la base de la base noiprot.
(https://www.uniprot.org) [10].
1.2.1.2 Adquisición de objetivos de enfermedad AD
Utilizando la "enfermedad de Alzheimer" como término de búsqueda, busque objetivos de enfermedad en OMIM, genielos y bases de datos NCBI.
1.2.1.3 Venn Diagrama Creación y red de interacción proteína-proteína (PPI) Construcción
Ingrese objetivos de medicamentos y objetivos de enfermedad en el sitio web del diagrama de venny, cree un diagrama de Venn y obtenga la intersección de los objetivos. Importe la base de datos de cadenas para construir una red de interacción de proteínas, establecer la especie biológica en "Homo sapiens" y obtener un diagrama de la red de interacción de proteínas. Use el software Cytoscape para filtrar los objetivos centrales en función del grado, la cercanía y los valores de intermediación de los objetivos, y use el complemento Analyze para dibujar el gráfico.
1.2.1.4 GO y análisis KEGG
Use la plataforma en línea David en línea y la plataforma en línea de MetaScape para realizar el análisis de enriquecimiento GO y KEGG en los objetivos centrales relacionados mencionados anteriormente, y detecte los elementos con P menos o igual a 0. 05. Los diagramas de burbujas del análisis de enriquecimiento GO y KEGG se dibujaron utilizando la micro-información de la plataforma de dibujo en línea.
1.2.2 Agrupación de animales experimentales y preparación del modelo
40 ratones SAMP8 se dividieron aleatoriamente en el grupo modelo, el grupo de deserticola cistancos (L-GC), el grupo de deserticola Cistanche (M-GCS) de dosis de dosis (M-GCS) y el Grupo de Desercola Cistanche (H-GCS), con 10 ratones en cada grupo; Se usaron 10 ratones SAMR1 del mismo sexo y peso como grupo de control SAMR1. El grupo L-GCS, el grupo M-GCS y el grupo H-GCS se engrandieron con GCS a una dosis de 25 mg/(kg · d), 50 mg/
(kg · d), y 100 mg/(kg · d), respectivamente. El grupo SAMR1 y el grupo modelo recibieron la misma dosis de solución salina normal, y todos los grupos fueron gavificados durante 30 días consecutivos.
1.2.3 Experimento de comportamiento
1.2.3.1 Experimento de laberinto de agua de Morris
Experimento de navegación de ubicación: del día 24 al 30 de la administración de GCS, el experimento de navegación de ubicación se llevó a cabo en los primeros 1 a 5 días. El laberinto de agua se dividió en cuatro cuadrantes, y la plataforma se colocó en el tercer cuadrante, ligeramente más alto que la superficie del agua en 2 cm. El mouse se colocó en el agua con la cabeza frente a la pared de la piscina, y se observó si podía encontrar la plataforma dentro de los 60 segundos especificados y permanecer en la plataforma durante 2 a 3 segundos. La frecuencia de entrenamiento para cada mouse era cuatro veces al día, y el punto de partida de cada vez era un cuadrante diferente. El intervalo de tiempo entre cada dos entrenamientos no debe ser inferior a 15 minutos. Si el mouse no encontró la plataforma en 60 segundos, fue guiado para permanecer en la plataforma durante 3 a 5 segundos. Durante el experimento, se registraron la latencia de escape y la longitud de la ruta de cada grupo de ratones; Después de 6-7 días, se utilizó un experimento de exploración espacial: se eliminó la plataforma en el tercer cuadrante y los ratones comenzaron el experimento de exploración del primer cuadrante. El tiempo de exploración fue de 60 s, y se registró el número de cruces de plataformas y el porcentaje de tiempo en el cuadrante objetivo de cada grupo de ratones.
1.2.3.2 Experimento de laberinto de Y
El laberinto y consta de tres brazos del mismo tamaño y forma: el brazo inicial, el brazo novedoso y los otros brazos. Antes del experimento, se bloqueó la entrada del brazo novedoso, permitiendo que los ratones exploren libremente los dos brazos restantes durante 10 minutos. 1 h Después de la exploración, se abrió la entrada al brazo novedoso, y el mouse se colocó al comienzo del brazo inicial. El momento en que el mouse exploró el brazo novedoso en 5 minutos se registró, y se calculó el número de veces que el mouse ingresó y salió con éxito el brazo novedoso. La tasa de alternancia espontánea del mouse se calculó [tasa de alternancia (%)=de alternaciones exitosas/(número total de entradas de brazo -2) × 100%] [14].
