Investigación sobre los efectos y mecanismos antidepresivos de los glucósidos de feniletanol cistanche en ratones
Dec 17, 2024
Abstracto:
Este estudio tiene como objetivo investigar los efectos y mecanismos terapéuticos deGlucósidos de feniletanol cistanche(CPHG) sobre el comportamiento similar a la depresión inducido por el estrés leve crónico impredecible (CUM) en ratones. Los ratones se dividieron aleatoriamente en grupo control, grupo modelo, grupo CPHGS de dosis altas (700 mg/kg), grupo CPHGS de dosis media (350 mg/kg), grupo CPHGS de dosis bajas (175 mg/kg) y grupo de fluoxetina (15 mg/kg). Después de cuatro semanas de intervenciones de fármacos correspondientes, se realizaron pruebas neuroconductuales; El ensayo inmunosorbente ligado a enzimas se usó para detectar niveles de neurotransmisores en suero, así como el contenido de factores inflamatorios y mediadores en el tejido del hipocampo. Se emplearon la tinción de hematoxilina-eosina y NISSL para observar cambios patológicos en el tejido del hipocampo. Se utilizaron métodos de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia para analizar la densidad de los astrocitos y la microglia en el tejido del hipocampo de los ratones, así como los niveles de expresión del receptor 4/factor nuclear κB/proteína del receptor 3 (TLR4/NF-κB/NLRP3). Los resultados mostraron que los CPHG podrían mejorar el comportamiento similar a la depresión en ratones, aumentar la preferencia por el agua dulce y reducir el tiempo de inmovilidad, mejorando significativamente los niveles de serotonina y dopamina en suero de ratón, al tiempo que inhibe la expresión de mediadores inflamatorios y factores en el hipocampo. El análisis inmunohistoquímico indicó que los CPHG podrían aumentar la densidad de los astrocitos en el hipocampo, reducir la activación de la microglia e inhibir la expresión de proteínas relacionadas con el inflamasoma NLRP3. Los experimentos de inmunofluorescencia demostraron que el mecanismo a través del cual los CPHG reducen la formación de inflamasoma es disminuyendo la activación de la vía de señalización TLR4/NF-κB en el tejido del hipocampo. En resumen, los CPHG exhiben efectos antidepresivos significativos enDepresión inducida por cums como comportamiento, potencialmente a través de la regulación de los niveles de neurotransmisores y la inhibición de las respuestas neuroinflamatorias, proporcionando evidencia experimental de su aplicación en el tratamiento de la depresión.
Palabras clave: glucósidos de feniletanol de Cistanche; depresión; Respuesta neuroinflamatoria; astrocitos; Ruta TLR4/NFκB/NLRP3
Materias primas de Herbal Cistanche
La depresión es un trastorno mental afectivo común y complejo caracterizado por síntomas como el bajo estado de ánimo, la anhedonia, el pensamiento lento y la disfunción fisiológica. En casos severos, pueden ocurrir tendencias suicidas [1]. Según el "Informe sobre el estado de nutrición y enfermedad crónica de los residentes chinos (2020)", la prevalencia de depresión en mi país alcanzó el 2,1%, y fue enumerada por la Organización Mundial de la Salud como una de las enfermedades con las tasas de discapacidad más altas del mundo [2]. Dado que la patogénesis de la depresión es muy compleja, el mecanismo específico sigue sin estar claro hasta la fecha, lo que plantea un gran desafío para su tratamiento. En los últimos años, los académicos nacionales y extranjeros han encontrado que la depresión puede estar estrechamente relacionada con la activación inflamatoria inmune. En el proceso de activación de la respuesta inflamatoria en el sistema nervioso central, la activación de las células inflamatorias del hipocampo es su manifestación característica. Las células inflamatorias del hipocampo activadas continuamente inducen la liberación de múltiples citocinas inflamatorias, formando un "efecto cascado" de citocinas inflamatorias, participando así en la patogénesis y el proceso patológico de enfermedades mentales como la depresión [3]. Actualmente, el tratamiento de esta enfermedad se basa principalmente en la medicina occidental, como la fluoxetina, la venlafaxina, la duloxetina, etc. Sin embargo, existen deficiencias, como la baja tasa de curación clínica, síntomas residuales prominentes, alta tasa de recurrencia y disfunción órgano fácil de causar, lo que limita su aplicación clínica [4]. La medicina tradicional china tiene las ventajas de más objetivos y menos efectos secundarios en el tratamiento de enfermedades emocionales, y tiene amplias perspectivas de aplicación en el tratamiento de la depresión y sus complicaciones [5].
