El fijador de Karnovsky previene la aparición de artefactos como vacuolación derivada del procesamiento de tejidos en riñones tratados con oligonucleótido antisentido Ⅰ

Abstracto: Oligonucleótido antisentido(ASO) se han identificado como una nueva modalidad de tratamiento paraenfermedades intratables. Enriñones tratados con ASO, a menudo se observan vacuolas, además de gránulos basófilos, en los túbulos proximales. Algunos informes han descrito que es probable que estas vacuolas sean un fenómeno secundario resultante de laextracción de ASOdurante el procesamiento del tejido. En este estudio, comparamos la morfología renal después de la fijación con fijador de Karnovsky o tampón fosfato de paraformaldehído (PFA) al 4% con la de una solución de formaldehído tamponada neutra (NBF) al 10%. Se examinaron ratas hembra Sprague-Dawley, tratadas por vía intravenosa cuatro veces con 50 mg/kg de ácido nucleico bloqueado que contenía oligonucleótidos antisentido (LNA-ASO) durante 1 o 2 semanas. Microscópicamente, se observaron vacuolas y gránulos basófilos en los túbulos proximales en los riñones fijados con NBF. Los gránulos basófilos son indicativos de la acumulación de ASO. Además, algunas de las vacuolas también contenían gránulos basófilos débiles, lo que sugiere que las vacuolas eran relevantes para la acumulación de ASO. Aunque se observó una vacuolación moderada en los túbulos proximales, la mayoría de los epitelios vacuolados dieron resultados negativos para la molécula de lesión renal -1 en la tinción inmunohistoquímica. En las muestras sometidas a fijación de Karnovsky no se observaron vacuolas en los túbulos proximales, aunque sí se observaron gránulos basófilos. En las muestras sometidas a fijación con PFA, se observaron vacuolas y gránulos basófilos en los túbulos proximales, similares a los de las muestras sometidas a fijación con NBF. En general, nuestros hallazgos demostraron la posibilidad de una sobreestimación de la vacuolación debido a artefactos durante el procesamiento del tejido cuando se utiliza la fijación convencional de NBF. El fijador de Karnovsky se considera una alternativa útil para distinguir las vacuolas artificiales de la nefrotoxicidad verdadera. (DOI: 10,1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Palabras clave:oligonucleótido antisentido, artefacto,fijador de Karnovsky, vacuolación, gránulo basófilo, riñón

Suplemento Cistanche Suplemento de apoyo a la función renal PhGs75% Ech 30% Act 12%

Recientemente, las terapias con oligonucleótidos antisentido (ASO) se han establecido como nuevas modalidades para el tratamiento de enfermedades intratables1, 2. Los ASO son oligodesoxinucleótidos monocatenarios, sintéticos, cortos, que se unen al ácido ribonucleico y suprimen la expresión génica.

Toxicológicamente, las toxicidades inducidas por ASO se clasifican en toxicidades dependientes de la hibridación, que están relacionadas con la secuencia de ASO, y toxicidades independientes de la hibridación, que están relacionadas con la modificación química. Las toxicidades independientes de la hibridación son inducidas por tres mecanismos principales: 1) acumulación de ASO, 2) efectos proinflamatorios y 3) efectos de unión aptamérica4. La acumulación de ASO se observa principalmente en el hígado y los riñones, y una acumulación excesiva conduce a la disfunción de estos órganos5. El efecto proinflamatorio es inducido por la estimulación del sistema inmunológico innato mediante la unión a receptores tipo Toll en roedores y monos o la activación de la vía alternativa del complemento mediante la inhibición del factor H por los ASO en monos6. El efecto de unión aptamérica induce la activación y agregación plaquetaria/trombocitopenia para unirse al receptor específico de plaquetas7. Además, la unión aptamérica a proteínas intracelulares en los hepatocitos se considera una de las causas de hepatotoxicidad8–10. Para detectar estas toxicidades, los investigadores han desarrollado varios ensayos no clínicos; entre ellas, el examen histopatológico es una de las pruebas más sensibles para detectar la acumulación de ASO.

Histopatológicamente, la acumulación de ASO se observa comúnmente como gránulos basófilos en el citoplasma de las células de Kupffer en el hígado o en los túbulos proximales de los riñones. La acumulación prominente de gránulos basófilos se correlaciona con una mayor incidencia o gravedad de cambios degenerativos, comúnmente observados como vacuolación o degeneración/necrosis del epitelio tubular proximal en los riñones4. Los gránulos basófilos por sí solos no se consideran toxicológicamente significativos11; por lo tanto, la diferenciación entre la acumulación de gránulos basófilos y los cambios degenerativos es importante para evaluar las toxicidades relacionadas con el ASO.

