Aislamiento y cuantificación de ginsenósido Rh23, un nuevo compuesto antimelanogénico de las hojas de Panax Ginseng

Abstracto:

Un nuevo ginsenósido, denominado ginsenósido Rh23 (1), y 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 , 12 ,20 ,25-pentahidroxidammar-23-eno (2) se aislaron de las hojas de Panax ginseng hidropónico. Los compuestos se aislaron mediante varias cromatografías en columna y sus estructuras se determinaron en función de métodos espectroscópicos, incluida la espectrometría de masas de cuadrupolo/tiempo de vuelo de alta resolución (HR-QTOF/MS), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR) y espectroscopia infrarroja (IR). . Para determinar la actividad antimelanogénica, se analizó el cambio en el contenido de melanina en células Melan-a tratadas con compuestos identificados.

Además, investigamos los efectos inhibidores de la melanina del ginsenósido Rh23 sobre la pigmentación en un modelo in vivo de pez cebra. El compuesto 1 inhibió la melanogénesis potente en las células melan-a con un 37,0 por ciento de inhibición de la melanogénesis a 80 µM y también presentó una inhibición de la pigmentación corporal en el modelo de pez cebra. Aunque el compuesto 2 mostró una actividad inhibidora ligeramente menor que el compuesto 1, también mostró una melanogénesis significativamente menor en las células Melan-a y el modelo de pez cebra. Estos resultados indicaron que los compuestos aislados de P. ginseng hidropónico pueden usarse como nuevos compuestos para blanquear la piel a través de sistemas in vitro e in vivo. Además, este estudio demostró la utilidad del compuesto 1 basado en MS para el análisis cuantitativo. Se encontró ginsenósido Rh23 (1) a un nivel de 0,31 mg/g en hojas de P. ginseng hidropónico.

Para la melanina, descubrimos que Cistanche puede regular significativamente a la baja la actividad de la tirosinasa, que es la principal enzima limitante de la biosíntesis de la melanina de la piel y es un complejo de cobre y proteína. Puede hidroxilar la tirosina, la principal materia prima para la producción de melanina en el cuerpo, para producir L-dopa y luego oxidar la dopa a dopaquinona. La dopaquinona se somete a una serie de procesos metabólicos, se reorganiza y polimeriza, y finalmente se combina con las proteínas para producir una serie de pigmentos de melanina que provocan el oscurecimiento. La melanina es el factor más importante para determinar el color de la piel del cuerpo humano. La síntesis excesiva puede provocar la formación de enfermedades de la piel pigmentada, como pecas, cloasma, manchas de la edad y melanoma. Por lo tanto, a través de la investigación sobre la inhibición de la actividad de la tirosinasa, se pueden seleccionar los ingredientes efectivos para inhibir la pigmentación de la piel, por lo que se puede ver que los glucósidos totales de Cistanche deserticola tienen el efecto de inhibir la pigmentación de la piel y blanquear la belleza.

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Palabras clave:

ginsenósido Rh23; Panax ginseng; RMN; UPLC-QTOF/MS; pez cebra; análisis cuantitativo.

1. Introducción

Panax ginseng CA Meyer es una hierba medicinal tradicional muy famosa en los países asiáticos. Panax se origina de una "panacea", que significa una panacea para las enfermedades. P. ginseng es una planta herbácea perenne que pertenece a la familia Araliaceae [1]. Las raíces de P. ginseng de cuatro a seis años se utilizan principalmente con fines terapéuticos. Las flores florecen en junio y las hojas tienen forma de paladar. P. ginseng se ha cultivado principalmente en el este de Asia, incluidos Corea, China y Japón [2]. Hasta la fecha, se han informado muchos estudios sobre los componentes químicos de las raíces, hojas y bayas del ginseng; Se han aislado más de 100 tipos de ginsenósidos. Se informaron varias bioactividades de P. ginseng, como la mejora de la actividad inmunomoduladora, la fortificación nutricional, las mejoras de la función hepática, las actividades antidiabéticas, anticancerígenas, antiapoptóticas y antioxidantes [3–10].

