Arquitectura tridimensional de las nefronas en el riñón normal y quístico

Contacto: emily.li@wecistanche.com

Thomas Blanc1,2,7 , Nicolas Goudin3,7 , Mohamad Zaidan1,4,7 , Meriem Garfa Traore3 , Frank Bienaime1,5, Lisa Turinsky1 , Serge Garbay1 , Cle´ment Nguyen1 , Martine Burtin1 , Ge´rard Friedlander1,6 , Fabiola Terzi1,8 y Marco Pontoglio1,8

Cistanche es bueno para el riñón

PALABRAS CLAVE: enfermedad renal quística; riñón; nefrona; nefronoptisis;limpieza de tejidos

La función renal depende de manera crucial de la compleja estructura tridimensional de las nefronas. Cualquier distorsión de su forma puede dar lugar adisfunción renal. Los métodos histológicos tradicionales presentan importantes limitaciones para la reconstrucción tridimensional de tejidos. Aquí, combinamos limpieza de tejido, microscopía multifotónica y rastreo digital para la reconstrucción de nefronas individuales en condiciones fisiológicas y patológicas. Conjuntos denefronasse identificaron diferentes en ubicación, forma y tamaño según su función. Curiosamente, las nefronas tienden a estar en planos. Cuando esta técnica se aplicó a un modelo deenfermedad renal quística, se encontró que los quistes se desarrollaban solo en segmentos de nefrona específicos. A lo largo del mismo segmento, los quistes son contiguos dentro de los túbulos normales no dilatados. Además, las formas de los quistes variaron según el segmento de la nefrona. Por lo tanto, nuestros hallazgos brindan una estrategia valiosa para visualizar la estructura compleja de los riñones a nivel de una sola nefrona y, lo que es más importante, brindan una base para comprender procesos patológicos como la cistogénesis.

Declaración de traducción

Los métodos de limpieza proporcionan una herramienta única para comprender cómo los cambios morfológicos conducen a consecuencias patológicas. Los riñones son órganos críticos que mantienen la homeostasis del cuerpo a través del manejo de agua, metabolitos y electrolitos, que dependen de manera crucial de la compleja 3-estructura dimensional de las nefronas. Cuando esta organización estructural se altera, se produce la fisiopatología renal. En el presente estudio, hemos desarrollado un poderoso método basado en la limpieza óptica,

microscopía multifotónica y rastreo digital para estudiar el riñón a nivel de una sola nefrona en condiciones fisiológicas y patológicas. En particular, proporcionamos la primera 3-reconstrucción dimensional de un riñón poliquístico a escala de nefronas individuales. Este método se puede aplicar a varios contextos patológicos, lo que nos permite comprender mejor el complejo proceso de deterioro renal y, en consecuencia, desarrollar estrategias terapéuticas más específicas.

El riñón mantiene la homeostasis corporal a través de su compleja estructura de nefrona 3-dimensional (3D). Cuando esta organización estructural se altera, se produce la fisiopatología renal.enfermedades renales cronicasse caracterizan por el desarrollo de lesiones renales. Curiosamente, los patólogos han informado una amplia heterogeneidad en la distribución de las lesiones durante las enfermedades renales crónicas.1,2 Ya sea que esto refleje el hecho de que los segmentos específicos de las nefronas pueden dañarse de manera diferente o, alternativamente, que algunas nefronas tienen diferentes susceptibilidades a lesionarse en su conjunto. , es desconocido. Para abordar este problema, es obligatorio reconstruir la forma 3D de las nefronas en contextos patológicos.

A nuestro conocimiento,nefronassolo se han reconstruido por completo mediante cortes en serie en 2D.3–5 Aunque el corte histológico estándar proporciona alta resolución, las reconstrucciones en 3D son laboriosas y difíciles de obtener. Esto se debe principalmente a las distorsiones mecánicas, que es un efecto ineludible del procedimiento de corte. Además, la reconstrucción 3D a partir de imágenes 2D no permite obtener imágenes directas de estructuras 3D en tejidos montados en su totalidad.

