Eficacia blanqueadora del ginsenósido F1 a través de la inhibición de la transferencia de melanina en melanocitos y queratinocitos humanos cocultivados y equivalente tridimensional de piel humana

Los ginsenósidos son los principales ingredientes activos del ginseng. En la fisiología de la piel, los ginsenósidos afectan la regulación de los pigmentos y exhiben actividad antienvejecimiento. Según informes recientes, el ginsenósido Rg1 aumenta la melanogénesis y la actividad de la tirosinasa en los melanocitos humanos [1]. Por el contrario, se informa que el ginsenósido F1 (GF1) (sFig. 1), un metabolito producido por la hidrólisis de Rg1, inhibe la pigmentación visible. Un estudio clínico realizado por Han et al demostró un efecto blanqueador de la piel de GF1 en piel humana bronceada artificialmente causado por la producción de interleucina 13 a partir de células T gd epidérmicas humanas [2]. Kim et al demostraron que GF1 reduce la secreción de melanina a través de la retracción de las dendritas sin efectos sobre el contenido de melanina intracelular y la expresión de tirosinasa en células de melanoma murino B16F10 estimuladas con hormona estimulante de melanocitos (MSH) [3]. Sin embargo, hasta la fecha, no se han obtenido hallazgos directos sobre los efectos blanqueadores de GF1 en el entorno epidérmico humano que consta de melanocitos y queratinocitos en un sistema experimental in vitro.

Por interpolación, al mismo tiempo encontramos que también hay tirosinasa en Cistanche deserticola, y el método de oxidación de tasa de tirosinasa-dopa ha llevado a cabo la investigación de regulación de la actividad de tirosinasa en el extracto de glucósido feniletanoide en Cistanche deserticola, los resultados muestran que: feniletanoide total glucósidos de Cistanche deserticola El extracto puede regular significativamente a la baja la actividad de la tirosinasa. El glucósido feniletanoide en Cistanche deserticola también puede absorber eficazmente la radiación ultravioleta de la luz solar. La estructura molecular del glucósido feniletanoide tiene múltiples sistemas conjugados. Después del escaneo ultravioleta, se encuentra que tiene una fuerte absorción entre 280nm y 380nm, y la longitud de onda de absorción máxima es de 281nm y 333nm. , lo que indica que el glucósido feniletanoide de Cistanche deserticola tiene un buen efecto de absorción de los rayos ultravioleta y puede prevenir y aliviar mejor el daño de la radiación ultravioleta en la piel.

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Fig. 1. El efecto de GF1 sobre el contenido de melanina y la expresión de tirosinasa en melanocitos humanos. GF1 (10 mM, 50 mM, 100 mM) se trató con células MNT-1 durante 24 h, 48 h y 72 h. (A) Luego se analizaron los contenidos de melanina. (B) Se analizó el nivel de expresión de tirosinasa. Además, GF1 (10, 50, 100 uM) se trató con células MNT-1 estimuladas con a-MSH (500 nM) durante 48 h y 72 h. (C) Luego se analizaron los contenidos de melanina. (D) Se analizó el nivel de expresión de tirosinasa. Tratamos melanocitos epidérmicos humanos normales primarios (NHEM) con GF1 (50 mM y 100 mM) en presencia o ausencia de estimulación de a-MSH durante 48 h. (E) Luego se analizaron los contenidos de melanina. (F) Se analizó el nivel de expresión de tirosinasa. Las células MNT-1 se trataron con GF1 (50 mM y 100 mM) durante 48 h en un medio de cultivo que contenía L-tirosina 100 mM o 500 mM. (G) Luego, se analizaron los contenidos de melanina. GADPH, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa; GF1, ginsenósido F1.

Aquí, investigamos los efectos antimelanogénicos de GF1 en células de cocultivos MNT-1/HaCaT y equivalentes tridimensionales (3-D) de piel humana. Además, nos centramos en la formación de dendritas en los melanocitos y la transferencia de melanosomas a los queratinocitos después del tratamiento con GF1. Colectivamente, nuestros hallazgos demuestran por primera vez que GF1 mostró efectos blanqueadores en la epidermis humana coexistiendo con melanocitos y queratinocitos.

Para este estudio, se cultivaron células MNT-1 en medios mínimos esenciales (MEM) que contenían un 20 % de suero fetal bovino (FBS), un 1 % de gentamicina y ácido hidroxietil piperazinaetanosulfónico (HEPES) 20 mM. Las células HaCaT se cultivaron en medio de águila modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía FBS al 10 por ciento, gentamicina al 1 por ciento y HEPES 20 mM. Se adquirieron melanocitos epidérmicos humanos normales (NHEM) de (Lonza, Basilea, Suiza) y se cultivaron en medio de crecimiento de melanocitos-4 (MGM-4). Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 por ciento.

