Los polisacáridos de azufaifa mitigaron la anemia en ratas con enfermedad renal crónica

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Shiying Huang, et al.

Resumen

Los polisacáridos de azufaifo (JP) son uno de los glicanos activos de origen alimentario en la fruta dietética de Ziziphus jujuba, que se ha considerado para el tratamiento de la deficiencia de sangre. En este estudio, uncrónicoriñónenfermedad(CKD) se utilizó un modelo de rata para evaluar el efecto de JP y su mecanismo sobre la anemia asociada a la CKD. En ratas con ERC, el tratamiento con JP mejoró significativamenteriñónfunción, riñónpatológicolesióny parámetros hematológicos, incluido el aumento de glóbulos rojos, hemoglobina, hematocrito y recuento de plaquetas. Además, los resultados de metabolómica específica de LC-MS/MS mostraron que JP promovía la liberación de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) en ratas con ERC. Además, JP alternó el nivel de eritropoyetina sérica (EPO), el ARNm de EPO renal yriñónProteína EPO vía señalización HIF. En conjunto, estos resultados brindan evidencia de que el efecto de JP sobre la anemia asociada a la ERC puede estar involucrado en la regulación de la liberación de SCFA y la producción de eritropoyetina, lo que respalda un mayor desarrollo de los JP como complementos alimenticios en el tratamiento de la anemia asociada a la ERC.

Palabras clave: polisacáridos de azufaifaCrónicoriñón enfermedadAnemia Eritropoyetina Factor inducible por hipoxia- Ácidos grasos de cadena corta

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1. Introducción

Crónicoriñón enfermedad(ERC) se define como un síndrome clínico de anomalías estructurales renales o deficiencias funcionales y se está convirtiendo cada vez más en una carga para la salud pública en todo el mundo (Webster, Nagler, Morton y Masson, 2017). La anemia renal se encuentra entre las complicaciones más comunes de la ERC que contribuyen al aumento del riesgo de muerte (Locatelli et al., 2019). La insuficiencia en la producción de eritropoyetina (EPO) es uno de los principales factores impulsores reconocidos de la anemia en la ERC (Pappa, Dounousi, Duni y Katopodis, 2015). La EPO se produce en el hígado yriñón, que es esencial para la producción de eritrocitos (Lappin & Lee, 2019). En condiciones de hipoxia, el factor inducible por hipoxia (HIF) puede activar la expresión de EPO (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Dirigirse a HIF para inducir la producción de EPO, por lo tanto, se ha considerado una nueva estrategia terapéutica para tratar la anemia asociada a la ERC.

Jujube es el fruto de Ziziphus jujuba Mill. (Rhamnaceae), también conocido como dátil chino. La azufaifa tiene un largo uso tradicional que abarca miles de años como hierba medicinal y complemento alimenticio. La azufaifa se utiliza como suplemento para la salud de las personas que padecen desnutrición hematógena o crónica. Los polisacáridos de jujube (JP), un componente soluble en agua compuesto con diferentes proporciones de monosacárido y ácido urónico (Ji, Hou, Yan, Shi y Liu, 2020), es uno de los ingredientes activos dentro de jujube (Ji et al., 2017). ), que ha sido bien aceptado por exhibir efecto hepatoprotector y actividad inmunomoduladora y mejorar la función de barrera intestinal (Liu et al., 2015, Yue et al., 2015). De hecho, también se considera comúnmente que JP tiene efectos potenciales sobre la anemia. Sin embargo, el mecanismo molecular de JP en el tratamiento de la anemia es aún menos conocido.

En los últimos años, la metabolómica se ha utilizado ampliamente para comprender los factores potenciales que contribuyen a la progresión de la enfermedad. La metabolómica dirigida se ha utilizado ampliamente para identificar marcadores moleculares de enfermedades humanas complejas como la ERC. Se verificó que el sulfato de indoxil (IS) y el sulfato de p-cresilo (PCS) son los biomarcadores de la progresión de la ERC (Meijers & Evenepoel, 2011), y el aumento del grado de N-óxido de trimetilamina (TMAO) podría conducir directamente a la fibrosis y disfunción tubulointersticial renal. (Tang et al., 2015). Los ácidos grasos de cadena corta (SCFA), los metabolitos dependientes de microbios intestinales, son los sustratos energéticos con la capacidad de afectar varios procesos fisiológicos (LeBlanc et al., 2017), y se ha informado que la reducción de SCFA contribuye a la progresión de la ERC (Koh, De Vader, Kovatcheva-Datchary y B¨ akhed, 2016, Wang et al., 2019). Además, los SCFA pudieron proteger la estructura renal del daño mediante la inhibición del estrés oxidativo (Li, Ma y Fu, 2017). Al mismo tiempo, se ha descubierto que los SCFA muestran un efecto beneficioso sobre la absorción de hierro y aumentan la expresión del gen de la globina embrionaria/fetal, lo que induce la eritropoyesis y corrige la anemia (Tako, Glahn, Knez y Stangoulis, 2014). Sin embargo, el mecanismo de los AGCC en la anemia renal aún debe dilucidarse.

En este estudio, planteamos la hipótesis de que JP podría regular la liberación de SCFA y estimular la producción de EPO mediada por HIF, cuyo resultado es corregir la anemia renal. Aquí, investigaremos el efecto de JP en la mejora de la anemia renal en 5/6 ratas con ERC inducida por nefrectomía, incluidas las funciones renales y los parámetros hematológicos. Se desarrolla un enfoque de metabolómica específica utilizando LC-MS/MS para determinar ocho SCFA, incluidos ácido acético, ácido propanoico, ácido isobutírico, ácido butírico, ácido 2-metilbutírico, ácido isovalérico, ácido valérico y ácido hexanoico en heces y muestras de riñón y los niveles de SCFA específicos se evalúan en ratas sanas y con ERC. Además, también se revela la participación de la señalización de HIF en ratas tratadas con JP.