La microscopía multifotónica ha mejorado nuestra capacidad para detectar cambios morfológicos en secciones gruesas. Sin embargo, una limitación importante es la poca profundidad accesible debido a la dispersión de la luz. Al minimizar las diferencias del índice de refracción, los agentes de limpieza han mejorado drásticamente la capacidad de obtener imágenes de profundidades.6,7 A pesar de que el primer agente de limpieza se introdujo hace un siglo,8 solo recientemente se han desarrollado varios protocolos de limpieza, principalmente para el cerebro. .9–17 Estudios recientes han demostrado su potencial para obtener imágenes de otros órganos sólidos, como el hígado, el páncreas o el riñón.18–26

cistanche para la enfermedad renal

Poliquistico enfermedad en los riñones, un trastorno genéticamente heterogéneo que involucra mutaciones en varios genes ciliares, es la enfermedad renal hereditaria más común.27,28 La enfermedad renal poliquística se caracteriza por el desarrollo de quistes que conducen a la destrucción completa del riñón.28 desarrollar como un "empuje hacia afuera" de un segmento de nefrona, como en poliquístico autosómico dominanteenfermedad del riñon; como expansión ectásica de los conductos colectores (CD), como en poliquistosis autosómica recesivaenfermedad del riñon; o exclusivamente en túbulos medulares, como en la nefronoptisis (NPHP)27,29. Sin embargo, aún se desconoce cómo se desarrollan los quistes en 3D y se organizan entre sí y con los túbulos vecinos normales.

Aquí, combinamos la limpieza óptica con la microscopía multifotónica para proporcionar nuevos conocimientos sobre cómonefronasse forman y organizan en condiciones fisiológicas y cómo se modifican durante la enfermedad, como la cistogénesis. Nuestros resultados demuestran que hay 3 tipos de nefronas y que los vasos pueden influir en la organización espacial de las nefronas. Curiosamente, observamos que las nefronas tienden a ubicarse en planos específicos. Inesperadamente, cuando aplicamos esta técnica a ratones jck, observamos que los quistes se desarrollaron solo en segmentos específicos de nefrona con quistes fusiformes entremezclados con túbulos normales.

RESULTADOS

Configuración experimental

Para estudiar la forma de todonefronasen relación con su entorno, adoptamos una técnica basada en limpieza óptica y microscopía multifotónica (Figura complementaria S1A). Al comparar diferentes protocolos de limpieza óptica, determinamos que para el riñón, el alcohol bencílico/benzoato de bencilo (BABB) era el más apropiado en términos de eficacia (Figura complementaria S1B y C y Tabla complementaria S1).

La reconstrucción 3D y el rastreo digital requieren imágenes de alta calidad con alta resolución y una alta relación señal-fondo. Observamos que la señal óptica proporcionada por la fluorescencia nativa no era uniforme en las secciones de riñón. En particular, las imágenes de la médula tenían un contraste deficiente con una baja relación señal-fondo (Figura complementaria S2). Para mejorar la relación señal-fondo, teñimos secciones con ácido peryódico de Schiff (Figura complementaria S1D), porque notamos empíricamente que esta tinción dio lugar a un alto contraste en secciones delgadas durante 2-fluorescencia de fotones. Sin embargo, la señal no fue uniforme en todas las secciones de riñón gruesas teñidas con ácido peryódico de Schiff (Figura complementaria S1E). Por lo tanto, tiñemos secciones de riñón con lectinas acopladas con flfluorocromo: aglutinina de maní y aglutinina de germen de trigo, que tiñen los glomérulos y los túbulos, y aglutinina de Griffonia simplicifolia, que marca los vasos sanguíneos.30 Sorprendentemente, con la combinación de estas lectinas, la señal a- relación de fondo se incrementó dramáticamente en su totalidadsecciones de riñón, con una mejora significativa tanto en el plano xy como en el eje z (Figura complementaria S1E y Película complementaria S1).

Visualización de segmentos de nefrona en 3D

Para visualizar la forma de las nefronas completas, trazamos sus caminos, comenzando en el polo urinario del glomérulo y terminando en la unión CD (Película complementaria S2). A pesar del hecho de que las lectinas utilizadas se unen globalmente a todos los segmentos de la nefrona, notamos que cuando se inspeccionaron cuidadosamente, estas lectinas se caracterizaron por un patrón específico en la forma en que tiñeron las membranas basales o luminales en los diferentes segmentos de la nefrona. En otras palabras, aprovechamos el patrón estereotípico de tinción de lectina para identificar los diferentes segmentos de nefrona. De esta forma, podríamos identificar fácilmente 6 entidades: túbulo proximal (PT), rama delgada (TL) del asa de Henle (HL), rama ascendente gruesa (TAL) del HL, túbulo contorneado distal (DCT), túbulo conector (CNT ), y CD. La transición entre PT y TL se caracterizó por la pérdida repentina de la señal típica del borde en cepillo de PT y por la disminución del ancho del lumen, que estaba casi virtualmente ausente en TL (Figura 1a). Por el contrario, la transición entre TL y TAL se caracterizó por un aumento significativo en el diámetro tubular externo y un ancho de luz relativamente constante (Figura 1b). En todonefronas, la transición de TAL a DCT se encontró sistemáticamente en el polo vascular del glomérulo. Esta transición se caracterizó por un aumento repentino del diámetro tubular externo que se debió predominantemente a un aumento significativo en el diámetro de la luz (Figura 1c). La transición entre DCT y CNT se caracterizó por una reducción tanto en el diámetro tubular como en la luz (Figura 1d). Finalmente, la conexión entre CNT y CD cortical se caracterizó por un aumento repentino tanto en el diámetro tubular como en la luz (Figura 1e). La cuantificación de estas transiciones morfológicas fue estadísticamente significativa (Figura 1f), y su pertinencia se verificó con tinción con marcadores tubulares específicos (Figuras complementarias S3-S5 y Película complementaria S3-S5).