Actualmente, el interés por los productos agrícolas de alta calidad relacionados con el bienestar está aumentando gradualmente, lo que lleva al cultivo hidropónico de ginseng. El cultivo hidropónico tiene las ventajas de un proceso de cultivo simple y un período de crecimiento más corto que el cultivo en suelo. El ginseng hidropónico solo necesita de 2 a 4 meses en un sistema que controle la temperatura, esté libre de pesticidas, sea húmedo, liviano, tenga ingredientes orgánicos, etc. [11]. Las hojas del ginseng cultivado en tierra no se utilizan con fines medicinales y vegetales funcionales, mientras que las hojas del ginseng hidropónico sí se pueden utilizar.

In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rb1 > Rh1 > Rf [11]. En conclusión, las condiciones hidropónicas llevaron a un alto contenido de ginsenósido, y el contenido total de ginsenósido en las hojas fue significativamente mayor que en las raíces, lo que sugiere que las hojas de ginseng podrían ser una buena fuente de vegetales funcionales y hierbas medicinales.

Varios compuestos blanqueadores conocidos, como la arbutina y el ácido kójico, han sido investigados por su eficacia para reducir la melanogénesis [13]. Desafortunadamente, es necesario encontrar agentes blanqueadores de la piel más seguros y efectivos, debido al potencial cancerígeno del ácido kójico y tanto a la seguridad como a los efectos secundarios de la arbutina [14]. Por lo tanto, se ha prestado mucha atención continuamente al desarrollo de nuevos productos naturales en la industria cosmética [15,16]. Varios estudios han informado la inhibición de la síntesis de melanina a partir de P. ginseng cultivada en el suelo [17–20].

Sin embargo, estos estudios se informaron con compuestos bien conocidos, como el ácido cinámico y los compuestos fenólicos, y no se ha informado actividad blanqueadora de las hojas de P. ginseng hidropónico (HPGL). Nuestro trabajo en curso condujo al aislamiento de ginsenósidos menores de HPGL. Por lo general, los ginsenósidos en cantidades menores o trazas no se pueden detectar con HPLC. De lo contrario, el tiempo de análisis es muy largo, lo que no es conveniente para calificar los ginsenósidos en las especias de ginseng [21,22]. Para cuantificar rápidamente los compuestos nuevos, se debe establecer un método rápido y sensible que pueda detectar minuciosamente las cantidades traza de los compuestos nuevos. En el presente estudio, se estableció un método de cromatografía líquida sensible de rendimiento ultraalto junto con espectrometría de masas de cuadrupolo/tiempo de vuelo (UPLC-QTOF-MS) para cuantificar el nuevo compuesto.

Con base en la descripción anterior, en este trabajo, el aislamiento y la identificación de un nuevo compuesto, incluidas las propiedades físicas y la cuantificación, se revelaron mediante métodos espectroscópicos, y sus actividades antimelanogénicas se investigaron mediante sistemas in vitro e in vivo.

2. Resultados y Discusión

Se extrajeron hojas de Panax ginseng hidropónico (HPGL) con MeOH acuoso y se dividieron en fracciones de acetato de etilo (EtOAc), n-butanol (n-BuOH) y H2O, respectivamente. Las cromatografías en columna de SiO2 y ODS repetidas de la fracción de n-BuOH proporcionaron un nuevo ginsenósido (1), y se aisló un ginsenósido raro (2) de la fracción de EtOAc de HPGL.

El compuesto 1, polvo blanco (metanol), mostró un color púrpura en la TLC, al rociar 10 por ciento de H2SO4 y calentar. Se determinó que la fórmula molecular era C37H64O10 a partir del pico de iones cuasimoleculares m/z 713,44723 [M más COOH]− en QTOF/MS negativo. El espectro IR sugirió la presencia de un grupo hidroxilo (3377 cm-1) y un doble enlace (1647 cm-1). El espectro de 1H-RMN (Tabla 1 y Materiales complementarios) mostró dos señales de protones de metino de olefina (δH 6.02, 5.64), tres señales de protones de metino oxigenado (δH 4.38, 4.03, 3.49), una señal de protones de metoxi (δH 3.18) y ocho señales de protones de metilo singulete (δH 1,94, 1,55, 1,43, 1,33, 1,31, 1,14, 1,04, 0,92), lo que indica que el compuesto 1 tiene un resto triterpénico tetracíclico que incluye un doble enlace con conformación trans y tres grupos hidroxilo.