Deserticola de Cistanchees el tallo carnoso seco con hojas de fósforo de Deserticola ycma y/o Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, las cuales son plantas de la familia Oobanchaceae. Es un buen producto de comida y medicina. La investigación farmacológica moderna ha confirmado que el deserticola de Cistanche tiene un efecto neuroprotector (puede inhibir la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, etc.). Las cápsulas de "glucósidos totales de Cistanche", que se componen principalmente de glucósidos de feniletanol en la desértica de Cistanche, se usan ampliamente en el tratamiento de enfermedades neurológicas [6]. Los glucósidos de feniletanol (CPHG) son ingredientes activos importantes en los glucósidos totales de Cistanche. Tienen múltiples funciones biológicas como antitumorales, inmunomodulación y antioxidantes, y muestran buenas perspectivas de aplicación [7]. Estudios anteriores han demostrado que los CPHG pueden proteger los efectos de las monoaminas y aliviar los síntomas depresivos al aumentar la vía metabólica de ceramida en la sustancia negra y el contenido de dopamina (DA) en el cuerpo estriado [8]; También puede ajustar el comportamiento depresivo de los ratones con síndrome perimenopáusico al mejorar el nivel de neurotransmisores de monoamina en el cerebro [9]. Sin embargo, no ha habido informes sobre su uso en el tratamiento del modelo de depresión del ratón inducido por estrés crónico impredecible (CUMS), y su mecanismo de acción queda por dilucidar. Based on previous research and combined with the current potential of CPhGs in anti-oxidative stress, regulating neuroinflammation and inhibiting neuronal apoptosis, this study used the CUMS-induced mouse depression model to study the antidepressant effect of CPhGs and the mechanism of action of the TLR4/NF-κB/NLRP3 pathway in improving neuroinflammation, providing experimental basis for further exploring the Efecto antidepresivo de CPHGS, expandiendo su aplicación clínica y desarrollarlo y utilizarla como un alimento saludable.
1 Materiales y métodos
1.1 Materiales e instrumentos
Extracto de CPHGS (glucósidos de feniletanol en el extracto mayores o igual al 85%, incluido el equinacósido mayor o igual al 40%, verbascosido mayor o igual a 16%; número de lote: 20231221, Xinjiang Hotan Pharmaceutical Biological Co., Ltd.);;;; Cápsulas de clorhidrato de fluoxetina (fluoxetina, FLX) (número de lotes: 8533c, Patheon France Pharmaceutical Company, Francia); 5- Hydroxytryptamine (5- ht), kit de detección DA (número de lotes: 20240305, 20240305, Shanghai Future Industrial Co., Ltd.); óxido nítrico nítrico sintasa (inos) inducible, ciclooxigenasa -2 (ciclooxygenasa -2, cox -2), prostaglandina e2 (prostaglandina e2, pGe2), tumor necrosis factor alpha (tumor necrosis al alpha, tnfa, tnfe-1, tnfer (interleucina {-1, il {-1), IL {-18} (interleucina {-18, il {-18), il {-6}} (interleucina 6, IliL -6} », interferente-(interfermin-}} ifi-} if-} if-} if-} if-} if-} if-interleucina 6, interleucina 6, IL Itferon-(interleukina 6, interleucina 6, ILi-interleucina 6, ifniL-{24})). Kits de ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (lote no.: ER050A332132, ER035PD09812, ER048H753146, ER10X6398452, ER051H648219, ER09X2865471, ER049H746823, ER07297297844444 Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); ionized calcium-binding adapter molecule 1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1, Iba-1) monoclonal antibody, glial fibrillary acidic protein (GFAP) monoclonal antibody, NOD Nod-like receptor protein 3 (NLRP3) monoclonal antibody (Batch No. GR3417890-15, Gr 3379124-30, gr 3285067-28, abcam, uk); Anticuerpo monoclonal de tipo Toll (TLR4), factor nuclear fosforilado κB p65 (factor fosfo-nuclear κB p65, p-nf-κB p65) antibuerso monoclonal (lotes lotes n. ° 10032512, 00128965, wuhan synology co., ltd.); Kit de tinción de inmunofluorescencia al 4%, kit de tinción de inmunofluorescencia (lote No. 20240106, 20240315, Shanghai Bio-Technology Co., Ltd.); Kit de tinción con eosina de hematoxilina y eosina (hexa), HE), kit de tinción NISSL (número de lotes: 20240401, 20240402, liaoning meilun biology); Inmunohistoquímica Kit Universal (Número de lotes: 43731a, Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd.).