Para medir el contenido de melanina, las células (2 105) se cultivaron en una placa de 6-pocillos durante 24 h. Las células se trataron con las concentraciones indicadas de GF1. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se separaron con tripsina/EDTA. Las células se lisaron incubando en 200 ml de NaOH 1 N a 80 °C durante 2 h. Los lisados ​​celulares se transfirieron a una placa de pocillos 96- y se midió la absorbancia a 405 nm.

Para realizar la transferencia Western, las células se lavaron dos veces con PBS frío y luego se lisaron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación modificado (RIPA) enfriado con hielo (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 por ciento de Nonidet P-40 , 0.5 por ciento de desoxicolato de sodio, NaCl 150 mM) que contiene inhibidores de proteasa y conjunto combinado de inhibidores de fosfatasa (Calbiochem, San Diego, CA, EE. UU.). Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante 24 h, luego se lavaron con solución salina tamponada con tris que incluía Tween al 0,1 %-20, se expusieron a anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron y luego se visualizaron. utilizando un sistema de imágenes Odyssey.

Para analizar la transferencia de melanosomas, se cultivaron células MNT{{0}}/HaCaT en una 12-placa de pocillos en una proporción de 1 a 10 durante 24 h, y luego, GF1 fue tratado con la concentración indicada. Las células se lavaron dos veces con PBS frío y se fijaron con paraformaldehído al 3,5 por ciento durante 10 min. Las células se lavaron y trataron con Triton X-100 al 0,1 por ciento durante 10 min y luego con albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5 por ciento durante 1 h. Se usaron anticuerpos contra la proteína 1 relacionada con tirosinasa (1:200, rojo) y citoqueratina-18 (1:200, verde) para la detección de melanocitos y queratinocitos.

MelanoDerm Skin Tissue Model (TM) es un equivalente de piel humana {{0}}D reconstituido viable que contiene melanocitos y queratinocitos normales (MatTek Corp., Ashland, MA). Usamos MelanoDerm TM (MEL-300-A) que se deriva de donantes asiáticos. Se mantuvieron en el nuevo medio de mantenimiento-113 según lo recomendado por el fabricante. Se aplicó GF1 a MelanoDerm TM los días 0, 4, 6, 8, 11, 13 y 15. Antes del tratamiento con GF1, los tejidos se lavaron con 1 ml de PBS para eliminar cualquier compuesto residual. Los tejidos se fijaron el día 18 para el análisis histológico. La evaluación histológica se realizó con un microscopio óptico (Bx-41; Olympus, Tokio, Japón) y se tomaron microfotografías con una cámara digital (DP72; Olympus). Melanoderm se fijó en una solución de formaldehído tamponado al 4 por ciento para la tinción. Las muestras se incluyeron en parafina, se cortaron a un espesor de 3 mm y se tiñeron con Hematoxilina y Eosina y solución de tinción de Fontana y Mason. Todos los datos se expresan como valores medios SD (desviación estándar), y se usó la prueba t de Student para las comparaciones estadísticas. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo (los valores de p individuales se proporcionan en las leyendas de las figuras).

Para establecer el efecto de GF1 en los melanocitos humanos, tratamos células de melanoma humano altamente pigmentadas (MNT-1) con GF1 durante 24, 48 y 72 h, seguido de un análisis del contenido de melanina intracelular y la expresión de la proteína tirosinasa. . Como se muestra en la Fig. 1A, GF1 no tuvo ningún efecto inhibidor sobre el contenido de melanina dentro de un rango de concentración de 10-100 mM. Además, la expresión de tirosinasa no disminuyó por GF1 en células MNT-1 (Fig. 1B, sFig. 2A). El tratamiento de células MNT-1 estimuladas con a-MSH con GF1 durante 48 h y 72 h no dio como resultado la supresión del contenido de melanina (Fig. 1C) o la expresión de tirosinasa (Fig. 1D, sFig. 2B). Para confirmar aún más el efecto de GF1 en los melanocitos humanos, tratamos NHEM primario con GF1 en presencia o ausencia de estimulación de a-MSH durante 48 h. Similar a los datos obtenidos con las células MNT-1, GF1 no afectó el contenido de melanina (Fig. 1E) o la expresión de tirosinasa (Fig. 1F, sFig. 2C) en NHEM. Finalmente, evaluamos si el nivel de L-tirosina en el medio de cultivo afecta la actividad de GF1 porque la L-tirosina es el sustrato de la tirosinasa para la síntesis de melanina. En consecuencia, las células MNT-1 se trataron con GF1 durante 48 h en el medio de cultivo que contenía L-tirosina 100 mM o 500 mM. Como se muestra en la Fig. 1G, GF1 no inhibió el contenido de melanina en las células MNT-1, independientemente de la concentración de L-tirosina.