Además, se confirma que el compuesto 1 es de tipo protopanaxatriol (PPT) a partir del desplazamiento químico de una señal de protón de metilo en δH 1,94 (H-28). El cambio químico de H-28 en el tipo de protopanaxadiol (PPD) generalmente se observa en ca δH 1.30 [23]. Además, se observaron una señal de protones de hemiacetal (δH 5.15) y varias metinas oxigenadas y señales de protones de metileno en δH 4.45–3.95 como señales de un resto de azúcar. A partir de la constante de acoplamiento de la señal del protón del anómero (J=7,6 Hz), tanto el protón hemiacetal como el H-2 del resto de azúcar estaban en una disposición axial. La combinación de los datos mencionados anteriormente concluyó que el compuesto 1 era un aminoglucósido de protopanaxatriol. El espectro de 13C-NMR exhibió 37 señales de carbono debido a los restos triterpeno, metoxi y hexosa. Dos carbonos de metino de olefina (δC 138,5 (C-24), 126,8 (C-23)), un carbono cuaternario oxigenado (δC 74,9 (C-25)), tres carbonos de metino oxigenado (δC 78,5 (C-3), 7{{90}},3 (C-12), 67,7 (C-6)), un carbono metoxi (δC 50,2 ( 25-OCH3)) y ocho carbonos de metilo (δC 31,9 (C-28), 26,3 (C-27), 26,1 (C-26), 23,0 (C{{ 57}}), 17,6 (C-18), 17,4 (C-19), 17,3 (C-30), 16,4 (C-29)) se observaron señales para el resto aglicón. Los datos de RMN del compuesto 1 fueron similares a los del compuesto 2, excepto por el cambio químico para un carbono cuaternario oxigenado, es decir, C-25. Además, el azúcar se identificó como una -glucopiranosa de las señales de carbono hemiacetal (δC 98,3, (C-10 )), cuatro metinos oxigenados (δC 78,9 (C-30 ), 78,2 (C{{82 }} ), 75,2 (C-20 ), 71,6 (C-40 )), y un metileno oxigenado (δC 63,0 (C-60 )). En los espectros de correlación de enlace múltiple heteronuclear de gradiente (gHMBC), se observó una correlación de largo alcance entre la señal del protón anomérico (δH 5.15 (H-10 )) y la señal del carbono cuaternario oxigenado del aglicón (δC 83.0 (C -20)), lo que indica que la -glucopiranosa estaba unida al hidroxilo de C-20 (Figura 1).

Además, la correlación entre la señal del protón metoxi (δH 3,18 (25-OCH3)) y la señal del carbono cuaternario oxigenado (δc 74,9 (C-25)) indicó que el metoxi estaba vinculado a C{{ 7}} (Figura 1). Según los datos anteriores, se determinó que la estructura química de 1 es 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 ,12 ,20 -tetrahidroxi-25- metoxidammar-23-eno, y denominado ginsenósido Rh23. Se identificó que el compuesto 2 era 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahidroxidamar-23-eno a partir de las comparaciones de NMR y Datos de MS con los informados en la literatura [23,24] (Figura 1). Los compuestos 1 y 2 se aislaron, por primera vez, de HPGL.

Se determinó que la pureza del ginsenósido Rh23 era superior al 99 por ciento mediante la normalización de las áreas de los picos detectadas por el análisis UPLC. Dado que se ha demostrado que UPLC-OTOF/MS es una herramienta adecuada para la identificación de ginsenósido Rh23, la separación de los constituyentes en el extracto de HPGL se realizó mediante UPLC-OTOF/MS en modo de iones negativos. La figura 2 muestra un cromatograma típico de iones totales (TIC) de ginsenósido Rh23 y extracto con detección de masa.