Fig. 1. Cromatografía GC-MS típica de JP. (A) Fórmulas estructurales de monosacáridos después de la derivatización con acetato de aldononitrilo; (B) Los perfiles representativos de cromatografía iónica mixta (MIC) de GC-MS de la mezcla de monosacáridos estándar y monosacáridos hidrolizados JP. Los picos en los perfiles cromatográficos se correspondieron con el marcador químico mostrado en (A): 1. ramnosa, 2. arabinosa, 3. fucosa, 4. xilosa, 5. manosa, 6. glucosa, 7. galactosa, 8. inositol (ISTD ).

2. Materiales y métodos

2.1. Preparación de polisacárido de jujube

Los frutos de Z. jujuba se compraron a Shenzhen Huahui Pharmaceutical Co., Ltd. Los materiales fueron autenticados por el Dr. Jianping Chen de acuerdo con la Farmacopea de la República Popular China, edición 2015. Los especímenes del comprobante se guardaron en el Hospital de Medicina Tradicional China de Shenzhen con el número 18100601.

El JP crudo se extrajo del azufaifo como se describió anteriormente, con modificaciones menores (Ji et al., 2020). Brevemente, las azufaifas se incubaron con 10 vol de agua (v/p) en un baño de agua a 80 ◦C durante 3 h y se extrajeron 3 veces. Después de la filtración, combinar los filtrados y condensar esta combinación en un evaporador rotatorio bajo vacío controlado. La solución concentrada se precipitó aún más mediante la adición de cuatro veces de etanol (v/v) a 4 ◦C durante 12 h. El precipitado se recogió por centrifugación y se secó a presión reducida hasta sequedad para obtener el JP crudo. Se determinó que la pureza de JP era del 80 por ciento usando calorimetría.

2.2. Caracterización de la composición de monosacáridos del polisacárido de jujube

Un sistema Shimadzu GC–MS (Shimadzu GC–MS TQ8040 interconectado con Shimadzu GC 2010 plus) equipado con fuente EI, columna capilar SH-Rxi-5Sil MS (30 m × 0,25 mm ID, 0,25 µm de espesor de película, Shimadzu) para determinar los monosacáridos hidrolizados por derivatización con una proporción de división de 10:1. La temperatura de inyección, la fuente de iones y la interfaz fueron 250 ◦C, 200 ◦C y 250 ◦C. La temperatura inicial de la columna se mantuvo a 120 ◦C durante 1 min, luego aumentó a 15 ◦C/min a 160 ◦C y se mantuvo durante 4 min, 2 ◦C/min a 165 ◦C y se mantuvo durante 2 min, 20 ◦C /

min a 195 ◦C, 5 ◦C/min a 250 ◦C, y se mantuvo durante 3 min. El caudal de gas portador de helio se mantuvo a 46 cm/s y se inyectaron 2 μL de cada muestra en el instrumento. Los analitos se cuantificaron en el modo de monitoreo de iones seleccionados (SIM), el ion objetivo: ramnosa (m/z 129.00), arabinosa (m/z 115.00), fucosa (m/ z 103.00), xilosa (m/z 115.00), manosa (m/z 115.00), glucosa (m/z 115.00 ), galactosa (m/z 115.00), inositol (m/z 126.00). Los estándares de monosacáridos se enumeraron de la siguiente manera: L ( plus )-arabinosa (1506–200202), fucosa (112014–201902), D-xilosa (111508–201605), D-glucosa (110833–201908), ramnosa (111683–201502 ), galactosa (100226–201807), D-manosa (140651–201805) se compraron de los Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Medicamentos. El inositol se obtuvo de Sigma (I7508-50 g).

El JP extraído (10 mg) se hidrolizó en monosacáridos con 10 mL de ácido trifluoroacético (TFA) 2 mol/L a 105 ◦C durante 3 h, y los monosacáridos hidrolizados de JP se concentraron y lavaron a presión reducida a 60 ◦C para se eliminó el TFA y los residuos se reconstituyeron con 2 ml de agua. Se agregaron 250 µL de solución de clorhidrato de hidroxilamina/piridina de 20 mg/mL a 100 µL de solución de monosacáridos hidrolizados y se mantuvo en un baño de agua a 90 ◦C durante 45 min. Y luego se añadieron 250 µL de anhídrido acético y se mantuvo en un baño de agua a 90 ◦C durante otros 45 min. Al final de la reacción, la mezcla se extrajo con 1 ml de ciclohexano 5 veces y la capa de ciclohexano se concentró a 1 ml. Se inyectó 1 µL de sobrenadante en GC-MS para su análisis (Li & Shi, 2013).

2.3. animales

Todos los experimentos se realizaron con protocolos aprobados por el Comité de Uso de Cuidado Animal Institucional de la Universidad de Medicina China de Guangzhou. Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley, machos y hembras, con un peso de 180-220 g, del Centro de Animales de Laboratorio Médico de Guangdong (Foshan, China, Permiso No. SCXK (Yue) 2008-0002) y se mantuvieron en un ambiente libre de patógenos específicos (SPF). ) animalario bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h, con comida y agua a libre disposición.

Ante la insuficiencia renal inducida, se realizó nefrectomía 5/6 según la descripción anterior (Chen et al., 2019). Toda la operación quirúrgica se realizó bajo anestesia con hidrato de cloral al 10 por ciento. El grupo de operación simulada (n=6) siguió los mismos pasos para abrir la cavidad abdominal y exponer el riñón. Las ratas con nefrectomía 5/6 se dividieron aleatoriamente en dos grupos. Ratas sin tratamiento (grupo CKD, n=6) y ratas que recibieron JP (grupo CKD más JP, n=6) ​​por vía oral por sonda a una dosis de 1,2 g/kg/d. Después de 90 días de funcionamiento, comenzaron los 90 días de administración. El día 90 fue el momento final de administración de JP a las ratas, y después de 24 h los animales se sacrificaron extrayendo sangre de la aorta abdominal, y se recogieron muestras de orina, heces, suero y riñones de cada rata. Todas las muestras se almacenaron a −80 ◦C antes de su posterior análisis.