Las vacuolas, que a menudo se observan en los túbulos proximales de los riñones de los monos cynomolgus tratados con ASO, contienen material basófilo y exhiben la misma distribución general dentro de las células que los gránulos basófilos11, 12. Algunos informes han sugerido que el proceso de fijación puede influir en la aparición de acumulación de ASO dentro del compartimento fagolisosomal5, 11. Además, Henry et al. y Engelhardt describieron que las vacuolas en los túbulos proximales probablemente sean un fenómeno secundario resultante de la extracción de ASO durante el procesamiento porque las vacuolas están ausentes en los riñones fijados por perfusión con paraformaldehído/glutaraldehído5, 11. Vacuolas en los túbulos proximales de monos cynomolgus tratados Se especuló que aparecerían con mipomersen durante el proceso de fijación13.

Por lo tanto, aunque la vacuolación debida al tratamiento con ASO puede ser un artefacto en algunos casos, esta hipótesis no se ha probado claramente y ningún informe ha identificado el método de fijación apropiado para la evaluación toxicológica. En consecuencia, en este estudio, comparamos la morfología renal después de la fijación con fijador de Karnovsky o tampón fosfato de paraformaldehído (PFA) al 4% con la de una solución de formaldehído tamponada neutra (NBF) al 10%. Además, demostramos la utilidad del fijador de Karnovsky como fijador alternativo para prevenir la vacuolación derivada de artefactos.

Se compraron ratas Sprague-Dawley hembra de cuatro semanas de edad de Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, Japón) y se aclimataron a las condiciones de laboratorio. Los animales se mantuvieron en condiciones controladas (ciclo de luz/oscuridad de 12- horas, temperatura de 23 ± 2 grados, humedad relativa de 50 ± 25%) y se les permitió libre acceso a una dieta comercial estándar (CR-LPF esterilizada en autoclave; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio, Japón) y agua del grifo. Se asignaron veinte animales a los siguientes cuatro grupos (con cinco animales cada uno): el grupo tratado con solución salina de 1-semanas (Control- 1W), el grupo tratado con solución salina de 2-semanas (Control{ {14}}W), el grupo tratado con ácido nucleico bloqueado que contiene oligonucleótido antisentido (LNA-ASO) de 1-semana (ASO-1W) y el grupo tratado con LNA ASO de 2-semana (ASO-2W). Los animales tenían 5 semanas de edad en el momento del inicio de la administración de 50 mg/kg de LNA-ASO. LNA-ASO se administró por vía intravenosa cuatro veces en total según el siguiente régimen: días 1, 4, 8 y 11 en el grupo ASO-2W; y los días 1, 2, 3 y 4 en el grupo ASO-1W. Los animales de los grupos Control-1W y ASO-1W se sacrificaron el día 7. Los animales de los grupos Control-2W y ASO-2W se sacrificaron el día 14. En cada necropsia terminal, se recolectaron muestras de sangre para patología clínica de la vena cava abdominal bajo anestesia profunda con isoflurano. Después de tomar muestras de sangre, todas las ratas fueron sacrificadas mediante desangrado cortando inmediatamente la aorta abdominal. Se examinaron macroscópicamente la superficie externa del cuerpo, las cavidades torácica y abdominal y las vísceras, y se extirparon y procesaron los riñones izquierdos para su examen microscópico. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las Reglas para la alimentación y almacenamiento de animales de experimentación y experimentos con animales de Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation.

Las muestras de suero se obtuvieron mediante centrifugación de las muestras de sangre a 4 grados. El análisis bioquímico del suero se realizó utilizando un instrumento TBA-2000FR (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Japón) para evaluar los niveles de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina (CRE).

Los riñones se fijaron utilizando tres soluciones fijadoras de la siguiente manera: después de dividir el riñón transversalmente en tres segmentos, la porción media, incluida la pelvis renal, se fijó en NBF al 10% durante 5 días; la porción craneal se fijó con fijador de Karnovsky (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokio, Japón); y la porción caudal se fijó en PFA al 4% durante 17 horas a 4 grados y luego se colocó en NBF al 10% durante 24 horas. Cada muestra fijada fue deshidratada y embebida en parafina. Se prepararon secciones de tejido para tinción con hematoxilina y eosina (H&E). La tinción inmunohistoquímica se realizó utilizando anticuerpos dirigidos a la molécula de lesión renal-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, EE. UU.; dilución 1:300) y la proteína 2 de membrana asociada a lisosomas (LAMP{{ 13}}; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.; dilución 1:1000) después de la recuperación del antígeno (tampón citrato, pH 6,0, calentado durante 10 min o calentado bajo presión durante 20 min). Se utilizó Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japón) como anticuerpo secundario.

Servicio de apoyo de Wecistanche:

Correo electrónico:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Compre para obtener más detalles de especificaciones:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop