El eje renal hepcidina/ferroportina controla la reabsorción de hierro y determina la magnitud de la sobrecarga de hierro renal y sistémica
Mar 02, 2022
Contacto: emily.li@wecistanche.com
Goran Mohammad1, Athena Matakidou2, Peter A. Robbins1 y Samira Lakhal-Littleton1
PALABRAS CLAVE:ferroportina; hemocromatosis; hepcidina; planchar; sobrecarga de hierro;renaltúbulos
La ferroportina (FPN) es la única proteína de exportación de hierro de mamíferos conocida. Interviene en la liberación de hierro a la circulación desde los enterocitos duodenales y los macrófagos reticuloendoteliales esplénicos, los sitios respectivos de absorción y reciclaje de hierro.1,2 La liberación de hierro mediada por FPN es antagonizada por la hormona hepcidina, también conocida como péptido antimicrobiano de hepcidina (HAMP). Producida principalmente en el hígado, la hepcidina se une e induce la internalización de FPN, lo que limita la liberación de hierro en la circulación y su disponibilidad para los tejidos periféricos.3,4 Por lo tanto, el eje HAMP/FPN opera en los sitios de absorción y reciclaje para controlar homeostasis del hierro.
El riñón es el sitio de reabsorción de hierro. Tanto el hierro no unido a la transferrina como el unido a la transferrina pueden pasar al fifiltrado glomerular.5 La gran mayoría de este hierro vuelve al epitelio tubular. Varios transportadores han estado implicados en esta recaptación, incluido el complejo receptor multiligando megalina-cubilina, el receptor de transferrina 1, el transportador de metal divalente 1, el transportador de zinc ZIP8 y el transportador de zinc ZIP14.5–10.
una vez en elrenalepitelio, el hierro se reabsorbe en la circulación. FPN es abundante en elriñóny se ha implicado en la reabsorción de hierro. 11–14 Sin embargo, aún se desconoce si la FPN renal también está sujeta a la regulación por HAMP endógeno en condiciones fisiológicas normales y, de ser así, si dicha regulación es importante para la homeostasis del hierro renal y/o sistémica.
Para abordar estas preguntas, generamos un nuevo modelo de ratón con un induciblerenaltubito–knock-in específico de fpnC326Y, que codifica una proteína FPNC326Y resistente a HAMP. Además, para confirmar el papel previamente informado de FPN en la reabsorción de hierro, también generamos un modelo de ratón con un induciblerenaltubito–deleción específica del gen fpn. Nuestros resultados demuestran que el HAMP endógeno regula directamente la absorción de hierro mediada por FPN y que esta regulación es importante tanto pararenaly la homeostasis sistémica del hierro, particularmente en el contexto de un exceso de disponibilidad de hierro.
Este estudio es el primero en utilizar ratones que albergan una pérdida renal específica de la capacidad de respuesta HAMP para determinar formalmente laimportanciadelrenalEje HAMP/FPN. Proporciona nuevos conocimientos sobre el papel de la reabsorción de hierro en la determinación del grado de sobrecarga de hierro renal y extrarrenal en el contexto de la hemocromatosis.
MÉTODOS
Ratones
Todos los procedimientos con animales cumplieron con la Ley de animales del Ministerio del Interior del Reino Unido (Procedimientos científicos) de 1986 y fueron aprobados por el Comité de revisión ética de la División de Ciencias Médicas de la Universidad de Oxford.
Los alelos condicionales fpnflfl y fpnC326Yflfl se generaron como se describió anteriormente.15,16
Los ratones que albergaban el transgén Pax8.CreERT2þ fueron un regalo de la Dra. Athena Matakidou, Cancer Research UK Cambridge Institute, Universidad de Cambridge. Estos ratones se generaron como se describió anteriormente.17 Todos los ratones estaban en un fondo C57BL/6.
Dietas
A menos que se indique lo contrario, a los animales se les proporcionó una dieta estándar para roedores que contenía 200 partes por millón (ppm) de hierro. En experimentos de manipulación de hierro, los ratones recibieron una dieta cargada de hierro (5000-ppm de hierro; Teklad TD.140464) o una dieta de control combinada (200- ppm de hierro; Teklad TD.08713) desde el destete durante 3 meses.
Cuantificación de hierro e índices de hierro
Los niveles séricos de hierro y ferritina se determinaron mediante el sistema ABXPentra (Horiba Medical). Los valores de hemoglobina se determinaron mediante microcubetas de hemoglobina HemoCue Hb 201. Los niveles séricos de eritroferrona se midieron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (Intrinsic Lifesciences). La determinación del hierro elemental total en los tejidos se realizó mediante espectrometría de masas de plasma de acoplamiento inductivo, como se describió anteriormente.15,16,18 g, se añadieron 1 ng/g, 10 ng/g, 20 ng/g y 100 ng/g de hierro a réplicas de una muestra seleccionada. Se diluyó y midió un estándar externo de hierro (High Purity Standards ICP-MS-68-A solution) para confirmar la validez de la calibración. También se agregó rodio a cada blanco, estándar y muestra como estándar interno a una concentración de 1 ng/g. Para la cuantificación de hierro urinario, se recogió orina de ratones durante un período de 24 horas y se sometió a espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente. Los niveles de creatinina en las mismas muestras se midieron utilizando un kit de ensayo colorimétrico de creatinina (Abcam; ab65340), y los valores de hierro se normalizaron a la concentración de creatinina.
inmunohistoquímica
La inmunotinción de fluorescencia se realizó en secciones de tejido embebidas en parafina y fijadas con formalina, usando anticuerpo FPN (Novus Biologicals; NBP1-21502) a 1:100 y anticuerpo Pro-Hepcidina (AA 39-59) a 1:50 (Anticuerpos en línea; ABIN350367). Las especificidades de los anticuerpos FPN y hepcidina se confirmaron utilizando animales Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y animales Hamp–/– como controles negativos, respectivamente (Figura complementaria S1). Los marcadores del segmento renal se identificaron usando anticuerpo acuaporina-1 a 1:200 (Biotechne; NB600- 749), anticuerpo acuaporina-2 a 1:200 (Biotechne; NBP1-70378), o anticuerpo de calbindina a 1:100 (Abcam; ab82812). Los anticuerpos secundarios fueron IgG anti-conejo Alexa Fluor-488 (Abcam; ab150073), IgG Cy3 anti-burro (Abcam; ab6949) e IgG anti-ratón Alexa568 (Abcam; ab175473). Se tomaron imágenes de los portaobjetos usando un microscopio FV1000 Olympus.
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transferencia occidental
Los tejidos se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido, se trituraron y luego se lisaron utilizando el sistema de tampón de lisis RIPA (Santa Cruz; sc-24948), según las instrucciones del fabricante. Los lisados de tejidos se aclararon mediante centrifugación a 15 000g durante 10 minutos a 4 °C. La concentración de proteínas en los lisados se midió mediante el ensayo de proteínas BCA (Pierce; 23225) y se normalizó a la misma concentración para cada lote. A continuación, los lisados se diluyeron en tampón de muestra de dodecilsulfato sódico de Laemmli no reductor y se calentaron a 95 °C durante 5 minutos. La proteína (30–50 mg) se cargó en geles Mini-PROTEAN TGX (Biorad; 4561096). Después de la electroforesis, la proteína se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno usando el sistema BioRad Translotter, y las membranas se bloquearon durante una hora en tampón de bloqueo que contenía albúmina de suero bovino al 5 por ciento. Luego, las membranas se tiñeron durante la noche a 4 °C con anticuerpo policlonal de conejo anti-FPN de ratón (NBP1-21502; Novus Biologicals) a 1:1000 o anticuerpo anti-b-actina conjugado con peroxidasa de rábano picante (Proteintech; HRP{{18} }) a 1:5000. Las transferencias se desarrollaron utilizando el kit de detección principal ECL (RPN2232; VWR International). Las intensidades de las señales se cuantificaron mediante ImageJ y se calculó la relación entre las señales de FPN y b-actina para producir intensidades normalizadas.
Tinción de Perls mejorada con diaminobencidina (DAB)
Las secciones de tejido incluidas en parafina y fijadas con formalina se desparafinaron usando xileno y luego se rehidrataron en etanol. A continuación, los portaobjetos se tiñeron durante 1 hora con ferricianuro de potasio al 1 por ciento en 0,1 mol/l de tampón HCl. La actividad de la peroxidasa endógena se extinguió y luego los portaobjetos se tiñeron con sustrato cromógeno DAB y se contratiñeron con hematoxilina. Se visualizaron usando un microscopio estándar de campo brillante.
Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa
La expresión génica se midió utilizando sondas de ensayo de expresión TaqMangene de Applied Biosystems para Hamp y bactina génica de limpieza (Life Technologies). El valor del ciclo de umbral (CT) para el gen de interés primero se normalizó deduciendo el valor de CT para la b-actina para obtener un valor de DCT. Los valores de DCT de las muestras de prueba se normalizaron adicionalmente al promedio de los valores de DCT para las muestras de control para obtener los valores de DDCT. Los niveles relativos de expresión génica se calcularon luego como 2-DDCT.
Estadísticas
Los valores se muestran como SEM medio. Las comparaciones pareadas se realizaron utilizando la prueba t de Student. Se realizaron comparaciones múltiples mediante análisis de varianza. Las pruebas post hoc utilizaron la corrección de Bonferroni.
Figura 1|El eje hepcidina/ferroportina (FPN) en los túbulos renales controla la reabsorción de hierro y es importante para la homeostasis renal del hierro.en ratones hembra. (a)Imágenes representativas de tinción inmunofluorescente para FPN, acuaporina 1 (AQP1), acuaporina 2 (AQP2) y calbindina (CalD) en riñones de ratones de tipo salvaje. Barras¼ 200 mm, aumento original 10. Panel final, barra¼ 25 mm, aumento original 60. (b) Western blot para FPN enriñonesde ratones hembra y macho FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreeR T2 þ y controles FpnC326Y flfl/flfl 1 semana después del tratamiento con tamoxifeno. La cuantificación de la intensidad de la señal se muestra en el panel inferior. (c) Western blot para FPN en riñones de ratones hembra y macho Fpnflfl/ flfl, Pax8.CreERT2þ y controles Fpnflfl/flfl 1 semana después del tratamiento con tamoxifeno. La cuantificación de la intensidad de la señal se muestra en el panel inferior. (d) Niveles de hierro renal en FpnC326Y femenino y masculinoflfl/flfl,Ratones Pax8.CreERT2þ y controles FpnC326Yflfl/flfl 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses después del tratamiento con tamoxifeno. ( e ) Imágenes representativas de la tinción de hierro Perls mejorada con diaminobencidina (DAB) en la región cortical renal de los animales correspondientes 3 meses después de la inducción con tamoxifeno. Barras ¼ 200 mm, aumento original 10. (f) Niveles de hierro renal en ratones hembra y macho Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ y controles Fpnflfl/flfl 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses después de la inducción con tamoxifeno. ( g ) Imágenes representativas de la tinción de hierro Perls mejorada con DAB en la región cortical renal de los animales correspondientes 3 meses después de la inducción con tamoxifeno. (Continuado)
Figura 1 |(Continuación) Barras ¼ 200 mm, aumento original 10. (h) Niveles de hierro en suero en ratones hembra y macho FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y controles FpnC326Yflfl/flfl 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses después del tratamiento con tamoxifeno. (i) Niveles de hierro en suero en ratones hembra y macho Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y controles Fpnflfl/flfl 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses después de la inducción con tamoxifeno. Los valores se muestran como SEM medio. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" y="" ****p="">< 0,0001.="" b-act,="" b-actina;="" cont,="" control;="" dapi,="" 40,6-diamidino-2-fenilindol;="" ppm,="" partes="" por="" millón.="" para="" optimizar="" la="" visualización="" de="" esta="" imagen,="" consulte="" la="" versión="" en="" línea="" de="" este="" artículo="" en="">
RESULTADOS
El eje hepcidina/FPN en los túbulos renales controla la reabsorción de hierro y es importante para la homeostasis renal del hierro en ratones hembra
Primero buscamos establecer el sitio exacto de expresión de FPN en elriñón. Con ese fin, cotejamos riñones de ratón para FPN y marcadores específicos del segmento acuaporina 1 (un marcador de túbulos contorneados proximales y rama descendente delgada de Henley), acuaporina 2 (un marcador de conductos colectores y túbulos de conexión) y calbindina (un marcador de túbulos contorneados distales y conductos colectores y de conexión corticales). Encontramos que FPN se expresa fuertemente en la corteza, colocalizando con acuaporina 1 en los túbulos contorneados proximales. Había algo de FPN en la médula interna, que se colocalizaba con acuaporina 2 en los conductos colectores medulares. No hubo colocalización de FPN con calbindina (Figura 1a; panel más grande que se muestra en la Figura complementaria S2). Estos resultados confirman que la FPN es más abundante en la región cortical dentro de los túbulos contorneados proximales.
Para determinar si la FPN renal está regulada por HAMP, utilizamos ratones que albergaban un transgén knock-in Pax8.CreERT2þ, que impulsa la expresión inducible por tamoxifeno de la recombinasa Cre bajo el control del promotor pax8 del gen 8 de caja emparejada en los túbulos proximales y distales y en conductos colectores.17 Cruzamos ratones Pax8.CreERT2þ con los que albergaban un alelo flfloxed knock-in condicional FpnC326Y, que codifica una FPN resistente a la hepcidina. Además, y para confirmar el papel previamente informado de la FPN renal en la reabsorción de hierro, cruzamos ratones Pax8.CreERT2þ con ratones que albergaban el alelo Fpnflfl/flfl. Una semana después del tratamiento con tamoxifeno para inducir el transgén Pax8.CreERT2, los niveles de FPN renal aumentaron en ratones hembras y machos FpnC326Yflfl/ flfl ,Pax8.CreERT2þ en relación con los controles FpnC326Yflfl/flfl (Figura 1b), lo que demuestra que la FPN renal está sujeta a regulación por HAMP endógeno en condiciones fisiológicas normales, y además confirmando la eficacia del transgén Pax8.CreERT2þ. Por el contrario, los niveles renales de FPN se redujeron en ratones Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ hembras y machos en relación con los controles Fpnflfl/flfl, lo que confirma aún más la eficacia del transgén Pax8.CreERT2þ (Figura 1c). La especificidad de este transgén Pax8.CreERT2þ también fue confirmada por la presencia del alelo de deleción (DFpn) en elriñónpero no en el hígado o el bazo de ratones Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ (Figura complementaria S2A).
A continuación, nos propusimos determinar si el eje renal HAMP/FPN controla la reabsorción de hierro. Con ese fin, medimos los niveles de hierro sérico y renal a la semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses después del tratamiento con tamoxifeno. Encontramos que el hierro renal
el contenido fue menor en las hembras FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ que en las hembras control FpnC326Yflfl/flfl en todos los puntos temporales (Figura 1d). El contenido de hierro renal en los machos no fue diferente según el genotipo (Figura 1d). La tinción de hierro de Perl mejorada con DAB también confirmó la reducción en los niveles de hierro dentro de los túbulos proximales de las hembras FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ (Figura 1e; panel más grande que se muestra en la Figura complementaria S2). Por el contrario, encontramos que el contenido de hierro renal fue mayor en las hembras Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ que en las hembras control Fpnflfl/flfl a partir de 1 mes (Figura 1f). El contenido de hierro renal en los machos no fue diferente según el genotipo (Figura 1f). La tinción de hierro Perls mejorada con DAB también confirmó la acumulación de hierro dentro de los túbulos proximales de las hembras Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ (Figura 1g; panel más grande que se muestra en la Figura complementaria S2).
Los niveles de hierro en suero aumentaron transitoriamente en ratones FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ machos y hembras en relación con los controles FpnC326Yflfl/flfl en el 1-mes de tiempo (Figura 1h). Por el contrario, los niveles de hierro sérico se redujeron en las hembras Fpnflfl/ flfl, Pax8.CreERT2þ en relación con las hembras de control Fpnflfl/flfl en el punto temporal de 1-meses, mientras que permanecieron comparables en los machos de diferentes genotipos en todos los puntos temporales (Figura 1i ). La restauración de los niveles de hierro sérico a los observados en los animales de control a los 3 meses de edad no se puede atribuir a la restauración de los niveles normales de FPN renal. De hecho, los cambios inducidos por Pax8.CreERT2þ en los niveles de FPN renal aún se mantuvieron 3 meses después del tratamiento con tamoxifeno (Figuras complementarias S2B y C). La disminución del contenido de hierro renal y el aumento de los niveles de hierro sérico en hembras FpnC326Yflfl/ flfl ,Pax8.CreERT2þ demuestran que la reabsorción de hierro dependiente de FPN en los túbulos proximales está sujeta a la regulación por HAMP en condiciones fisiológicas normales. El aumento del contenido de hierro renal y la disminución de los niveles de hierro sérico en mujeres Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ confirman hallazgos previos de que la FPN renal contribuye a la reabsorción de hierro. Además, en condiciones fisiológicas normales, el control de la reabsorción de hierro por el eje renal HAMP/FPN parece ser más importante en mujeres que en hombres, al menos en la cepa C57BL/6.