Se obtuvo una curva de calibración lineal para el ginsenósido Rh23 a diferentes niveles de concentración. Las características de las parcelas de calibración se resumen en la Tabla 2. Como se ve en la tabla, el ginsenósido Rh23 muestra excelentes coeficientes de correlación. Los recuentos del detector (área máxima relativa) dependieron linealmente de la concentración de la muestra en el rango de 0.02–0.8 µg/mL para el ginsenósido Rh23. Los LOD de ginsenósido Rh23 fueron 0.002 ppm. Los LOQ de ginsenósido Rh23 se determinaron en 0,005 ppm mediante UPLC-QTOF/MS en modo de iones negativos. La cantidad de ginsenósido Rh23 en el HPGL obtenido mediante métodos de validación (Tabla 2) fue de 0,319 mg/g.

Para determinar la actividad antimelanogénica, se estudió el cambio en el contenido de melanina en células melan-a tratadas con compuestos purificados e identificados. Las células Melan-a se trataron durante 72 h con los compuestos 1 y 2 en concentraciones que oscilaban entre 0 y 80 µM, y la viabilidad celular se evaluó mediante un kit de ensayo de viabilidad celular CCK-8. La viabilidad celular de los compuestos 1 y 2 a una concentración de 80 µM para la célula melan-a fue superior al 98,1 por ciento y al 97,8 por ciento, respectivamente (datos no mostrados). Estos resultados indicaron que los compuestos 1 y 2 tienen una naturaleza no citotóxica. El efecto de las actividades antimelanogénicas de los compuestos se muestra en la Figura 3. La inhibición de la síntesis de melanina del compuesto 1 a 20, 40 y 80 µM fue del 8,4 %, 15,6 % y 37,0 % en comparación con el control. El compuesto 2 mostró una actividad inhibidora ligeramente menor que el compuesto 1 al 7,6 por ciento, 12,8 por ciento y 17,8 por ciento a 20, 40 y 80 µM, respectivamente. Ambos compuestos inhibían la síntesis de melanina de forma dependiente de la dosis.

En particular, el compuesto 1 mostró la mayor actividad inhibidora de melanina, 37,0 por ciento a una concentración de 80 µM. Según se informa, el extracto de radix ginseng a 0-1000 µg/ml no mostró ninguna inhibición significativa de la melanina [19], y el ácido cinámico, un agente blanqueador que se encuentra principalmente en P. ginseng, mostró una inhibición del 29 % de la síntesis de melanina a 675 µM [20]. En comparación con el extracto de radix ginseng y el ácido cinámico, el compuesto 1 mostró una potente actividad inhibidora de la síntesis de melanina, e incluso mostró una actividad inhibidora de la síntesis de melanina 1.2- veces mayor a una concentración ocho veces menor en comparación con el ácido cumárico [ 17,20].

El pez cebra es un organismo modelo vertebrado muy ventajoso debido a sus sistemas de órganos y secuencias de genes similares a los de los seres humanos [25]. Además, el uso de embriones de pez cebra está recibiendo una atención cada vez mayor, ya que se consideran un método de reemplazo para los experimentos con animales [26]. El pez cebra tiene pigmentos de melanina en la superficie, lo que permite una simple observación del proceso de pigmentación sin procedimientos experimentales complicados [27].

Por lo tanto, investigamos los efectos inhibidores de la melanina del compuesto 1 en la pigmentación del pez cebra. Usamos PTU (N-feniltiourea; un inhibidor de la tirosinasa que contiene azufre) como control positivo (Figura 4B), que se usa ampliamente en la investigación del pez cebra [28,29]. Como se muestra en la Figura 4C, el tratamiento D, 40 y 80 µM con el compuesto 1 produjo una inhibición notable de la pigmentación del cuerpo del pez cebra, lo que redujo notablemente el contenido total de melanina en comparación con el vehículo de control (Figura 4A).

En este estudio, aislamos el novedoso ginsenósido Rh23 (1) de hojas hidropónicas de P. ginseng. Hasta el momento, se han informado más de 100 ginsenósidos de especies de ginseng. Sin embargo, los 25-ginsenósidos hidroxilados rara vez se encuentran en la naturaleza, incluso en las plantas de ginseng. Además, no se había informado de actividad blanqueadora. La actividad inhibidora del ginsenósido Rh23 mostró un 37 por ciento a la concentración de 80 uN sin citotoxicidad celular en células melan-a, mientras que el ginsenósido Rh23 no observó inhibición de la actividad de la tirosinasa de hongo in vitro (datos no mostrados). Recientemente, se ha demostrado que los extractos o ginsenósidos purificados de las raíces y hojas de ginseng poseen propiedades antioxidantes (30,31), mientras que el agua o el extracto orgánico de ginseng han mostrado actividades de eliminación de DPPH, anión superóxido y radical hidroxilo (32). Por lo tanto, nuestro nuevo ginsenósido Rh23 aislado de las hojas de P. ginseng hidropónico puede tener tirosinasa regulada a la baja por su propiedad antioxidante. Sin embargo, su papel en la melanogénesis aún no ha sido investigado. Por lo tanto, en estudios posteriores, es necesario determinar los mecanismos precisos de acción del ginsenósido Rh23 sobre la regulación de la síntesis de melanina.

3. experimental

3.1. General

Para la cromatografía en columna se utilizaron resinas Kieselgel 60 y LiChroprep RP-18 (Merck, Darmstadt, Alemania). Kieselgel 60 F254 (Merck) y RP-18 F254S (Merck) se usaron como fases sólidas para el experimento de TLC. La detección de manchas en la placa de TLC se realizó mediante observación bajo una lámpara UV (Spectroline, modelo ENF-240 C/F, Spectronics Corp., Nueva York, NY, EE. plato seguido de calentamiento. Las rotaciones ópticas se midieron utilizando un polarímetro digital JASCO P-1010 (Tokio, Japón). Los puntos de fusión se obtuvieron utilizando un aparato de punto de fusión Fisher-Johns (compañía científica Fisher, Pittsburgh, PA, EE. UU.) con un microscopio. Los espectros ultravioleta se midieron en un espectrofotómetro Shimadzu modelo UV-1601 (Shimadzu Corp., Kioto, Japón). Los espectros IR se obtuvieron de un espectrómetro Perkin Elmer Spectrum One FT-IR (Buckinghamshire, Reino Unido). Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Varian Inova AS 400 (400 MHz, Varian, Palo Alto, CA, EE. UU.). El análisis UPLC-QTOF/MS se realizó utilizando una serie Waters Xevo G2-S (Waters Corp., Milford, MA, EE. UU.) que funciona en el modo de iones negativos.

3.2. Materiales vegetales

El ginseng hidropónico Panax se cultivó en el invernadero del Departamento de Investigación de Cultivos de Hierbas ubicado en Eumseong, provincia de Chungbuk, de acuerdo con el protocolo de la "guía de cultivo estándar GAP de ginseng" [11,33] desarrollada por la Administración de Desarrollo Rural, República de Corea. Se compraron raíces de plántulas de ginseng de un año de edad que pesaban 0.8 a 1 g del Departamento de Investigación de Cultivos Herbales, Instituto Nacional de Ciencias Hortícolas y Herbales (NIHHS), Administración de Desarrollo Rural (RDA) y se almacenaron en un cámara a baja temperatura (1-2 ◦C) antes de su uso. Las raíces de las plántulas de ginseng se trasplantaron a baños de nutrientes y se cultivaron en el sistema hidropónico. Después de tres meses de cultivo, los ginsengs hidropónicos se sacaron para la cosecha. Las plantas de ginseng hidropónico cosechadas se lavaron para eliminar el polvo con agua y se clasificaron en hojas y raíces, que luego se secaron durante 72 h en un secador por congelación (FD8512, Ilshin Biobase Co., Yangju, Corea). Se depositó un espécimen de prueba (NIHHS14-03) en el herbario del Departamento de Investigación de Cultivos Herbales, NIHHS, RDA, Eumseong, República de Corea.

3.3. Extracción y Aislamiento

Las hojas secas y pulverizadas de P. ginseng hidropónico (HPGL, 6 kg) se extrajeron con MeOH al 80 % (30 L × 3) a temperatura ambiente durante 24 h. Los extractos se filtraron a través de papel filtro y se evaporaron a presión reducida a 45 ◦C para obtener 1,4 kg de extracto. El extracto se vertió en H2O (3 L) y se extrajo con EtOAc (3 L × 3) y n-BuOH (2,6 L × 3), sucesivamente. Cada capa se concentró a presión reducida para obtener fracciones de EtOAc (75 g), n-BuOH (470 g) y H2O (855 g).