1.2.4 Tinción de Nissl
Después de 30 días de administración de drogas, los ratones fueron anestesiados y perfundidos con solución salina en el corazón. Después de que se drenó la sangre, los ratones fueron asesinados y se tomó el tejido cerebral. El tejido cerebral de los ratones se fijó por inmersión en paraformaldehído al 4% para 24-48 H, se deshidrató con alcohol en gradiente ascendente, transparentizado con xileno e incrustado en parafina. El grosor de la rebanada fue de 5 μm. Rutina de rutina al agua, tinción con azul de metileno, diferenciación, deshidratación de etanol, xileno transparente y sellado de resina. La morfología y el número de neuronas en la región CA1 del hipocampo del ratón se observaron bajo un microscopio a las 200 veces.
1.2.5 Tinción inmunohistoquímica
Las secciones del tejido cerebral se despojaron rutinariamente al agua, se colocaron en solución de reparación de antígeno de citrato de sodio y se calentaron con microondas de alta presión, enjuagados con tampón PBS durante 5 minutos × 3 veces, agregado bloqueador de peroxidasa endógeno, enjuagado con PBS durante 5 minutos × 3 veces, incubado con anticuerpo primario y incubado a 4 grados durante la noche. Al día siguiente, enjuagado con tampón PBS durante 5 minutos × 3 veces, luego agregó una solución de mejora de reacción, se lave nuevamente con PBS durante 5 min × 3 veces, incubado con anticuerpo secundario a 37 grados durante 20 minutos, enjuagado con PBS durante 5 min × 3 veces, luego se usó la solución de tinción DAB para el desarrollo de color, el hematoxilino contramedado con el ascendente con el ascendente con calcetería con calcetería y el calentamiento de ascendencia y el calentamiento de ascendencia y el calentamiento de ascendencia y el calentamiento de ascendencia y el calentador de ascendencia y el calentamiento de ascendencia con el ascendente y el calentamiento con el ascendencia y el calentamiento de ascendencia y el calentador de ascendencia con el ascendente con el ascendencia y el calentamiento de los ascendentes con el ascenso y el aches. xileno.
1.2.6 Western Blot
Se añadió parte del tejido del hipocampo de ratón al tampón de lisis RIPA de proteína, completamente molido con una caña de molienda, homogeneizado por ultrasonido en un baño de hielo y se dejó en hielo durante 30 minutos. Luego use una ultracentrífuga de baja temperatura para centrifugarse a las 12, 000 r/min durante 15 minutos, tome el sobrenadante y use el método BCA para determinar su concentración de proteínas. Tome 20 ug de proteína y agréguelo al tampón de carga de proteínas, desnuda a 100 grados durante 5 minutos, instale el gel concentrado preconfigurado y el gel de separación en el tanque de electroforesis, y realice electroforesis de voltaje constante de 80 V durante 60 minutos después de la carga, y luego ajustarlo a la electroforesis de voltaje constante de 120 V durante 80 minutos. Luego use la corriente constante de 300 mA y transfiera la membrana durante 130 min. Bloquee con leche descremada a temperatura ambiente durante 2 h, diluya el anticuerpo primario a 1: 1 500 veces, incubate en un refrigerador a 4 grados durante la noche, lave la membrana e incuba el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 2 h. Después de desarrollar con un sistema de análisis de imágenes, analice el valor gris de cada grupo de bandas.
1.2.7 Análisis estadístico
Todos los datos se expresaron como media ± desviación estándar (x s), y SPSS 25. 0 y el software GraphPad Prism9.5 se utilizaron para el análisis de datos y los gráficos. La prueba SNK-Q se usó para la comparación por pares, y se usó Anona unidireccional para una comparación de muestras múltiples. PAG<0.05 indicated statistically significant differences.