Me2 0 4e 1/10, 000 Balance electrónico (Mettler Toledo, EE. UU.); Milli-Q Laboratorio del sistema de agua pura (Merck, Alemania); Spectramax ID3 Lector de microplacas multifuncionales (Molecular Devices, EE. UU.); Microscopio vertical Leicadm 2000 Fluorescencia (Leica, Alemania); 63008 Campo abierto, 63010 Elevated Plus Maze, 63022 Natación forzada, DB001 Morris Water Maze, Sistema de análisis de video Smart 3.0 Animal Behavior (Shenzhen Ruiwode Life Science Co., Ltd.).
60 ratones SPF C57BL/6, que pesaban 18-22 g, se adquirieron de Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd. (Licencia de producción No. SCXK (Beijing) 2020-0033, Licencia de uso de animales experimentales No. Syxk (Beijing) 2021-0011).
Los ratones se mantuvieron en un entorno SPF, con la temperatura ambiente controlada en (21 ± 2) grado, la humedad mantenida al 60% ± 10% y un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Los ratones tenían acceso libre a la comida y el agua, y el experimento comenzó después de 1 semana de alimentación adaptativa. Los animales experimentales se mantuvieron en el Centro Animal Experimental de la Universidad de Medicina China Shaanxi. Todos los procedimientos experimentales del ratón en este estudio han sido aprobados por el Comité de Ética de Experimentos Animales de la Universidad de Medicina China Shaanxi (SucMDL20231015003).
1.2 Métodos experimentales
1.2.1 Agrupación, modelado y administración de drogas
After 1 week of adaptive feeding of 7-week-old SPF C57BL/6 mice, non-elastic mice that met the requirements of subsequent experiments were screened out through the sugar water preference test and randomly divided into a control group (Con), a model group (Mod), a high dose CPhGs group (CPhGs-H; 700 mg/kg), a middle dose CPhGs group (CPHGS-M; 350 mg/kg), un grupo CPHGS de dosis baja (CPHGSL; 175 mg/kg) y un grupo de fluoxetina (FLX; 15 mg/kg), con 10 ratones en cada grupo. A excepción de Con, los ratones en los otros grupos comenzaron a ser sometidos a estrés CUMS durante 4 semanas [10]. Se utilizaron un total de 10 estresores, incluidos restricciones (1 h), agitación (1 h), suspensión de cola (1 h), {19}}} tilt de jaula de grado (24 h), ropa de cama húmeda (24 h), jaula vacía (24 h), iluminación nocturna (12 h), 41 grados nada de agua caliente durante 5 min, 4 grados de agua de agua helada durante 5 min, y cola de cola durante 2 min. Dos estímulos fueron seleccionados al azar todos los días, y el mismo estímulo no apareció en dos días consecutivos. Después de 4 semanas de modelado, los ratones CPHGS-H, CPHGS-M y CPHGS-L recibieron dosis CPHGS correspondientes por sonda según el peso corporal, y los ratones FLX recibieron fluoxetina por sonda (10 mg/kg). La dosis de CPHGS-M y FLX en ratones se convirtió de acuerdo con el coeficiente equivalente de la superficie del cuerpo entre adultos y ratones, y la fluctuación de 2 veces fue las dosis bajas y altas de CPHG. Los ratones con CON y Mod recibieron un volumen igual de agua desionizada por gavage. Los ratones fueron gavificados una vez al día durante 4 semanas. Las pruebas neuroconductuales se realizaron la octava semana.