La fracción de n-BuOH (HPGLB, 130 g) se aplicó a la columna de gel de sílice (φ 13 × 17 cm) y se eluyó con CHCl3–MeOH–H2O (8:3:1, 9{{42} } L → 6:4:1, 110 L) para producir 20 fracciones (HPGLB1 a HPGLB20). Las fracciones HPGLB3 y HPGLB4 se combinaron (18,9 g, Ve/Vt=0.05–0.12) y se fraccionaron más sobre la columna de gel de sílice (φ 8 × 15 cm, CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1, 14 L) para producir 14 fracciones (HPGLB3-1 a HPGLB3-14). Se combinaron las fracciones HPGLB3-4 y HPGLB3-5 (1,27 g, Ve/Vt {{40}},09–0,16) y se fraccionaron más en la columna ODS (φ 4 × 7 cm, MeOH–H2O=2:1, 2,6 L) para producir nueve fracciones (HPGLB3-4-1 a HPGLB3-4-9). La fracción HPGLB3-4-3 (119,4 mg, Ve/Vt=0,14–0,26) se fraccionó adicionalmente sobre la columna ODS (φ 2,5 × 7 cm, MeOH–H2O=1:1, 1 L) para producir nueve fracciones (HPGLB3-4-3-1 a HPGLB3-4-3-9) incluido el compuesto 1 (HPGLB3-4-3-7, 10,5 mg, Ve/Vt=0,42–0,55, TLC Rf=0.40 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.50 (Kieselgel 60 F254, CHCl3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)). Se combinaron las fracciones HPGLB5 a HPGLB7 (24,0 g, Ve/Vt=0,12–0,22) y se fraccionaron más sobre la columna de gel de sílice (φ 7 × 12 cm, CHCl3–MeOH–H2O=10: 3:1, 10 L → 6:4:1, 9 L) para producir 16 fracciones (HPGLB5-1 a HPGLB5-16). La fracción HPGLB5-6 (323,1 mg, Ve/Vt=0,28–0,31) se fraccionó adicionalmente sobre la columna ODS (φ 3 × 14 cm, MeOH–H2O=3:2, 1,2 L → 3:1, 1,5 L) para producir diez fracciones (HPGLB5-6-1 a HPGLB5-6-10) incluido el compuesto 2 (HPGLB5-6-5, 10,1 mg, Ve/Vt=0 .21–0.23, TLC Rf=0.50 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.45 (Kieselgel 60 F254, CHCl3– MeOH–H2O=7:3:1)).

3.4. Datos espectroscópicos

Compuesto 1. Polvo blanco, pf: 138–140 ◦C; [ ] 25 D más 17,4◦ (c=0,39, MeOH); IR (ventana de CaF2): 3377, 2932, 1382 cm−1; QTOF/MS negativo m/z 713,44723 [M más COOH]− (calculado para C37H64O10, 668,4499); Datos de 1H- y 13C-NMR, consulte la Tabla 1.

Compuesto 2. Polvo blanco, pf: 133–136 ◦C; [ ] 25 D más 20,2◦ (c=0,50, MeOH); IR (ventana de CaF2): 3359, 2929, 1384 cm−1; QTOF/MS negativo m/z 699,48311 [M más COOH]− (calculado para C36H62O10, 654,4323); datos de 1H- y 13C-NMR, consulte la Tabla 1.

3.5. Análisis cuantitativo del nuevo compuesto 1 mediante UPLC-QTOF/MS

Se preparó una solución madre estándar del compuesto 1 disolviendo 1,00 mg cada uno en 1 ml de metanol para obtener una concentración de 1,00 mg/ml y se mantuvo a 4 ◦C. La solución madre estándar (1) se diluyó con metanol para obtener soluciones de calibración con rangos de 0.{{10}}2–0.8 µg/mL, respectivamente. Se pesó con precisión un gramo de extracto de HPGL y se disolvió en volúmenes fijos (10 mL) de metanol, se filtró a través de un papel de filtro de 0,20 mm y se refrigeró a 4 ◦C. . La UPLC se realizó con una UPLC ACQUITY H-Class de Waters (Waters Corp., Milford, MA, EE. UU.) con una columna ACQUITY BEH C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 µm). Las fases móviles consistieron en agua (A) con 0,1 por ciento de ácido fórmico (v/v) y acetonitrilo (B) con 0,1 por ciento de ácido fórmico (v/v). El gradiente de elución fue el siguiente: 0–4 min, B 10–30 por ciento; 4–15 min, B 30–60 por ciento; 15–16 min, B 60–100 por ciento; 16–19 min, B 100–10 por ciento. La velocidad de flujo fue de 0,45 ml/min y el volumen de inyección fue de 2 µl para cada ejecución.

A continuación, se realizó el análisis HR-MS usando un Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp., Milford, MA, EE. UU.) que funciona en modo de iones negativos. Los espectrómetros de masas realizaron exploraciones alternas de alta y baja energía conocidas como modo de adquisición MSE. Se obtuvieron mediciones de masa precisas utilizando un sistema de suministro de calibración automatizado que contenía leucina encefalina, m/z 554,262 (modo negativo ESI) como referencia interna. Los parámetros operativos óptimos se establecieron como se muestra en la Tabla 3.

3.6. Cultivo de células

Los melanocitos Melan-a son una línea celular de melanocitos murinos normales altamente pigmentados e inmortalizados derivados de ratones C57BL/6. Las células de melan-a utilizadas en este estudio se obtuvieron de la Dra. Dorothy Bennett (Hospital St. George, Londres, Reino Unido). Las células se cultivaron a 37 ◦C en una atmósfera de 95 % de aire, 10 % de CO2 en medio RPMI 1640 complementado hasta una concentración final con 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor, 1 % de penicilina/estreptomicina y 200 nM de PMA. La viabilidad celular se determinó mediante el kit de recuento de células CCK-8-8 (Dojindo Lab., Kumamoto, Japón).

3.7. Ensayo de melanina

Las células Melan-a se trataron con compuestos durante 72 horas y luego se disolvieron en NaOH 1 N a 60 ◦C durante 30 minutos. Luego, los lisados ​​se midieron a 450 nm usando un espectrofotómetro. Los datos se normalizaron al contenido de proteína de los lisados ​​celulares. Los lisados ​​​​celulares se procesaron posteriormente para la determinación de la concentración de proteínas utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, EE. UU.).

3.8. Origen y Mantenimiento de los Peces Parentales

Se obtuvieron peces cebra adultos de un distribuidor comercial y se mantuvieron de 10 a 15 peces en un tanque acrílico de 5 L con las siguientes condiciones: 28,5 ◦C, con un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 h. Los peces cebra fueron alimentados tres veces al día, seis días a la semana, con alimento en escamas TetraMin complementado con camarones de salmuera vivos (Artemia salina). Los embriones se obtuvieron del desove natural que se indujo por la mañana al encender la luz. La recolección de embriones se completó en 30 min. Todos los protocolos y procedimientos experimentales fueron aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones aprobadas del Comité de Ética Animal de la Universidad Nacional de Chungnam (CNU-00866).

3.9. Tratamiento de compuestos y evaluación basada en fenotipos

Los embriones sincronizados se recogieron y dispusieron con una pipeta (7–9 embriones por pocillo en 24-placas de pocillos que contenían 1 ml de medio embrionario). Los compuestos de prueba se disolvieron en 0, 1 por ciento de DMSO y luego se agregaron al medio del embrión de nueve a 72 h después de la fertilización (hpf) (63 h de exposición). Los efectos sobre la pigmentación del pez cebra se observaron bajo el microscopio estereoscópico. La agitación ocasional, así como la sustitución del medio, se realizó diariamente para asegurar la distribución uniforme de los compuestos. En todos los experimentos, se utilizó 0.2 mM 1-fenil-2-tiourea (PTU) para generar pez cebra transparente sin interferir en el proceso de desarrollo [33] y se consideró un control positivo estándar. Las evaluaciones basadas en el fenotipo de la pigmentación corporal se decorionaron con fórceps, se anestesiaron en solución de metanosulfonato de tricaína (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), se montaron en metilcelulosa al 3 por ciento en un plato de 35 mm (SPL Lifesciences, Pocheon, Corea), y fotografiado bajo el microscopio estereoscópico MZ16 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania).