2.4. Análisis bioquímico

Siguiendo las instrucciones del fabricante, el nitrógeno ureico en sangre (BUN) y la creatinina sérica (Scr) se midieron con el kit de detección de creatinina en suero y el kit de detección de BUN (WAKO, Ginza, Japón), y la proteína urinaria se midió con el kit Elisa (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institution, Nanjing, China). Hematology Systems (Siemens 2021i, Erlangen, Alemania) analizó los glóbulos rojos (RBC), la hemoglobina (Hb), el hematocrito (HCT) y el recuento de plaquetas (PLT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.5. Examen histológico

Se utilizó ácido peryódico de Schiff (PAS) y tinción de Masson para evaluar la lesión patológica renal, entre ellas, la tinción de PAS se empleó para revelar la atrofia tubular renal y el área glomerular, y la tinción de Masson para la fibrosis intersticial renal (Xie et al. , 2020). El método de análisis cuantitativo se realizó de acuerdo con estudios previos (Chen et al., 2019). En resumen, la puntuación de atrofia tubular en la tinción PAS se definió de la siguiente manera: 1. túbulo atrófico único raro; 2. varios grupos de túbulos atróficos; 3. atrofia masiva. El área glomerular se midió con el software ZEN 3.1 (Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Alemania). El área fibrótica en la tinción de Masson se midió utilizando el software Image J (NIH, Bethesda, MD, EE. UU.). Se capturaron aleatoriamente al menos diez campos microscópicos (200x) de 6 ratas por grupo para medir la puntuación de atrofia, el área glomerular y el área fibrótica, con al menos un glomérulo en cada campo microscópico.

2.6. Análisis inmunohistoquímico

La sección de parafina renal (4 μm) de cada muestra se deshidrató gradualmente con xileno dos veces y se recuperó el antígeno en gradiente de etanol (100–95–90–80–70 %) con tampón de ácido cítrico (pH 6,0). ) durante 30 min, bloqueado con peróxido de hidrógeno al 3 por ciento durante 10 min y suero de cabra durante 30 min a temperatura ambiente. Las secciones de tejido se incubaron por separado con anticuerpo primario HIF-1 (Bioss, bs-0737R, 1: 500, Lote: BA01279129), HIF-2 (Bioss, bs-1447 R, 1:500, Lote: BJ2044786) a 4 ◦C durante 10 h y anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con HRP (Abcam, ab6712, 1:1000) a temperatura ambiente durante 30 min, se utilizó DAB (diaminobezid in) para detectar la actividad de HRP, el núcleo se contrastó con hematoxilina. la. La inmunohistoquímica se analizó bajo campos microscópicos de 400x de cada grupo y se fijó la barra de escala=20 μm mediante Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Alemania. El núcleo fue teñido de azul por hematoxilina y la inmunopositividad de DAB fue marrón, la tinción de DAB más profunda significa inmunohistoquímica positiva más fuerte.

2.7. detección de EPO

El contenido de EPO en suero fue detectado por el kit ELISA (Abcam, ab274398), y el experimento se refería al protocolo del kit ELISA. Como se resume, se agregó el cóctel de anticuerpos EPO a la muestra y se incubó durante 1 h. después de incubar, se lavó cada pocillo con tampón de lavado 3 veces, se añadió TMB al segundo incubado durante 15 min y se detuvo la reacción.

Se extrajo ARNm total de riñón de tejido de riñón congelado utilizando Trizol y se tradujo el ARNm a ADNc. La PCR en tiempo real se realizó con Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU., K0223) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La señal verde SYBR fue adquirida y medida por el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores fueron: 5′-CCG TCC CAG ATA CCA AAG TC-3′ y 5′-ACC CGA AGC AGT GAA GTG-3′ para ratas EPO (214 bps, NM_017001). 2); 5′- GTC GGT GTG AAC GGA TTT G-3′ y 5′-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C- 3′ para GAPDH (181 bps, NM_017008.3), el gens housekeeping como control interno en todos los casos. Y la cuantificación relativa de la expresión génica se calculó mediante el método de expresión génica normalizada (2− ΔΔCT).

Se cargaron cantidades iguales de lisados ​​de proteínas de cortezas renales y se separaron mediante gel SDS al 10 por ciento y luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Después de ser bloqueadas en leche descremada al 5 por ciento durante 2 horas a temperatura ambiente, las membranas se incubaron con el anticuerpo primario a 4 ◦C durante la noche. A continuación, las membranas se incubaron con IgG anti-ratón conjugada con HRP (peroxidasa de rábano picante) (Life Technologies) a temperatura ambiente durante 45 min. La actividad de HRP se visualizó utilizando Clarity Western ECL Substrate y se analizó mediante el sistema de imágenes Tanon. En este estudio se utilizó el siguiente anticuerpo primario: EPO monoclonal (B- 4) de ratones (Santa Cruz Biotechnology, sc-5290, dilución 1/500), actina monoclonal de ratones (tecnología de señalización celular, 8H10D10, dilución 1/1000).

2.8. Análisis de ácidos grasos de cadena corta

Un sistema Shimadzu UHPLC-LCMS/MS (Shimadzu LC-MS 8045 interconectado con Shimadzu LC-20AD) equipado con fuente ESI.