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El eje renal HAMP/FPN contribuye, pero no es esencial, a la homeostasis sistémica normal del hierro en condiciones de disponibilidad normal de hierro.
A continuación, nos propusimos determinar la contribución del eje renal HAMP/FPN a la homeostasis del hierro sistémico. Encontramos que las hembras FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ tuvieron un aumento transitorio en la ferritina sérica (Figura 2a), el contenido de hierro en el hígado (Figura 2b) y el contenido de hierro en el bazo (Figura 2c) en el 1-mes de tiempo cuando en comparación con las hembras de control FpnC326Yflfl/flfl. Sus niveles de hemoglobina se mantuvieron comparables a los de los controles en todos los puntos de tiempo (Figura 2d). Ninguno de estos parámetros fue diferente entre los machos FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y sus controles FpnC326Yflfl/flfl (Figura 2a–d). Los niveles de eritroferrona no fueron diferentes según el genotipo (Figura 3A complementaria). Por el contrario, encontramos que las hembras Fpnflfl/ flfl ,Pax8.CreERT2þ tienen niveles más bajos de ferritina sérica en los puntos de tiempo 1- y 3-meses (Figura 2e), menor contenido de hierro hepático en el 3- y 6-meses (Figura 2f), y menor contenido de hierro en el bazo en los 1- y 3-meses (Figura 2g), en comparación con las hembras de control Fpnflfl/flfl. También tuvieron una reducción transitoria y leve en los niveles de hemoglobina en el punto de tiempo de 3-meses (Figura 2h). Ninguno de estos parámetros fue diferente entre los machos Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y sus controles Fpnflfl/flfl (Figura 2e-h). Los niveles de eritroferrona tampoco se alteraron según el genotipo (Figura 3B complementaria). Juntos, estos datos demuestran que, en condiciones fisiológicas normales, el eje renal HAMP/FPN contribuye a los niveles sistémicos de hierro, pero en sí mismo no es esencial para el mantenimiento de la homeostasis sistémica normal del hierro.
Figura 2|El eje del péptido antimicrobiano de la hepcidina renal/ferroportina (FPN) contribuye, pero no es esencial, al funcionamiento sistémico normal.homeostasis del hierro en condiciones de disponibilidad normal de hierro. (anuncio)Índices de hierro sistémico en ratones FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ machos y hembras y controles FpnC326Yflfl/flfl 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses después del tratamiento con tamoxifeno, incluidos (a) ferritina sérica, (b) contenido de hierro en el hígado , (c) contenido de hierro del bazo, y (d) hemoglobina. (e-h) Índices de hierro sistémico en ratones Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ machos y hembras y controles Fpnflfl/flfl 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses después de la inducción con tamoxifeno, incluida (e) ferritina sérica, ( f) contenido de hierro en el hígado, (g) contenido de hierro en el bazo y (h) hemoglobina. Los valores se muestran como SEM medio. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01="" y="" ***p="">< 0.001.="" ppm,="" partes="" por="">
Figura 3|El eje del péptido antimicrobiano hepcidina renal (HAMP)/ferroportina (FPN) determina la magnitud de la sobrecarga de hierro renal y sistémica en condiciones de disponibilidad excesiva de hierro. (a–f)Los índices de hierro extrarrenales en ratones hembra y macho FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y controles FpnC326Yflfl/flfl proporcionaron una dieta de control (200 partes por millón [ppm]) o una dieta cargada de hierro (5000 ppm) durante 3 meses. (Continuado)
Figura 3 |(Continuación) Los índices incluyen (a) hierro sérico, (b) ferritina sérica, (c) contenido de hierro en el bazo, (d) contenido de hierro en el corazón, (e) contenido de hierro en los pulmones y (f) contenido de hierro en el hígado. (g) Contenido de hierro renal en ratones hembra y macho FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y controles FpnC326Yflfl/flfl provistos de una dieta de control (200 ppm) o unacargado de hierrodieta (5000 ppm) durante 3 meses. ( h, i ) Imágenes representativas de la tinción de hierro de Perls mejorada con diaminobencidina (DAB) en hígados y la región crítica renal de los animales correspondientes. Barras ¼ 200 mm, aumento original 10. (j) Expresión relativa del gen hamp en los hígados de los animales correspondientes. Los valores se muestran como SEM medio. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001,="" *****p="">< 0,00001="" y="" ******p="">< 0,000001.="" para="" optimizar="" la="" visualización="" de="" esta="" imagen,="" consulte="" la="" versión="" en="" línea="" de="" este="" artículo="" en="">
El eje renal HAMP/FPN determina la magnitud de la sobrecarga de hierro renal y sistémica en condiciones de exceso de disponibilidad de hierro
A continuación, nos propusimos determinar el papel del eje renal HAMP/FPN en el contexto de la sobrecarga de hierro. A tal efecto, los animales FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y los controles FpnC326Yflfl/flfl se indujeron con tamoxifeno y luego se les proporcionó una dieta de control con 200 ppm de hierro o una dieta cargada de hierro con 5000 ppm de hierro durante 3 meses. . Encontramos que la provisión de una dieta cargada de hierro aumentó el hierro sérico, la ferritina sérica y el contenido de hierro tisular en machos y hembras de ambos genotipos. Sin embargo, los animales FpnC326Yflfl/ flfl ,Pax8.CreERT2þ tuvieron un mayor aumento en el hierro sérico (Figura 3a), ferritina sérica (Figura 3b) y contenido de hierro en el bazo (Figura 3c), corazón (Figura 3d), pulmón (Figura 3e) , e hígado (Figura 3f) que los controles FpnC326Yflfl/flfl. Por el contrario, tenían un menor aumento en el contenido de hierro renal (Figura 3g). Las diferencias entre los genotipos en el grado de carga de hierro dentro de los túbulos proximales y en el hígado también fueron evidentes en la tinción de hierro Perls mejorada con DAB (Figura 3h e i; paneles más grandes que se muestran en la Figura complementaria S4). En línea con una mayor sobrecarga sistémica de hierro, los animales FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ también tuvieron un mayor aumento en la expresión del gen hamp hepático en comparación con los controles FpnC326Yflfl/flfl (Figura 3j). Los niveles de hemoglobina no se vieron afectados ni por la dieta ni por el genotipo y, de acuerdo con esto, los niveles de eritroferrona sérica tampoco se modificaron (Figuras complementarias 4A y B). Estos hallazgos demuestran que, en condiciones de exceso de disponibilidad de hierro, el control de la reabsorción de hierro por el eje renal HAMP/FPN disminuye la sobrecarga sistémica de hierro mientras aumenta la sobrecarga renal de hierro.