Fig. 2. El efecto de GF1 sobre la formación de dendritas y la transferencia de melanosomas en células cultivadas con MNT-1/HaCaT y un equivalente de piel humana 3-D. Las células MNT-1/HaCaT cocultivadas se trataron con GF1 100 mM en presencia o ausencia de estimulación a-MSH (500 nM) durante 48 h. (A) Después de la fijación, observamos la formación de dendritas en los melanocitos mediante microscopía óptica (barra de escala; 50 mm). (B) Para la inmunotinción, teñimos los melanosomas con el anticuerpo TRP-1 (color rojo) y los queratinocitos con citoqueratina-18 (color verde). Las flechas blancas indican melanosoma transferido a HaCaT desde células MNT-1 (barra de escala; 20 mm). El equivalente de piel humana (MelanoDerm; n=3) se trató con ácido kójico al 1 por ciento como compuesto blanqueador de referencia y GF1 (10 y 50 ug/ml) durante 18 días. (C) Después del tratamiento, se fotografiaron los equivalentes de piel. (D) Se calculó el valor de 6 L (grado de luminosidad en comparación con el control tratado con vehículo) para cada muestra de ensayo. (E) La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de secciones de tejido. (F) Tinción de Fontana-Mason (F&M) de secciones de tejido. Los portaobjetos se fijaron en una solución de formaldehído y se incluyeron en cera de parafina para la tinción (barra de escala; 50 mm). Las flechas negras indican el melanosoma transferido de los melanocitos en la capa basal a los queratinocitos en la capa superior. Las flechas azules indican los melanocitos que forman las dendritas extendidas. (*p < 0,05, **p < 0,01, *p < 0,001). CON, control; GF1, ginsenósido F1; KA, ácido kójico.

Tras el hallazgo de que GF1 no ejerce un efecto antimelanogénico en melanocitos humanos monocultivados, analizamos más a fondo si GF1 afecta la síntesis de melanina en los melanocitos en un sistema experimental que contiene tanto queratinocitos como melanocitos con la posibilidad de comunicación célula-célula. Se cocultivaron células MNT-1 y HaCaT (una línea celular de queratinocitos normales humanos inmortalizados) con GF1 100 mM en presencia o ausencia de radiación UV-B. Después de 48 h (sFig. 3A) o 72 h (sFig. 3B), evaluamos el contenido de melanina de MNT-1 aislado y células cocultivadas. Nuestros datos mostraron que GF1 no inhibe la síntesis de melanina tanto en MNT-1 aislados como en grupos de células cocultivadas.

Además de la síntesis de melanina, nos enfocamos en la eficacia inhibidora de GF1 en la transferencia de melanosomas de melanocitos a queratinocitos. Específicamente, las células MNT-1/HaCaT cocultivadas se trataron con GF1 100 mM en presencia o ausencia de estimulación de a-MSH (Fig. 2A), seguido de un examen de la formación de dendritas en los melanocitos, que se requiere para la transferencia de melanosomas. . Curiosamente, las dendritas estiradas inducidas por aMSH se retrajeron tras el tratamiento con GF1. Luego, teñimos melanosomas positivos para TRP-1-(rojo) para células MNT1 y citoqueratina-18 (verde) para células HaCaT en cocultivos. Como se muestra en la Fig. 2B, los melanosomas positivos para TRP-1- en células MNT-1 se transfirieron a células HaCaT después de la estimulación con a-MSH, que fue inhibida significativamente por GF1. Estos resultados indican que GF1 suprime la transferencia de melanosomas, lo que provoca la retracción de las dendritas de los melanocitos.

Para extender esta investigación a un sistema más fisiológico, examinamos la capacidad de blanqueamiento de GF1 en un equivalente de piel humana 3-D, que es una capa epidérmica que consta de melanocitos y queratinocitos. En la Fig. 2C, el tejido tratado con GF1-parecía más claro que el tejido de control, y el valor L (índice de claridad/oscuridad) se alteró con el tratamiento con GF1 (Fig. 2D). Además, la tinción con hematoxilina y eosina de las secciones de tejido no reveló colapso ni toxicidad del tejido (Fig. 2E). Los experimentos de tinción de Fontana y Mason mostraron que GF1 inhibe la formación de dendritas de los melanocitos en la capa basal y simultáneamente suprime la transferencia de melanosomas de los melanocitos de la capa basal a los queratinocitos de la capa superior diferenciada (Fig. 2F). Estos hallazgos respaldan colectivamente la eficacia inhibidora de GF1 en la transferencia de melanosomas, lo que conduce a la promoción del blanqueamiento en el modelo de tejido de piel humana.