Las separaciones cromatográficas se realizaron en una columna Shim-pack GIST C18 (2,1 × 100 mm, 2 μm), usando {{10}},1 por ciento de ácido fórmico en agua ( disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) a un caudal de 0,3 ml/min mediante un gradiente de elución: 0–9 min, 25–30 % B; 9–11 min, 30–40 por ciento B; 11–20 min, 40–50 por ciento B; 20–20,1 min, 50–100 por ciento B; 20,1–23 min, 100 por ciento B; 23,1 min–25 por ciento B para reequilibrio. La temperatura de la columna fue de 35 ◦C, y el automuestreador se mantuvo a 4 ◦C durante el análisis, se inyectó 1 μL de cada muestra en el instrumento. La detección del analito se realizó en el modo de monitorización de reacciones múltiples (MRM), operado en el modo de iones positivos. Los parámetros de MS: Flujo de gas de nebulización: 3,0 L/min; Flujo de gas de secado: 10 L/min; Flujo de gas de calefacción: 10 L/min; Temperatura DL: 250 ◦C; temperatura de interfaz: 300 ◦C; Bloque calefactor: 400 ◦C. Las transiciones MRM y la energía de colisión (CE) se seleccionaron y optimizaron mediante la infusión directa de cada derivado estándar. Las cantidades de analitos transiciones MRM se resumieron en la Tabla S1.

SCFA fecales: se agregaron 100 μL de acetonitrilo al 50 por ciento en 3 mg de heces liofilizadas y se agitó durante 2 min. Luego la mezcla se centrifugó a 12000 rpm durante 10 min a 4 ◦C y se pipeteó el sobrenadante.

SCFA de riñón: Se pesaron 100 mg de tejido de riñón y se agitaron en hielo con 4 veces solución salina normal (100 mg/400 μL) para preparar homogeneizado de tejido. Se añadió 3 veces metanol frío en 300 μL de homogeneizado de tejido y se agitó en vórtex durante 2 min, luego se centrifugó la mezcla a 12000 rpm durante 10 min a 4 ◦C y se pipeteó el sobrenadante. El sobrenadante se secó con N2 y se reconstituyó con 100 μl de acetonitrilo al 50 por ciento.

Se agregaron 500 mmol/L de clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-Ń-etil carbodiimida (EDC, Aladdin, Shanghái, China), 50 mmol/L de 3H-[1,2,3]-Triazolo[4, 5-b] piridina-3-ol (HOAT, Aladdin, Shanghái, China) y 50 mg/mL de 12C-Dansilhidracina (12C-DnsHz, J&K, Beijing, China) en 20 μL de la muestra de extracción en secuencia con el mismo volumen. El EDC y el HOAT se prepararon con ácido etanosulfónico 2-(N-morfolino) fresco de 500 mmol/L (MES, Macklin, Shanghái, China). Después de incubar a 20 ◦C durante 90 min, se agregaron 20 μL 50 mmol/L CuCl2 (Macklin, Shanghái, China) a la mezcla para extinguir la reacción de derivatización a 40 ◦C durante 30 min (Zhao & Li, 2018). Al final de la derivatización, la mezcla se diluyó 10 veces con acetonitrilo al 25 por ciento. Antes del análisis, se mezclaron 100 μL de sobrenadante con 100 μL de solución estándar interna. El marcador 13C-DnsHz se utilizó como patrón interno (ISTD1-8) de acuerdo con la misma reacción de derivatización. El estándar SCFA: ácido acético (AA, A116173), ácido propanoico (PA, P110446), ácido isobutírico (IBA, I103524), ácido butírico (BA, B110438), 2-ácido metil butírico (2- BA, M107377), ácido isovalérico (IVA, I108280), ácido valérico (VA, V108271), ácido hexanoico (HA, H103632) fueron suministrados por Aladdin (Shanghai, China).

2.9. análisis estadístico

Los datos de cada grupo se expresaron como media ± desviación estándar (DE). La significación estadística entre los grupos se realizó mediante ANOVA unidireccional y análisis post hoc con la prueba Student-Newman-Keuls (SNK) o la prueba T3 de Dunnett. El valor de P < 0.05="" se="" consideró="" estadísticamente="" significativo.="" todos="" los="" datos="" se="" obtuvieron="" utilizando="" el="" software="" estadístico="" spss="" (versión="" 22.0,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="" ee.="">

3. Resultados

3.1. JP mejoró la función renal de ratas con ERC

El monosacárido de JP se caracterizó antes del tratamiento en animales. El JP utilizado en el presente estudio estaba compuesto por siete monosacáridos, es decir, ramnosa (1,62 por ciento), arabinosa (15,79 por ciento), fucosa (0,21 por ciento), xilosa (4,56 por ciento), manosa (3. 00 por ciento), glucosa (73,44 por ciento) y galactosa (4,99 por ciento) (Fig. 1). Nuestro método de análisis fue validado por linealidad, precisión, repetibilidad, estabilidad y recuperación (Tablas S2–S3). Se confirmó que los analitos eran estables a temperatura ambiente durante 24 h. El rendimiento de JP debe ser superior al 8,63 por ciento y la pureza no debe ser inferior al 77,16 por ciento. El análisis químico de JP mencionado anteriormente sirvió como enfoque de control de calidad para asegurar la reproducibilidad de los siguientes estudios en animales.

Scr, BUN y proteína urinaria fueron los más representativos de las funciones renales. Los niveles de Scr, BUN y proteína urinaria en ratas con ERC fueron significativamente más altos que los del grupo simulado (P < {{0}}.01).="" después="" de="" 90="" días="" de="" tratamiento="" con="" jp,="" los="" niveles="" de="" scr,="" bun="" y="" proteína="" urinaria="" se="" redujeron="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" ckd="" (p="">< 0,01)="" (fig.="">