La forma y el tamaño de los PT difieren según su profundidad.

La tinción de espesorsecciones de riñónnos permitió rastrear las coordenadas de la evolución espacial de segmentos completos de PT. Curiosamente, descubrimos que su forma era extremadamente variable y estaba determinada por la posición de sus glomérulos en la corteza. Globalmente, identificamos 3 patrones. El primer cor respondió a las nefronas más superficiales (SN) (Figura 2a; Película complementaria S6), que ocuparon la parte más externa de la corteza (el 30 por ciento más externo cerca de la cápsula renal). Sus partes enrevesadas formaron estructuras compactas con solo 6 a 7 circunvoluciones alrededor de su propio glomérulo, ocupando espacios muy pequeños y apretados. La convolución de estos SN terminaba en una pars recta larga y recta que descendía hacia la médula. En el extremo opuesto de este espectro, observamos un segundo patrón denefronasubicado en la parte más profunda de la corteza (40 por ciento más de profundidad interna), junto a la médula (nefronas yuxtamedulares [JN]) (Figura 2a; Figura complementaria S6 y Película complementaria S6). Sus TP se caracterizaban por un bucle corto inicial que descendía sistemáticamente hacia la papila y luego giraba en U para ascender hacia la cápsula renal. En contraste con los SN, los túbulos contorneados proximales de JN se caracterizaron por grandes espirales que evolucionaron alrededor de su propio glomérulo y ocuparon dominios grandes y poco empaquetados en la corteza yuxtamedular. La parte contorneada del PT de JNs tenía de 10 a 15 convoluciones, formando grandes dominios. Finalmente, el tercer patrón incluía nefronas ubicadas en la porción media de la corteza (nefronas medias [MN]) (Figura 2a; Película complementaria S6). Curiosamente, estos túbulos tenían una forma y una orientación espacial que representaban una transición entre SN y JN. De hecho, contenían de 8 a 9 circunvo luciones con bobinas que eran más grandes que las SN, pero más pequeñas que las JN. Además, los MN tenían pars recta más largos que los JN. Curiosamente, una comparación global de las formas de los PT mostró que los SN y MN tenían un patrón homogéneo, mientras que los JN eran extremadamente heterogéneos (Figura complementaria S6). Además, la reconstrucción espacial de varias nefronas reveló que los PT nunca se entremezclan (Película complementaria S6), lo que indica que cada nefrona ocupa su propio espacio individual en la corteza.

Los análisis morfométricos confirmaron las grandes diferencias en el tamaño y forma de los SN y JN, con un aspecto intermedio para los MN. El PT de los JN fue más de 2-veces más largo que el PT de los SN (Figura 2b); sin embargo, la rectitud fue mayor en los SN que en los JN (Figura 2c), de acuerdo con la observación de que los túbulos JN eran mucho más tortuosos (Figura 2a; Figura complementaria S6).

Figura 1|Criterios morfológicos utilizados para identificar segmentos de nefrona. (a-e) Morfología de los diferentes segmentos de la nefrona en ratones control. Las nefronas se rastrearon desde el polo urinario del glomérulo hasta el conducto colector (túbulo proximal [PT]: turquesa; rama delgada [TL] del asa de Henle: gris claro; rama ascendente gruesa [TAL] del asa de Henle: gris oscuro; túbulo contorneado distal [DCT]: rosa; túbulo conector [CNT]: amarillo; conducto colector cortical [CCD]: naranja). Las flechas indican el diámetro de los diferentes segmentos de nefrona. (Continuado)

Figura 1|(Continuación) (f) Cuantificación del diámetro tubular externo de los diferentes segmentos de nefrona. Los datos se expresan como SEM medio. Análisis de varianza seguido de la prueba de Tukey-Kramer: **P < 0.01,="" ***p=""><>

Figura 3|La reconstrucción tridimensional (3D) de nefronas revela 3 tipos diferentes de nefronas. (a) Imágenes representativas en 3D de una nefrona completa (paneles de la izquierda) desde los glomérulos hasta el conducto colector en la corteza superficial (azul), la corteza media (verde) y la región yuxtamedular (roja) en ratones de control. Segmentación de nefronas (paneles de la derecha) para los 3 tipos diferentes de nefronas. Barra ¼ 150 mm. (b) Cuantificación de la interdistancia entre las 2 ramas del asa de Henle para los 3 tipos de nefronas. (c) Cuantificación de la longitud de la nefrona para (continuación)

Figura 3|(continuación) 3 tipos de nefronas. (d) Cuantificación de la longitud de los diferentes segmentos de la nefrona según el tipo de nefrona. Los datos se expresan como media -SEM. Análisis de varianza seguido de la prueba de Tukey-Kramer: nefrona yuxtamedular (JN) versus nefrona superficial (SN): ###P < 0.001;="" jn="" versus="" nefrona="" media="" (mn):="" *="" p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001.="" cnt,="" túbulo="" conector;="" dct,="" túbulo="" contorneado="" distal;="" pt,="" túbulo="" proximal;="" tal,="" rama="" ascendente="" gruesa="" del="" asa="" de="" henle;="" tl,="" rama="" delgada="" del="" asa="" de="">

El tamaño glomerular varía con la profundidad

Luego analizamos la profundidad y el diámetro de los glomérulos seleccionados al azar de cada una de las 3 zonas. Los análisis morfométricos revelaron que los glomérulos se ubicaron en promedio a 783 y 355 mm de la cápsula renal en JN y SN, respectivamente. Como se informó anteriormente, observamos que el tamaño de los glomérulos variaba según su profundidad. En particular, el volumen glomerular de JN fue 3 veces mayor que el de SN y MN (Figura 2d).

Reconstrucción de nefrona 3D

Luego rastreamos la evolución espacial de nefronas enteras desde PT hasta CNT. La vista global de su reconstrucción 3D confirmó que la forma de la nefrona difería entre SN, MN y JN (Figura 3a; Película complementaria S7). Esta diferencia se debió principalmente a la estructura de PT. Además, observamos que HL tenía una organización espacial 3D diferente. En particular, TL y TAL estaban más separados en JN que en SN y MN (Figura 3b). Los análisis morfométricos revelaron que los JN eran globalmente 2- veces más largos que los SN (Figura 3c). El aumento de la longitud se distribuyó proporcionalmente en todos los segmentos, excepto en TAL y DCT, que tendieron a tener una longitud absoluta similar en todos los tipos de nefronas (Figura 3d). Esto sugirió que el alargamiento de la nefrona es un proceso sorprendentemente homogéneo.

Los vasos arqueados influyen en la convolución PT yuxtamedular

Para obtener una perspectiva más completa de laestructura renal, aprovechamos la tinción con aglutinina de Griffonia simplicifolia, que nos permitió rastrear los vasos arqueados y sus ramas en los vasos corticales radiados (Figura 4a; Película complementaria S8). Curiosamente, la reconstrucción 3D concomitante de nefronas y vasos mostró que los vasos arqueados tienden a estar en una sorprendente organización espacial paralela con los túbulos cercanos. En particular, observamos que el camino seguido por JN específicos (JN restringidos) tiende a seguir el camino del barco cercano (Figura 4b; Película complementaria S9). Sorprendentemente, este sesgo (observado solo en un subconjunto de nefronas JN) explicó la gran heterogeneidad en las formas de PT (Figura complementaria S6). Los análisis morfométricos revelaron que los PT "restringidos" eran significativamente más largos y tortuosos (rectitud reducida) que los "no restringidos" (Figura 4c y d). Vale la pena señalar que las partes contorneadas de los SN y los MN se colocaron por encima de los vasos arqueados y no estaban restringidas.

Los túbulos tienden a estar en planos.