En el presente estudio, GF1 no inhibió la síntesis de melanina ni la expresión de tirosinasa; más bien, GF1 aumentó ligeramente el contenido de melanina intracelular y la expresión de tirosinasa en células MNT-1 y células cocultivadas (Fig. 1A y 1B y sFig. 3A). Sin embargo, simultáneamente, encontramos que GF1 inhibía la transferencia de melanosomas a través de la disminución de la formación de dendritas de melanocitos. Sospechamos que el aumento del contenido de melanina intracelular por GF1 podría ser causado por la acumulación de melanosoma debido al bloqueo de la transferencia de melanosoma y la inducción de la expresión de tirosinasa. La pigmentación visible de la piel está determinada por la cantidad de dispersión de los melanosomas desde las diversas áreas de las dendritas extendidas de los melanocitos hasta los queratinocitos circundantes [4]. Varios compuestos, como la centaureidina y la metilofiopogonanona B, mostraron eficacia blanqueadora, lo que provocó la retracción de las dendritas de los melanocitos sin influir en la expresión de enzimas melanogénicas o la síntesis de melanina [5]. Por lo tanto, el bloqueo de la transferencia de melanosomas a los queratinocitos desde los melanocitos se considera un enfoque eficaz para inducir un efecto blanqueador, aunque no se inhibe la biosíntesis de melanina. Por lo tanto, consideramos que el aumento del contenido de melanina por GF1 tiene poco impacto en la eficacia blanqueadora de GF1. Además, los melanosomas acumulados serían degradados por autofagia para la homeostasis de la piel, aunque el destino de los melanosomas no está claro [6].

Demostramos por primera vez que GF1 suprime la formación de dendritas inducida por a-MSH, lo que da como resultado la inhibición de la transferencia de melanosomas a los queratinocitos en cocultivos de células humanas. Además, GF1 interrumpió la transferencia de melanina de los melanocitos en la capa basal a los queratinocitos en la capa superior, ejerciendo un efecto blanqueador en el equivalente de la piel humana. Recientes experimentos de cocultivo indican que los melanocitos entregan pigmento a los queratinocitos a través de cambios en la morfología dendrítica, como la desorganización de los microfilamentos de b-tubulina en el citoesqueleto intracelular [7,8]. El monofosfato de adenosina cíclico, un inductor de melanogénesis, media la formación de dendritas a través de la regulación al alza de Rac y la regulación a la baja de la actividad de Rho [9,10]. Por lo tanto, los estudios futuros de nuestro grupo se centrarán en una evaluación exhaustiva de las proteínas diana de GF1, como las moléculas involucradas en la vía de señalización del monofosfato de adenosina cíclica.

En conjunto, nuestros resultados proporcionan evidencia preliminar de que GF1 tiene el potencial de desarrollo como un reactivo blanqueador efectivo para el tratamiento de trastornos pigmentarios y para aclarar el color de la piel oscurecida como ingrediente cosmético.

Conflictos de interés

Todos los autores contribuyentes declaran no tener conflictos de interés.

Expresiones de gratitud

Esta investigación fue apoyada y financiada por el Centro de Investigación y Desarrollo Amorepacific.

Referencias

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[2] Han J, Lee E, Kim E, Yeom MH, Kwon O, Yoon TH, Lee TR, Kim K. Papel de la interleucina 13 derivada de células T gd epidérmicas en el efecto blanqueador de la piel del ginsenósido F1. Exp Dermatol 2014;23:860e2.

[3] Kim JH, Baek EJ, Lee EJ, Yeom MH, Park JS, Lee KW, Kang NJ. El ginsenósido F1 atenúa la hiperpigmentación en las células de melanoma B16F10 al inducir la retracción de las dendritas y activar la señalización de Rho. Exp Dermatol 2015;24:150e2.

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[6] Katsuyama Y, Taira N, Yoshioka M, Okano Y, Masaki H. La interrupción del transporte de melanosomas en melanocitos tratados con teofilina provoca su degradación por autofagia. Biochem Biophys Res Commun 2017;485: 126e30.

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Chang-Seok Lee 1,3 , Gibaeg Nam 1 , Il-Hong Bae 1 , Parque Junseong 1,2,*

1 Centro de I+D de Amorepacific CO, Yongin-si, República de Corea

2Departamento de Ingeniería Química, Universidad Nacional de Chungbuk, Cheongju-si, Chungbuk, República de Corea

3Departamento de Belleza y Ciencias Cosméticas, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Eulji, Seongnam-si, República de Corea

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