3.2. JP mejoró la lesión patológica renal en ratas con ERC

El peso del riñón derecho completo para el grupo simulado y el riñón derecho remanente para el grupo CKD y CKD más JP se utilizaron para la evaluación de la morfología renal por peso del riñón (KW) y peso del riñón/peso corporal (KW/BW). Al final de los experimentos, el KW y KW/BW del grupo CKD aumentó en comparación con el grupo simulado (todos P < {{0}}.05).="" en="" el="" modelo="" de="" erc="" inducida="" por="" nefrectomía="" 5/6,="" la="" reducción="" de="" las="" actividades="" de="" la="" proteinasa="" renal="" provocó="" un="" crecimiento="" renal="" compensatorio,="" acompañado="" de="" hipertrofia="" renal="" (morton="" &="" griffiths,="" 1985),="" y="" nuestros="" autores="" confirmaron="" esta="" afirmación.="" después="" del="" tratamiento="" con="" jp,="" kw="" disminuyó="" significativamente="" (p="">< 0.05)="" y="" se="" cerró="" a="" un="" grupo="" simulado="" (p="" ˃="" 0.05);="" mientras="" que="" el="" kw/bw="" disminuyó="" levemente="" (p="" ˃="" 0.05).="" (fig.="">

Fig. 2. JP protegió la función renal en ratas con ERC. El nivel de Scr (A), BUN (B) y proteína urinaria (C) en diferentes grupos. (D) peso del riñón, (E) KW/BW. Los datos se presentaron como medias ± SD, n=6 por grupo (**P < 0.01="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" simulado;="" #p="">< 0.05="" ,="" ##p="">< 0,01="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="">

En el grupo con ERC, se mostró una atrofia masiva de los túbulos renales en comparación con el grupo simulado (P < {{0}}.01),="" y="" el="" área="" del="" glomérulo="" y="" la="" fibrosis="" intersticial="" renal="" fueron="" casi="" dos="" veces="" más="" que="" la="" del="" grupo="" falso="" en="" el="" análisis="" cuantitativo="" (p="">< 0.01).="" después="" del="" tratamiento="" con="" jp,="" la="" puntuación="" de="" atrofia="" tubular="" se="" redujo="" casi="" dos="" veces="" (p="">< 0,01),="" el="" área="" del="" glomérulo="" casi="" se="" recuperó="" a="" un="" grupo="" simulado="" (p="">< 0,01)="" y="" la="" fibrosis="" intersticial="" renal="" se="" redujo="" en="" un="" tercio="" (p="">< 0,01)="" como="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="" erc="" (fig.="">

Fig. 3. JP protegió la estructura renal en ratas con ERC. (A) Tinción PAS. (B) Tinción de Masson. (C) Puntuación de atrofia tubular. (D) Área glomerular (E) Área fibrótica. Todas las imágenes se presentan con un aumento idéntico, 200×, barra de escala=100 μm. Los datos se presentaron como medias ± SD, n=6 por grupo (**P < 0.01="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" simulado;="" #p="">< 0.05,="" ##p="">< 0.01="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" ckd="">

3.3. JP moduló los parámetros hematológicos en ratas con ERC

Para el análisis bioquímico de parámetros hematológicos, se midieron RBC, Hb, HCT y PLT. En ratas con ERC, el nivel de glóbulos rojos se redujo de 9,06 a 7,20 × 1012 /L, Hb de 15,28 a 13,22 g/dL, HCT de 47,1 a 40,4 por ciento y PLT aumentó de 1012 a 1526 × 109/L en comparación con un grupo simulado (P < 0,01),="" lo="" que="" indicó="" que="" se="" observaron="" signos="" de="" anemia="" en="" ratas="" con="" erc.="" se="" restauraron="" los="" niveles="" reducidos="" de="" rbc,="" hb,="" hct="" y="" plt="" en="" ratas="" con="" erc="" tratadas="" con="" jp="" (p="">< 0,01)="" (fig.="">

Fig. 4. JP rehabilitó los parámetros hematológicos en ratas con ERC. El nivel de PLT (A), RBC (B), Hb (C), HCT (D). Los datos se presentaron como medias ± SD, n=6 por grupo (**P < 0.01="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" simulado;="" #p="">< 0.05="" ,="" ##p="">< 0,01="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="">

3.4. Expresión de EPO estimulada por JP

En comparación con el grupo simulado, el nivel de EPO en suero y la cantidad de ARNm de EPO en riñón se redujeron significativamente en ratas con anemia por ERC (P < 0.01).="" el="" análisis="" de="" transferencia="" western="" reveló="" que="" el="" nivel="" de="" proteína="" epo="" presentó="" disminuciones="" leves="" en="" el="" grupo="" con="" erc="" sin="" diferencias="" significativas.="" después="" del="" tratamiento="" con="" jp,="" el="" nivel="" de="" epo="" en="" suero,="" el="" arnm="" de="" epo="" en="" riñón="" y="" la="" proteína="" aumentaron="" significativamente="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="" ckd="" (p="">< 0="" .01="" o="" p="">< 0.05)="" (fig.="">

En la corteza renal, HIF-1 fue producido principalmente por células epiteliales tubulares renales, HIF-2 se expresó principalmente en células endoteliales y fibroblastos intersticiales renales (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). El análisis inmunohistoquímico mostró que, en cuanto a HIF-1, en ratas con ERC, los tubulares estaban más teñidos que el grupo simulado. Después del tratamiento con JP, el área tubular renal tenía una tinción más fuerte y más grande en comparación con el grupo de CKD, como indica la flecha roja en la Fig. 5E. HIF-2 mostró inmunohistoquímica positiva relativamente débil en el intersticial renal en el grupo Sham. En el grupo de ERC, HIF-2 mostró inmunohistoquímica positiva. Después del tratamiento con JP, HIF-2 mostró una inmunohistoquímica más fuerte en comparación con el grupo de CKD (Fig. 5F).

Fig. 5. JP estimuló la expresión de EPO. (A) Contenido de EPO en suero. (B)RiñónARNm relativo de EPO. GAPDH fue considerado como gen de limpieza. (C) Las imágenes de Western blot representativas de la expresión de la proteína EPO. (D) Análisis densitométrico de EPO. (E) Inmunohistoquímica de HIF{{0}} . (F) Inmunohistoquímica de HIF- 2 normalizada al contenido de -actina. Las imágenes de inmunohistoquímica se presentan con un aumento idéntico, 400×, barra de escala=20 μm. El núcleo fue teñido de azul por hematoxilina y la inmunopositividad de DAB fue marrón, la tinción de DAB más profunda significa inmunohistoquímica positiva más fuerte. La flecha roja apunta a inmunohistoquímica positiva. Los datos se presentaron como medias ± DE, n=6 por grupo (*P < 0,05="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" simulado;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" con="">

3.5. JP indujo la liberación de SCFA

Se desarrolló un enfoque de metabolómica dirigida basado en LC-MS para cuantificar la liberación de ocho SCFA en muestras fecales. El método establecido se validó evaluando linealidad, sensibilidad, precisión, efecto matriz, exactitud y estabilidad. Se seleccionaron muestras de control de calidad de concentración baja, media y alta (LQC, QMC, HQC) para validación de sensibilidad, precisión, exactitud y estabilidad de acuerdo con los puntos de concentración más bajos, medios y más altos de la curva estándar de la matriz, y los resultados se muestran en las tablas S4–S6. Se confirmó que los analitos eran estables a 4 ◦C durante 48 h. El cromatograma LC-MS/MS de SCFA se muestra en la Fig. 6.

Fig. 6. Cromatografía UHPLC-MS/MS de SCFA. (A) La superior era la ecuación química de derivatización de SCFA; la fórmula estructural de los SCFA después de la derivatización con dansilhidracina; (B) El cromatograma UHPLC/MRM-MS de estándares de mezcla y muestra fecal, los picos cromatográficos en (B) se correspondieron con el marcador químico que se muestra en (A):1. ácido 12C-acético; 2. ácido acético 13C (ISTD1); 3. ácido 12C-propanoico; 4. ácido 13C-propanoico (ISTD2); 5. ácido 12C-isobutírico; 6. ácido 12C-butírico; 7. ácido 13C-isobutírico (ISTD3); 8. ácido 13C-butírico (ISTD4); 9. ácido 12C-2-metilbutírico; 10. ácido 12C-isovalérico; 11. ácido valérico 12C; 12. ácido 13C-2-metilbutírico (ISTD5); 13. ácido 13C-isovalérico (ISTD6); 14. Ácido 13C-valérico (ISTD7); 15. ácido 12C-hexanoico; 16. Ácido 13C-hexanoico (ISTD8).

En cuanto a la muestra fecal, en el grupo CKD, los niveles de AA y PA se redujeron notablemente casi 4 veces y 5 veces en comparación con un grupo simulado (P < 0.01);="" mientras="" que="" después="" del="" tratamiento="" con="" jp,="" las="" cantidades="" de="" aa="" y="" pa="" se="" restauraron="" a="" 4/5="" del="" grupo="" simulado="" (p="">< {{10}}.01).="" de="" manera="" similar,="" los="" niveles="" de="" ba="" y="" av="" se="" redujeron="" considerablemente="" casi="" 30="" veces="" y="" 4="" veces="" en="" el="" grupo="" ckd="" en="" comparación="" con="" un="" grupo="" simulado="" (p="">< 0.01).="" el="" tratamiento="" con="" jp="" mostró="" una="" tendencia="" creciente="" pero="" no="" una="" mejora="" significativa.="" el="" contenido="" de="" iba,="" iva="" y="" 2-ba="" no="" mostró="" un="" cambio="" notable="" entre="" el="" grupo="" ckd="" y="" el="" simulado.="" después="" del="" tratamiento="" con="" jp,="" el="" nivel="" de="" iba,="" iva="" y="" 2-ba="" aumentó="" (p="">< 0,01).="" sin="" embargo,="" ha="" no="" mostró="" un="" cambio="" evidente="" entre="" los="" tres="" grupos="" (fig.="" 7a).="" además,="" en="" cuanto="" al="" tejido="" renal,="" en="" el="" grupo="" ckd,="" las="" cantidades="" de="" ocho="" scfa="" se="" redujeron="" significativamente="" (p="">< 0,01),="" mientras="" que="" después="" del="" tratamiento="" con="" jp,="" los="" niveles="" de="" scfa="" aumentaron="" excepto="" ba="" y="" ha="" (p="">< 0,01="" o="" p="">< 0,5).="" ba="" se="" incrementó="" ligeramente="" sin="" significancia,="" y="" ha="" no="" mostró="" cambios="" después="" del="" tratamiento="" con="" jp="" (fig.="">

Fig. 7. Contenido de SCFA en diferentes grupos. (A) SCFA fecales. (B) SCFA de riñón. Los datos se presentaron como medias ± DE, n=6 por grupo (**P < 0.01="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" simulado;="" ##p="">< 0.="" 01,="" #p="">< 0,05="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="">