1.2.2 Experimento neuroconducteral
1.2.2.1 Experimento de preferencia de agua de azúcar
Antes de la prueba de preferencia de sacarosa (SPT), los ratones deben alojarse en una sola jaula y luego adaptarse a agua azucarera durante 3 días. El primer día, se administraron dos botellas de agua de sacarosa al 1% durante 24 horas, y el segundo día, se administró una botella de agua azucarera y una botella de agua desionizada durante 24 horas. En el tercer día, las posiciones de agua azucarera y agua pura se intercambiaron durante 24 horas, y el experimento terminó 24 horas después. En el cuarto día, los ratones fueron ayunados y privados de agua durante 24 horas. En el quinto día, se administró una botella de agua azucarera y una botella de agua pura después del pesado, y las posiciones se intercambiaron después de 12 horas. Después de 24 horas, las dos botellas se sacaron y pesaron nuevamente, y se calculó la tasa de consumo de agua de azúcar (tasa de consumo de agua azucarera=consumo de agua de azúcar/(consumo de agua de azúcar + consumo de agua) × 100%).
1.2.2.2 Prueba de campo abierto
La prueba de campo abierto (OFT) se realizó en una caja abierta de cubo de 50 cm × 50 cm × 50 cm. El centro de la caja se definió como un cuadrado con una longitud lateral de 25 cm. Los ratones se colocaron en el centro de la caja y se dejaron adaptarse durante 5 minutos. La trayectoria de movimiento de los ratones se analizó en los últimos 5 minutos. Los indicadores de evaluación incluyeron la distancia de movimiento total de los ratones en el campo abierto, el tiempo de actividad en el centro del campo abierto y el número de veces que ingresaron al centro. 1.2.2.3 Prueba de suspensión de cola La prueba de suspensión de cola (TST) es suspender el mouse por su cola para que su cabeza se mantenga a cierta distancia del suelo. Se registró la lucha de los ratones en 6 minutos, y se analizó el tiempo de inmovilidad de los ratones en los últimos 4 minutos.
1.2.2.4 Prueba de natación forzada
La prueba de natación forzada (FST) debe colocar ratones en un barril cilíndrico transparente (15 cm de diámetro × 50 cm de altura) llena de agua (25 ± 2) de agua, con el nivel de agua que alcanza 20 cm. Se registró la lucha de ratones en el agua en 6 minutos, y se analizó el tiempo de inmovilidad de los ratones en los últimos 4 minutos.
1.2.3 Colección de muestras
Al final de la octava semana, los ratones se anestesiaron profundamente por la inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio (3%, 10 ml/kg). Después de la anestesia, el estado de anestesia se confirmó observando la respiración lenta, la relajación muscular y ninguna respuesta a la operación quirúrgica. Luego, la sangre de los ratones se recogió mediante la extracción de los ojos, y los ratones fueron asesinados por dislocación cervical. El corazón se perfundió con solución salina, y luego se abrió rápidamente el cerebro y se eliminó el cerebro intacto. Fue enjuagado con solución salina precoludida, y la mitad se fijó con paraformaldehído al 4% durante 72 h; El tejido del hipocampo de la otra mitad se separó en hielo y se almacenó en nitrógeno líquido para su uso posterior. Tome 10 mg de muestra de tejido del hipocampo de ratón, agregue solución salina fisiológica precoludida en una relación masa-volumen de 1: 9 y homogeneizar mecánicamente en un baño de agua helada. Después de la homogeneización, se centrifuge en 4 000 r/min durante 15 minutos (radio centrífuga 4.5 cm), recolecte el sobrenadante para la detección.
1.2.4 Determinación del índice de neurotransmisores
Tome la cantidad apropiada de suero del ratón y el sobrenadante del homogeneizado del tejido del hipocampo, y detecte el contenido de contenido 5- HT y DA de acuerdo con el método de operación del kit.
1.2.5 Determinación del índice bioquímico del tejido del hipocampo
Tome el sobrenadante del homogeneizado del tejido del hipocampo y use el kit BCA para determinar la concentración de proteínas. De acuerdo con las instrucciones del kit, la absorbancia A de mediadores inflamatorios (iNOS, Cox -2 y PGE2) y factores inflamatorios (TNF, il -1, il -18, il -6, Ifn-) en el supernatante de Hipocampal Homogenado se determina por un homogénico Hipocampal. Se calcula el marcador, y el contenido de cada sustancia, y los datos se registran y se analizan estadísticamente.
1.2.6 Tinción del tejido del hipocampo
Se tomaron muestras de tejido cerebral entero fijadas durante más de 72 h y se realizaron secciones de parafina con un grosor de 4 μm. Después de desplegar con xileno, las muestras se hidrataron con etanol gradiente (inmerso en etanol al 100% I y II durante 5 minutos, y en 95%, 90%, 80% y 70% de etanol durante 2 minutos respectivamente), y se lavaron tres veces con PBS, con eosina durante 5 minutos, enjuagados en agua cortada durante 5 minutos, con hematoxilina durante 1 minuto, se manchó con 1%, híbrido, con 1 mínimo, con 1 mínimo, con 1 minOm. Etanol ácido durante 2 s, y enjuagado en agua del grifo durante 10 min. Deshidratado con etanol gradiente (etanol al 80% durante 2 minutos, etanol al 95% durante 2 minutos, etanol I y etanol al 100% II durante 5 minutos cada uno), transparentizado con xileno, sellado con goma neutral y secado al aire. Los cambios morfológicos de las células del tejido del hipocampo en cada grupo de ratones se observaron bajo un microscopio.
1.2.7 Tinción de NISSL del tejido del hipocampo
Las secciones de parafina preparadas bajo "1.2.5" se despojaron e hidrataron, luego se tiñeron con solución de tinción NISSL durante 10 minutos, se lavaron dos veces con agua destilada durante 3 minutos cada vez, se deshidrataron con etanol gradiente (etanol al 80% durante 2 minutos, etanol 95% durante 2 minutos, etanol I y 100% etanol II para 5 minas), transparentizado con xilenal, con xileno, inyectado, con un sellado, con un sellado, y se selló. Los cambios morfológicos de las células del tejido del hipocampo en cada grupo de ratones se observaron bajo un microscopio.
1.2.8 Inmunohistoquímica del tejido del hipocampo
Las muestras de tejido del hipocampo incrustadas en parafina se procesaron mediante tinción con inmunohistoquímica (IHC) de acuerdo con las instrucciones del kit de inmunohistoquímica universal. Después del despido, la hidratación, la reparación del antígeno, el bloqueo de peroxidasa y el bloqueo, IBA -1 (1: 400), GFAP (1: 400), LRP31: 300) y CASPSAE1 (1: 400) se agregaron anticuerpos primarios e incubaron durante la noche a 4 grados. Después del desarrollo del color DAB, la tinción nuclear, la deshidratación y el sellado, se observó la expresión positiva de IBA1, GFAP, NLRP3 y CASPSAE -1 bajo un microscopio óptico y las imágenes se analizaron mediante la imagen J.
1.2.9 Detección de inmunofluorescencia del tejido del hipocampo
Las muestras de tejido del hipocampo incrustadas en parafina se procesaron mediante tinción con inmunofluorescencia de acuerdo con las instrucciones del kit de inmunofluorescencia. Las secciones de parafina preparadas bajo "1.2.5" se despojaron, hidrataron, se repararon el antígeno y se bloquearon, y luego se agregaron TLR4 (1: 400) y P-NF-κB p65 (1: 200) anticuerpos primarios a las secciones y se incubaron durante la noche a 4 grados. El anticuerpo primario se eliminó al día siguiente, se lavó tres veces con PBS, y el anticuerpo secundario (1: 500) se agregó y se incubó en la oscuridad durante 1 h. Después de lavar tres veces, las secciones se sellaron con un fijador que contiene DAPI. La señal de fluorescencia del área del tejido del hipocampo se observó mediante microscopía de fluorescencia y las imágenes se analizaron por imagen J.
1.3 Procesamiento de datos
Los datos experimentales se analizaron estadísticamente utilizando el software estadístico SPSS 26. 0 y GraphPad Prism 9. 0. Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (X ± S), y el análisis se realizó utilizando ANOVA unidireccional. La comparación entre los dos grupos se realizó utilizando la prueba de Dunnett. PAG<0.05 indicated that the difference was statistically significant.