4. Conclusiones

En este estudio, se aisló el ginsenósido Rh23 (1) de hojas hidrofónicas de Panax ginseng junto con 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahidroxidammar-23-eno (2). En general, hemos tenido éxito en nuestro intento de obtener el efecto hipopigmentario de los compuestos de P. ginseng hidropónico. El ginsenósido Rh23 y el 20-O- -D-glucopiranosil-3 ,6 ,12 ,20 ,25-pentahidroxidammar23-eno tienen actividades inhibidoras de la biosíntesis de melanina sin efectos citotóxicos en melan-una celda. Además, el ginsenósido Rh23 mejoró la despigmentación del pez cebra como modelo animal alternativo. La disminución del contenido de melanina y la pigmentación en el cuerpo pueden tener potencial para la actividad blanqueadora y el efecto no citotóxico es el punto más favorable porque la seguridad es una consideración principal para los agentes blanqueadores en los productos cosméticos.

Por lo tanto, sobre la base de nuestros resultados actuales, es importante que los nuevos compuestos hidrofónicos de P. ginseng se puedan utilizar como un potencial agente eficaz para aclarar la piel. Estudios posteriores dilucidarán los mecanismos precisos de la acción del ginsenósido Rh23 en la regulación de la síntesis de melanina y la relación entre las características estructurales del ginsenósido Rh23 y la melanogénesis, para determinar si es un agente blanqueador potencial para la industria cosmética. Las ventajas de la espectrometría de masas híbrida Q-TOF incluyen no solo la calidad de la capacidad de detección y la sensibilidad, sino también una medición precisa, lo que facilita las elucidaciones estructurales. Se puede utilizar para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos menores o novedosos, lo que ayuda a mejorar el control de calidad de las especias de ginseng.

Materiales complementarios:

Los espectros 1H-NMR y 13C-NMR de 1 están disponibles en los Materiales complementarios.

Expresiones de gratitud:

Este trabajo se realizó con el apoyo del "Programa de Investigación Cooperativa para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología Agrícolas" (PJ01136203), Administración de Desarrollo Rural, República de Corea. Agradecemos a Cheol-Hee Kim (Universidad Nacional de Chungnam) por compartir las instalaciones del pez cebra.

Contribuciones de autor:

DYL y N.-IB concibieron y diseñaron los experimentos; H.-GK e Y.-GL aislaron los compuestos; DYL elucidó las estructuras; I.-BJ contribuyó a la preparación de materiales vegetales; JHK llevó a cabo el ensayo biológico y ayudó con la preparación del manuscrito; JWL y B.-RC realizaron las RMN y UPLC-QTOF/MS de las muestras; G.-SK colaboró ​​en la revisión del manuscrito; y DYL escribieron el artículo y administraron el proyecto de investigación. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Conflictos de interés:

Los autores declaran no tener conflictos de intereses. Los patrocinadores fundadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio; recopilación, análisis o interpretación de los datos; redacción del manuscrito; o la decisión de publicar los resultados.

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Disponibilidad de muestras:

Las muestras de los compuestos 1 y 2 están disponibles de los autores.

Dae Young Lee 1 identificación, Hyoung-Geun Kim 2, Yeong-Geun Lee 2, Jin Hee Kim 3, Jae Won Lee 1 identificación, Bo-Ram Choi 1, In-Bae Jang 1, Geum-Soog Kim 1 y Nam-In Baek 2,*

1 Departamento de Investigación de Cultivos de Hierbas, Instituto Nacional de Ciencias de la Horticultura y las Hierbas, RDA, Eumseong 27709, Corea; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)

2 Departamento de Biotecnología de Medicina Oriental, Universidad Kyung Hee, Yongin 17104, Corea; zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)

3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com

Recibido: 28 de noviembre de 2017; Aceptado: 26 de enero de 2018; Publicado: 29 enero 2018

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