El eje renal HAMP/FPN determina el patrón de sobrecarga tisular de hierro en la hemocromatosis
A continuación, nos propusimos explorar el papel del eje renal HAMP/FPN en el contexto de la hemocromatosis hereditaria, una condición genética de sobrecarga de hierro causada por defectos en la producción de hepcidina o en la capacidad de respuesta a la hepcidina.19 casa que alberga un knock-in ubicuo heterocigoto del alelo fpnC326Y (Fpnwt/C326Y). Anteriormente habíamos demostrado que estos ratones desarrollan el fenotipo de sobrecarga de hierro característico de la hemocromatosis hereditaria.15,18 Comparamos el patrón de tejidosobrecarga de hierroen estos ratones con la observada en ratones de tipo salvaje alimentados con una dieta cargada de hierro desde el destete durante 3 meses. Tanto los ratones Fpnwt/C326Y como los ratones de tipo salvaje alimentados con una dieta cargada de hierro tenían
aumento del contenido de hierro en el hígado, el corazón y los pulmones en comparación con sus respectivos controles (Figuras 4a yb). El contenido de hierro renal en los ratones Fpnwt/C326Y fue normal a los 3 meses de edad (Figura 4a) y solo aumentó un 32 % en relación con los controles a los 6 meses de edad (Figura 5A complementaria). Por el contrario, los animales de tipo salvaje que recibieron una dieta cargada de hierro tuvieron un aumento del 260 por ciento en el contenido de hierro renal en comparación con los que tenían una dieta normal (Figura 4b). Las diferencias relativas en la sobrecarga de hierro renal y hepática entre los 2 modelos también fueron evidentes en la tinción de hierro Perls mejorada con DAB (Figura 4c yd; paneles más grandes que se muestran en la Figura complementaria S5). La magnitud de la sobrecarga de hierro extrarrenal fue comparable entre los 2 modelos, mientras que la magnitud de la sobrecarga renal fue considerablemente mayor en los animales de tipo salvaje que recibieron una dieta rica en hierro que en los ratones Fpnwt/C326Y (Figura 4e). FPN aumentó en la corteza tanto en ratones Fpnwt / C326Y como en ratones de tipo salvaje que recibieron una dieta cargada de hierro (Figura 4f y g; los paneles más grandes se muestran en la Figura complementaria S5). Un examen más detenido del sitio de expresión de FPN en los túbulos proximales reveló que parecía localizarse intracelularmente así como en la membrana basolateral en ratones Fpnwt/C326Y. Por el contrario, FPN parecía localizarse principalmente en el citoplasma, la membrana apical y, sorprendentemente, el núcleo en ratones proporcionó una dieta cargada de hierro (Figura 4f y g, paneles inferiores). El patrón de localización de FPN que surge de la provisión de una dieta cargada de hierro se confirmó aún más utilizando animales Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ como controles negativos (Figura complementaria S5B). Estas observaciones, junto con el hallazgo anterior de que los animales FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ tienen una carga renal de hierro más baja que los controles después de la provisión de uncargado de hierrodieta, demuestran que la pérdida de la acción de HAMP en FPN renal protege elriñónde la carga de hierro en el marco de la hemocromatosis hereditaria.
DISCUSIÓN
El hallazgo más importante del presente estudio es que el HAMP endógeno controla la reabsorción de hierro mediada por FPN. Estudios previos habían reportado la regulación de FPN por HAMP exógeno en células renales cultivadas, y una relación inversa entre los niveles de HAMP y FPN en elriñóndespués de la oclusión unilateral del uréter. 12,13 Sin embargo, esta es la primera demostración de que dicha regulación opera in vivo en condiciones fisiológicas normales y de una manera que afecta la homeostasis renal y sistémica del hierro. Una fortaleza particular de este estudio es el uso de ratones novedosos, generados internamente, para albergar una pérdida renal específica de la capacidad de respuesta HAMP. Este enfoque permite el estudio del eje renal HAMP/FPN sin los efectos de confusión de la homeostasis sistémica alterada del hierro, que de otro modo se observa en modelos animales ubicuos.
Figura 4|El péptido antimicrobiano hepcidina renal/ferroportina (FPN) determina el patrón de sobrecarga tisular de hierro en la hemocromatosis. (a)Niveles de hierro en riñón, hígado, corazón y pulmón de animales Fpnwt/C326Y y controles Fpnwt/wt a los 3 meses de edad. (b) Los niveles de hierro en elriñón, hígado, corazón y pulmón en animales de tipo salvaje que recibieron una dieta de control (200 partes por millón [ppm]) o una dieta cargada de hierro (5{{4{{ 42}}}}00 ppm) desde el destete durante 3 meses. (c) Imágenes representativas de tinción de hierro Perls mejorada con diaminobencidina (DAB) en la corteza renal y el hígado de animales Fpnwt/C326Y y controles Fpnwt/wt a los 3 meses de edad. Barra ¼ 200 mm, aumento original10. ( d ) Las imágenes representativas de la tinción de hierro Perls mejorada con DAB en la corteza renal y los hígados de animales de tipo salvaje proporcionaron una dieta de control (200 ppm) o una dieta cargada de hierro (5000 ppm) desde el destete durante 3 meses. Barra ¼ 200 mm, aumento original 10. (e) Comparación del grado de carga de hierro tisular entre animales Fpnwt/C326Y y animales de tipo salvaje alimentados con una dieta cargada de hierro. Los valores mostrados para cada animal están normalizados a la media del grupo de control respectivo. (f) Imágenes representativas de tinción inmunofluorescente FPN en la corteza renal de animales Fpnwt/C326Y y controles Fpnwt/wt a los 3 meses de edad. Panel superior, barras ¼ 200 mm, aumento original 10. Panel inferior, barra ¼ 25 mm, aumento original 60. (g) Imágenes representativas de tinción inmunofluorescente de FPN en la corteza renal de animales de tipo salvaje que recibieron una dieta de control (200 ppm) o una dieta cargada de hierro (5000 ppm) desde el destete hasta los 3 meses. Panel superior, barras ¼ 200 mm, aumento original 10. Panel inferior, barra ¼ 25 mm, aumento original 60. Los valores se muestran como media SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" y="" ****p="">< 0,0001.="" para="" optimizar="" la="" visualización="" de="" esta="" imagen,="" consulte="" la="" versión="" en="" línea="" de="" este="" artículo="" en="">
El segundo hallazgo importante del presente estudio es que el HAMP/FPN renal determina la magnitud de la sobrecarga de hierro tanto renal como sistémica (Figura 5). De hecho, la pérdida de la capacidad de respuesta de HAMP en los túbulos renales aumentó la magnitud de la sobrecarga de hierro en el hígado, el bazo, el corazón y los pulmones, mientras que redujo la magnitud de la sobrecarga de hierro renal después de la provisión de una dieta cargada de hierro. De acuerdo con esto, se observó una mayor sobrecarga renal de hierro después de la provisión de una dieta cargada de hierro a animales de tipo salvaje (en los que el eje renal HAMP/FPN está intacto) que en ratones con hemocromatosis (en los que el eje renal HAMP/FPN también está intacto). interrumpido) (resumen gráfico). Este hallazgo puede explicar la observación clínica de que elriñónno se ve comúnmente afectado en pacientes con hemocromatosis hereditaria.19
Figura 5|El papel del eje del péptido antimicrobiano hepcidina renal (HAMP) / ferroportina (FPN) en el contexto de la sobrecarga de hierro.La provisión de una dieta cargada de hierro aumenta la disponibilidad de hierro sérico y los niveles de hierro en el filtrado glomerular y aumenta la producción y liberación de hepcidina (HAMP) por el hígado. El aumento de HAMP en suero inhibe la reabsorción de hierro al bloquear la FPN en los túbulos renales. La inhibición de la reabsorción de hierro provoca la retención renal de hierro al tiempo que disminuye la disponibilidad de hierro sistémico y, en consecuencia, reduce la sobrecarga de hierro en el hígado. En ratones FpnC3326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ, la pérdida de capacidad de respuesta HAMP en los túbulos renales provoca una reabsorción de hierro no regulada. Esto, a su vez, previene la retención renal de hierro al tiempo que aumenta la disponibilidad de hierro sistémico y, posteriormente, aumenta la sobrecarga de hierro en el hígado.
Aunque tanto la hemocromatosis como la sobrecarga de hierro de la dieta aumentaron la FPN en los túbulos renales, parecieron dar como resultado diferentes patrones de localización en los compartimentos apical, intracelular o basolateral. Se hicieron observaciones similares en el duodeno de rata, donde se encontró que la alimentación forzada de hierro alteraba la distribución relativa de FPN entre estos compartimentos en los enterocitos duodenales. proteínas reguladoras de hierro) actuarían para mantener una producción general alta de FPN en la célula tubular renal, mientras que el aumento de HAMP en suero reduciría la proporción de FPN que puede localizarse en la membrana basolateral. De esta interpretación se deduce que la divergencia entre informes previos en cuanto a la localización de FPN en los túbulos proximales podría reflejar diferencias en el contenido de hierro tubular renal y en los niveles de hepcidina sérica entre los modelos animales utilizados en diferentes estudios.5,11–14,21 Alternativamente, esta divergencia podría reflejar un grado de reactividad no específica informado previamente en relación con los anticuerpos comerciales de FPN, incluido el utilizado en el presente estudio. en la excreción urinaria de hierro en ratones cargados de hierro (Figura complementaria 5C). Otra observación interesante es que algunos FPN aparecieron localizados en el núcleo de los túbulos renales de ratones cargados con hierro. Otros hicieron observaciones similares en macrófagos cargados de hierro y en el hígado de rata. El último estudio encontró que la FPN nuclear está involucrada en la retención de hierro nuclear como parte de la respuesta de fase aguda.22,23 Se necesitan estudios detallados de la localización subcelular de FPN en diferentes estados de hierro y en diferentes patologías para avanzar en nuestra comprensión del papel. de FPN en el riñón.
La regulación y función del HAMP renal tampoco se entienden completamente. Descubrimos que la expresión del gen hamp en el riñón aumentó en animales de tipo salvaje después de la provisión de una dieta cargada de hierro (Figura 5E complementaria), pero permaneció inalterada en ratones con hemocromatosis (Figura 5D complementaria) y en aquellos que albergan túbulo renal. pérdida específica de FPN o pérdida específica del túbulo renal de la capacidad de respuesta HAMP (Figura complementaria S5F y G). Estos resultados no respaldan la idea de que la expresión del gen hamp renal esté regulada localmente por los niveles de hierro renal. En cuanto a la función del HAMP renal, un estudio previo en un modelo de oclusión de uréter unilateral sugirió que está involucrado en el control de la FPN renal. Encontramos que HAMP renal (detectado usando un anticuerpo contra el péptido pro-HAMP) colocalizado con calbindina (un marcador de túbulos contorneados distales y conductos colectores corticales y conductos de conexión) (Figura complementaria S5H). Por otro lado, la expresión de FPN no se colocaliza con calbindina, incluso en ratones que albergan una pérdida renal específica de la capacidad de respuesta de HAMP (Figura 1a y Figura complementaria S5I). Estos resultados no son consistentes con un papel autocrino del HAMP renal en la regulación de la FPN renal. No obstante, HAMP renal puede estar involucrado en la regulación paracrina de FPN renal. En el futuro, sería interesante estudiar las funciones paracrinas de los HAMP renales y cuantificar las contribuciones relativas de los HAMP renales y hepáticos al control de la reabsorción de hierro.
Otra observación interesante del presente estudio es que, en condiciones de disponibilidad normal de hierro, el eje renal HAMP/FPN no es esencial para el mantenimiento de la homeostasis sistémica normal del hierro y, en cambio, es más importante para regular los niveles renales de hierro, al menos en ratones hembra de la cepa C57BL/6. De hecho, aunque los cambios observados en los niveles de hierro renal resultantes de la pérdida de FPN o de la capacidad de respuesta de HAMP en los túbulos renales fueron persistentes, los cambios en los índices de hierro sistémico fueron de naturaleza transitoria. La naturaleza transitoria de los efectos sistémicos sugiere la participación de mecanismos compensatorios. Un posible mecanismo compensatorio es la modulación de la absorción de hierro de la dieta por HAMP hepático. De hecho, descubrimos que en ratones que albergaban una pérdida renal específica de la capacidad de respuesta de HAMP, la expresión del gen hamp hepático aumentó luego del aumento en los niveles de hierro sérico en el punto de tiempo 1-mes y permaneció aumentada en puntos de tiempo posteriores. Por el contrario, la expresión del gen hamp hepático se suprimió en ratones que albergaban una pérdida renal específica de FPN luego de la disminución de los niveles de hierro sérico en el punto de tiempo de 1- meses y permaneció suprimida en puntos de tiempo posteriores (Figura complementaria S6A y B). Además, el aumento de la expresión del gen hamp hepático en el primer entorno se acompañó de una disminución de los niveles de FPN intestinal, mientras que la disminución de la expresión del gen hamp hepático en el segundo entorno se acompañó de un mayor FPN intestinal (Figura complementaria S6C y D). Estos resultados indican que la acción del HAMP hepático sobre la absorción de hierro de la dieta es un mecanismo compensatorio activo implicado en el mantenimiento de la homeostasis sistémica normal del hierro frente a la reabsorción renal de hierro alterada.
Cistanche puede reparar la función renal
Cabe señalar que, en condiciones de disponibilidad normal de hierro, el eje renal HAMP/FPN parece ser más importante en ratones hembra que en ratones macho, al menos en la cepa C57BL/6. Esta observación no pudo atribuirse a las diferencias entre machos y hembras en la actividad del transgén Pax8.CreERT2þ. El dimorfismo sexual en los niveles y patrones de los transportadores a lo largo de la nefrona se informó previamente en esta cepa de ratón.24 De acuerdo con esto, encontramos una mayor expresión basal de FPN en elriñonesde hembras que en los riñones de compañeros de camada machos (Figura complementaria S2D). Un estudio anterior que utilizó un transgén de recombinasa Cre diferente, impulsado por un promotor Nestin constitutivamente activo para eliminar fpn en toda la nefrona, también informó un aumento en los niveles de hierro renal y una disminución en las reservas de hierro sérico y hepático. Sin embargo, ese estudio se realizó en una cepa de ratón diferente (129/SvEvTac) y no analizó el fenotipo según el sexo o la evolución temporal.14
hemocromatosis y otros trastornos del hierro.
DIVULGACIÓN
Todos los autores declararon no tener intereses en conflicto.
AGRADECIMIENTOS
SL-L recibió una beca postdoctoral en ciencias básicas intermedias de la Fundación Británica del Corazón (FS/12/63/29895). GM fue financiado por unProyecto Kidney Research del Reino Unidosubvención (RP_020_20160303) otorgada a SL-L.
CONTRIBUCIONES DE AUTOR
SL-L estudio concebido. SL-L y GM realizaron experimentos. SL-L analizó e interpretó los resultados. SL-L escribió el manuscrito. AM contribuyó con materiales. PAR comentó sobre el manuscrito.
MATERIAL SUPLEMENTARIO
Archivo complementario (PDF)
Figura S1. Confirmación de especificidad de anticuerpos FPN y HAMP. (A) Imágenes representativas de tinción inmunofluorescente FPN en la corteza renal de animales Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y controles Fpnflfl/flfl a los 3 meses de edad. Paneles superiores, barra ¼ 200 mm, aumento original 10. Paneles inferiores, barra ¼ 25 mm, aumento original 60. (B) Imágenes representativas de la tinción inmunofluorescente HAMP en la corteza renal de animales Hamp–/– y controles de tipo salvaje en 3 meses de edad. Paneles superiores, barra ¼ 200 mm, aumento original 10. Paneles inferiores, barra ¼ 25 mm, aumento original 60.
Figura S2. Confirmación de actividad y especificidad de Pax8.CreERT2þ. (A) Genotipado de ratones Fpnflfl/flfl y Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ usando ADN genómico extraído del hígado, bazo yriñón1 semana después de la inducción con tamoxifeno. (B) Western blot para FPN enriñonesde ratones hembra y macho FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ y controles FpnC326Y 3 meses después del tratamiento con tamoxifeno. Cuantificación de la intensidad de la señal que se muestra en el panel inferior. (C) Western blot para FPN en riñones de ratones hembra y macho Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y controles Fpnflfl/flfl 3 meses después del tratamiento con tamoxifeno. Cuantificación de la intensidad de la señal que se muestra en el panel inferior. (D) Western blot para FPN en riñones de hembras y machos de camada de tipo salvaje a los 3 meses de edad. Cuantificación de la intensidad de la señal que se muestra en el panel inferior. (E–G) Versiones más grandes de los paneles en la Figura 1a, g y e, respectivamente. Los valores se muestran como SEM medio. *P < 0.05,="" ***p=""><>
Figura S3. Los niveles séricos de eritroferrona no se alteran en los ratones FpnC326Yflfl/flfl Pax8.CreERT2þ y Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2. (A) Niveles de eritroferrona en suero en ratones hembra y macho FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y controles FpnC326Yflfl/flfl 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses después del tratamiento con tamoxifeno. (B) Niveles de eritroferrona en suero en ratones Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ machos y hembras y controles Fpnflfl/flfl 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses después de la inducción con tamoxifeno. Los valores se muestran como SEM medio.
Figura S4. Los niveles de hemoglobina y eritroferrona sérica no se alteran en FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ alimentados con una dieta rica en hierro. (A) Niveles de hemoglobina en ratones hembra y macho FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y controles FpnC326Yflfl/flfl alimentados con una dieta de control (que contiene 200 ppm de hierro) o una dieta cargada de hierro (que contiene 5000 ppm de hierro) desde el destete durante 3 meses . (B) Niveles séricos de eritroferrona en ratones hembra y macho FpnC326Yflfl/ flfl, Pax8.CreERT2þ y controles FpnC326Yflfl/flfl alimentados con una dieta de control (que contiene 200 ppm de hierro) o unadieta cargada de hierro(que contiene 5000 ppm de hierro) desde el destete durante 3 meses. Los valores se muestran como SEM medio. (C, D) Versiones más grandes de paneles en la Figura 3h y i, respectivamente.
Figura S5. Manejo de hierro renal y expresión de hamp renal en los diferentes modelos de ratón. (A) Niveles de hierro renal en animales Fpnwt/C326Y y controles Fpnwt/wt a los 6 meses de edad. (B) Imágenes representativas de la tinción inmunofluorescente de FPN y AQP1 en la corteza renal de animales Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y controles Fpnflfl/flfl alimentados con una dieta cargada de hierro que contenía 5000 ppm desde el destete durante 3 meses. Barra ¼ 25 mm, aumento original 60. (C) Niveles de hierro urinario (normalizados a creatinina urinaria) en animales de tipo salvaje alimentados con una dieta rica en hierro que contenía 5000 ppm de hierro o una dieta de control que contenía 200 ppm de hierro desde el destete durante 3 meses. (D) Expresión del gen hamp renal en animales Fpnwt/C326Y y controles Fpnwt/wt a los 3 meses de edad. (E) Expresión del gen hamp renal en animales de tipo salvaje alimentados con una dieta cargada de hierro que contenía 5000 ppm de hierro o una dieta de control que contenía 200 ppm de hierro desde el destete durante 3 meses. (F) Expresión del gen hamp renal en ratones hembra y macho FpnC326Yflflflfl, Pax8.CreERT2þ y controles FpnC326Yflflflfl 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses después del tratamiento con tamoxifeno. (G) Expresión del gen hamp renal en ratones Fpnflflflfl,Pax8.CreERT2þ machos y hembras y controles Fpnflfl/flfl 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses después de la inducción con tamoxifeno. (H) Imágenes representativas de la tinción inmunofluorescente de HAMP y CalD en la corteza renal de animales de tipo salvaje a los 3 meses de edad. Barra ¼ 25 mm, aumento original 60. (I) Imágenes representativas de la tinción inmunofluorescente de FPN y CalD en la corteza renal de animales FpnC326Yflfl/ flfl ,Pax8.CreERT2þ de 1 mes de edad. Barra ¼ 25 mm, aumento original 60. (J–M) Versiones más grandes de los paneles en la Figura 4c, d, f y g, respectivamente. Los valores se muestran como SEM medio. *P <>
Figura S6. La expresión del gen hamp hepático y los niveles intestinales de FPN están alterados en ratones con inactivación específica del túbulo renal de fpn y en ratones con inactivación específica del túbulo renal de fpnC326Y. (A) Expresión relativa del ARNm de hamp en hígados de ratones hembra FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ y controles FpnC326Yflfl/flfl 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses después del tratamiento con tamoxifeno. (B) Expresión relativa de ARNm de hamp en hígados de ratones hembra Fpnflflflfl,Pax8.CreERT2þ y controles Fpnflfl/flfl 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses después del tratamiento con tamoxifeno. (C) Imágenes representativas de la inmunotinción de FPN en el intestino de ratones hembra FpnC326Y flflflfl,Pax8.CreERT2þ y controles FpnC326Yflfl/flfl 1 mes después del tratamiento con tamoxifeno. Barra ¼ 200 mm, aumento original10. (D) Imágenes representativas de la inmunotinción de FPN en el intestino de ratones hembra Fpnflflflfl,Pax8.CreERT2þ y controles Fpnflfl/flfl 1 mes después del tratamiento con tamoxifeno. Barra ¼ 200 mm, aumento original 10. Los valores se muestran como SEM medio. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" y=""><>
Cistanche puede aliviar la infección renal
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