4. Discusión

En el presente modelo de rata CKD con nefrectomía 5/6, elriñónfunciónlos indicadores (Scr, BUN y proteína en orina) se incrementaron significativamente, apareció la hipertrofia renal remanente y la lesión patológica renal, acompañada de parámetros hematológicos alterados. Estos datos estaban en línea con estudios previos (Garrido et al., 2015, Morton & Griffiths, 1985). Los indicadores anteriores mostraron que las ratas con anemia CKD inducida por la nefrectomía 5/6 se establecieron con éxito y se pudo verificar el efecto beneficioso de JP en el tratamiento de ratas con anemia CKD. Con elriñónfuncióndeteriorada aún más, la anemia ha sido reconocida como una complicación oportunista conocida de la ERC, que impactó negativamente en la calidad de vida de los pacientes (Locatelli, Fishbane, Block, & Macdougall, 2017). Comprender los factores de riesgo relacionados con el progreso de la anemia renal ayudará a desarrollar enfoques terapéuticos. Hoy en día, el vínculo entre la enfermedad y el metabolismo de la microbiota intestinal ha atraído cada vez más atención, mientras que la relación entre los AGCC y la anemia renal es aún menos conocida. Los SCFA, metabolizados principalmente por Clostridium, Coprococcus y Bacteroides (Koh et al., 2016), se dirigen a receptores específicos unidos a la membrana, que desempeñan un papel importante en el mantenimiento del equilibrio del entorno intestinal y la salud de todo el cuerpo. Ya se ha demostrado que los SCFA tienen una relación inseparable con la ERC, y los niveles de ácido acético, ácido propiónico y ácido butírico se redujeron en la ERC (Wang et al., 2019). En ratas con ERC inducida por adenina, la abundancia y diversidad de la microbiota intestinal cambiaron significativamente, y las empresas redujeron el nivel de ácido propanoico, ácido butírico y ácido valérico (Lakshmanan, Al, Ali y Terranegra, 2021). Según nuestro estudio anterior, la secuenciación del ADNr 16S mostró que la disbiosis de la microbiota intestinal se mostró en 5/6 ratas con ERC inducida por nefrectomía en comparación con el grupo simulado. Algunos de los géneros que producen SCFA, especialmente ácido butírico de Clostridium, Coprococcus, mostraron diferencias en ratas con ERC (Zheng et al., 2020). De acuerdo con esto, nuestros resultados mostraron que las cantidades de ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico se redujeron en aproximadamente un 60 %, 80 %, 85 % y 60 % en ratas con ERC, lo que indica que la disminución de SCFA correspondió con el desequilibrio del entorno intestinal. Es de destacar que el trastorno del entorno intestinal inducido por la ERC desencadenó el metabolismo anormal de la microbiota intestinal (Feng et al., 2019). Además, encontramos que, en ratas con anemia CKD, se redujeron ocho tipos de niveles de SCFA. Por ejemplo, la anomalía de los productos finales metabólicos, es decir, los AGCC, podría deberse a la progresión de la ERC.

Los polisacáridos, uno de los ingredientes activos, se han encontrado en varias hierbas, como Dioscoreae Rhizoma, Schisandra Chinensis, Astragali Radix y Jujubae Fructus. Los polisacáridos pueden ser fermentados y degradados por la microbiota intestinal. Como resultado, los polisacáridos se presentan como un sustrato para que la microbiota intestinal se metabolice en SCFA o se considera que poseen un efecto prebiótico para mejorar la composición de la microbiota intestinal y facilitar la producción de SCFA (Cai et al., 2019). En este estudio, nuestros hallazgos revelaron que los polisacáridos de la azufaifa estimularon la liberación de SCFA por parte de la microbiota intestinal, como el ácido acético, el ácido propanoico, el ácido isobutírico y el ácido 2-metilbutírico en ratas con ERC. Además, después del tratamiento con JP, el nivel de AGCC en riñones de rata con anemia por ERC mejoró y la tendencia al cambio fue consistente con la muestra fecal. Sobre la base de la investigación existente, la relación entre SCFA y CKD se había aclarado gradualmente. Por ejemplo, se informó que el ácido acético modula el sistema inmunológico y mejora lariñónlesiónal inhibir la señalización de NADPH oxidasa en las células T (Al-Harbi et al., 2018). Se ha demostrado que el ácido propanoico previene la progresión de la ERC inducida por adenina a través del receptor de ácidos grasos libres 2 (FFA2) y FFA3 (Mikami et al., 2020). Por lo tanto, inferimos que la recuperación del nivel de SCFA en el riñón fue beneficiosa para un riñón enfermo. Se ha informado que JP aumentó la diversidad de la microbiota intestinal y aumentó la abundancia relativa de microbiota activa SCFA (Bacteroides) en ratones con cáncer colorrectal (Ji et al., 2020). Además, JP aumentó la concentración de SCFA totales en muestras fecales (Ji et al., 2019). Por lo tanto, inferimos que JP podría estimular la producción de SCFA para lograr el propósito de retardar la progresión de la ERC. JP también podría ser un sustrato metabólico para la microbiota dominante de SCFA para estimular la producción de SCFA en la ERC, o un componente similar a un prebiótico para restaurar el ambiente intestinal, especialmente la diversidad de la microbiota dominante de SCFA, y promover aún más la liberación de SCFA, a fin de prevenir la progresión de la ERC.

En general, los SCFA (sin carbón superior a 6) con peso molecular pequeño y alta polaridad química son difíciles de analizar directamente mediante enfoques cromatográficos. Una estrategia de derivatización química marcada con isótopos de SCFA podría mejorar la sensibilidad del instrumento y reducir los errores de análisis, lo que proporcionó una estrategia útil para la determinación de SCFA en el análisis LC-MS/MS (Higashi & Ogawa, 2016). Recientemente, los enfoques marcados con dansilhidrazina se han utilizado satisfactoriamente para detectar metabolitos de plasma humano objetivo que contienen ácido carboxílico (Chen & Zhang, 2020). En apoyo de esto, en este estudio, desarrollamos aún más la derivatización química basada en el enfoque LC-MS/MS para la determinación de 8 SCFA en heces de rata. Los SCFA son producidos por la microbiota intestinal y casi el 10 % de los SCFA se excretan a través de las heces (Boets et al., 2015). Por lo tanto, un análisis de muestras fecales de SCFA puede reflejar los cambios en el entorno intestinal directamente y tiene más referencia en el análisis conjunto multiómico entre SCFA y microbiota intestinal. En particular, la validación de inestabilidad, encontramos que los SCFA marcados con dansilhidrazina eran inestables a temperatura ambiente, y su intensidad en el espectro de masas mostraba una tendencia a la baja con el tiempo, pero podía permanecer estable durante 48 h a 4 ◦C. Por lo tanto, después de la derivatización de SCFA, los analitos deben mantenerse a 4 ◦C antes del análisis.

En las etapas 4 y 5 de la ERC avanzada, la deficiencia en la producción de EPO restringe la eritropoyesis, lo que contribuye al factor más crítico en el desarrollo de la anemia renal (Sakashita, Tanaka y Nangaku, 2019). Las guías de práctica clínica sugieren el tratamiento de rutina con agentes estimulantes de la eritropoyesis (AEE) para la anemia. Sin embargo, la seguridad de los ESA que se asocia con un mayor riesgo de muerte y eventos cardiovasculares debe ser motivo de preocupación (Thavarajah & Choi, 2019). En pacientes con anemia renal, la expresión de EPO debía ser consistente o levemente elevada en comparación con los cuerpos sanos (Babitt & Lin, 2012). En una etapa temprana, el nivel de EPO presentó una tendencia alcista, mientras que en la etapa tardía, el nivel de EPO mostró una tendencia a la baja en comparación con la etapa inicial, incluso por debajo de lo normal (Panjeta, Tahirovi´c, Sofi's, ´ Cori's, & Derviˇsevi c, 2017). En correspondencia con experimentos anteriores (Chen et al., 2019; Wang et al., 2020), nuestros resultados indicaron que el nivel de EPO en suero disminuyó en ratas con anemia por ERC. Detectamos respectivamente el ARNm de EPO de riñón y el nivel de proteína en ratas con ERC, y el nivel de proteína de EPO de riñón disminuyó ligeramente en comparación con el grupo simulado, mientras que la cantidad de ARNm de EPO de riñón se degradó y su grado fue mayor que el nivel de EPO en suero. El riñón es la principal fuente de síntesis de EPO en adultos y pacientes con ERSD.riñonestodavía conserva la capacidad de producir eritropoyetina (Bernhardt et al., 2010). Para corregir los niveles de EPO sérica endógena y adaptarse a la anemia renal, se activó la producción de EPO renal, aunqueriñónlesiónreducción de la expresión de ARNm de EPO (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Después del tratamiento con JP, se incrementó el nivel de EPO en suero, así como también se mejoraron los niveles de ARNm y proteína de EPO en riñón. En nuestro estudio anterior, JP podría estimular la actividad transcripcional de HRE y mejorar el gen EPO (Chen et al., 2014). Por lo tanto, especulamos que JP podría recuperar el nivel de EPO en suero de rata CKD a la anemia renal regulada, lo que puede contribuir a la expresión génica de EPO de riñón estimulada a nivel de ARNm.

En la corteza, el HIF-1 se encontró principalmente en el intersticio tubular y el HIF-2 en el intersticio renal. Debido a que la EPO es producida principalmente por fibroblastos en los que se ubica HIF-2, esto respalda que HIF-2 puede ser responsable de regular la producción de EPO (Maxwell, 2003). En nuestro estudio, encontramos que HIF-1 y HIF-2 podrían ser activados por la ERC, y el tratamiento con JP podría estimular la actividad de HIF-1 y HIF-2 en comparación con las ratas con ERC . Se ha demostrado que HIF-2 tiene un papel importante en la regulación de la producción de EPO (Kapitsinou et al., 2010), mientras que la regulación al alza de HIF-1 puede tener un efecto de protección renal en el riñón (Jiang et al. al., 2020), que indirectamente mejora la producción de EPO. La producción de EPO renal se reguló en primer lugar a nivel de ARNm, bajo anemia o hipoxia, la expresión de ARNm de EPO podría aumentar mediante la estimulación de la proteína HIF. Anteriormente, la investigación farmacológica mostró que el azufaifo estimulaba la expresión de EPO a través de la regulación del nivel de proteína HIF en el modelo celular (Chen et al., 2014, Lam et al., 2016). Por lo tanto, inferimos que JP puede aumentar la expresión del ARNm de EPO a través de la proteína HIF para lograr el propósito de aliviar la anemia renal.

Además, según los resultados actuales, especulamos que la reducción de SCFA puede tener un papel crucial en la expresión de EPO mediada por HIF, lo que contribuye a la anemia CKD. En consonancia con esto, se ha ilustrado que el aumento del nivel de ácido acético fue beneficioso para la acetilación de HIF-2 y la generación del complejo proteína de unión a CREB-HIF 2, e indujo aún más la expresión de EPO (Xu et al., 2014). El ácido propiónico atenuó la interrupción mitocondrial, la apoptosis del hipocampo y los déficits neurológicos a través de la vía HIF-1/ERK (Cheng et al., 2019). Además, se descubrió que el ácido butírico estabiliza el HIF-1, activa los genes diana del HIF en las células del colon y mitiga la respuesta inflamatoria del colon (Kelly et al., 2015). En nuestro estudio, encontramos que los niveles de ácido acético, ácido propanoico y ácido butírico se redujeron significativamente acompañados de expresión anormal de la proteína HIF- en ratas con ERC, lo que indicó que la estabilidad de HIF- podría estar relacionada con la disminución de SCFA, y los SCFA podrían haber el efecto de estabilizar HIF para regular la expresión de EPO.

5. Conclusiones

En conclusión, probamos que JP mejoró la ERC y su anemia asociada, cuyo mecanismo estaba involucrado en la regulación de la liberación de SCFA y la producción de EPO. Y JP podría ser el ingrediente bioactivo de jujube para el tratamiento de la anemia. Estos hallazgos pueden proporcionar evidencia para un mayor desarrollo de JP como complementos alimenticios para el tratamiento de la anemia asociada a la ERC.

Declaración ética

Todos los experimentos con animales en nuestra investigación se realizaron con protocolos aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina China de Guangzhou y de acuerdo con las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NIH Publicaciones No. 80-23, revisado en 1996). No hay violación de las pautas anteriores en nuestra investigación.

Expresiones de gratitud

Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (2018A030313305), la Fundación de Ciencias Naturales de China (81804052, 81973577 y 82004248), el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (JSGG20191129102216637 y ZDSYS201606081515458), la Oficina de Medicina Tradicional China de la provincia de Guangdong ( 20201320).

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