Curiosamente, la inspección de las formas 3D de las nefronas indicó que tienden a estar en planos (Figura 5a; Película complementaria S10). Para cuantificar este parámetro y evaluar el posible sesgo estadístico de esta conformación, medimos la tendencia general de los túbulos a doblarse fuera del plano definido por sus bucles. Nuestras mediciones mostraron que, en comparación con un modelo simulado de caminata aleatoria generado con el mismo conjunto de ángulos medidos consecutivos y longitud entre puntos consecutivos (Figura 5b), los túbulos tendían a evolucionar con una desviación menor de un plano (Figura 5c). Esto indicó que los túbulos tendían a restringir su camino a lo largo de un plano. Las diferencias observadas fueron altamente significativas estadísticamente (P <>

la cistanche puede mejorar la función renal

La reconstrucción de nefronas en 3D revela un patrón específico para el desarrollo de quistes

Para determinar si nuestro protocolo permite rastrear nefronas en tejidos patológicos desorganizados, caracterizamos las formas y la distribución espacial de los quistes en ratones jck, un modelo ampliamente utilizado de NPHP y enfermedad quística. Las imágenes 31–33 3D mostraron que a pesar de de la aparición de quistes prominentes, el curso general en 3D de las nefronas no difirió significativamente del de los ratones de control (Supplementary Movie S11). De manera similar, los análisis morfométricos confirmaron que la longitud global de las nefronas, el volumen glomerular y la longitud de cadanefronasegmento eran comparables con los de los ratones de control (Figura complementaria S7). Es de destacar que, debido al desarrollo de quistes, no pudimos diferenciar TL de TAL en HL. Todas las nefronas desarrollaron quistes fusiformes (Películas complementarias S11 y S12). Una de las características más llamativas fue la observación de que se produjeron dilataciones quísticas fusiformes en múltiples lugares a lo largo del mismonefronasegmento (Películas complementarias S12 y S13). Curiosamente, observamos que los quistes nunca se desarrollaron en las extremidades descendentes de PT y HL (Figura 6a; Película complementaria S12). Por el contrario, se detectaron predominantemente en las ramas ascendentes de HL, DCT, CNT y en la parte superior de los CD, en continuidad con CNT (Figura 6a; Película complementaria S12). En particular, observamos que DCT, así como los segmentos de CNT, tenían una probabilidad particularmente mayor de desarrollar quistes en sus respectivas partes más distales (Figura 6b). Los análisis morfométricos cuantitativos de las imágenes de reconstrucción 3D revelaron que el volumen total del quiste pornefronafue particularmente alto en CNT (Figura 7a). Además, observamos que los agrandamientos de quistes en HL y DCT fueron mayores en JN que en SN y MN (Figura 7a; Película complementaria S12). Además, la incidencia de quistes fue significativamente mayor en JN que en los otros tipos de nefronas (Figura 7b). También observamos que la interdistancia glomerular promedio (calculada en los 5 glomérulos más cercanos) tendía a aumentar particularmente en ratones quísticos, especialmente en la corteza más superficial (Figura complementaria S8).

La reconstrucción en 3D de numerosos quistes reveló que eran extremadamente variables en forma y volumen (Figura 6c; Películas complementarias S11 y S13). En la rama ascendente del HL, los quistes tenían una forma fusiforme con un diámetro pequeño. En DCT, los quistes tenían una forma bastante esférica y más grande y se intercalaban entre los túbulos no dilatados. Curiosamente, la transición entre DCT y CNT se caracterizó sistemáticamente por una estructura normal no dilatada. En contraste, en CNT, observamos sistemáticamente una estructura quística dilatada contigua directamente en contacto con el CD. Curiosamente, en la EC, esta estructura se encogió progresivamente a un tamaño de túbulo normal. Más distalmente, no se pudieron detectar más quistes en la porción contigua del CD. Otra característica consistente fue la peculiar organización espacial de los quistes en la rama ascendente del HL. De hecho, aunque los quistes eran más profundos y más cercanos al asa en los SN, eran más superficiales y más cercanos a la DCT en los JN (Figura 6c). Nuevamente, los quistes ocuparon una posición intermedia en los MN (Figura 6c).

Figura 5|Los túbulos de nefrona tienden a evolucionar como una estructura plana. (a) Un trayecto típico de un túbulo proximal de nefrona. Este camino ilustra su tendencia a estar en un plano. La planaridad de la evolución de la trayectoria se aprecia mejor cuando se gira adecuadamente y se alinea con el punto de vista del observador (ver la representación de la derecha del mismo segmento tubular, que, en el lado izquierdo, se representa en un plano diferente). ángulo). (b) Representación esquemática de un camino tubular compuesto por 4 segmentos (entre 5 puntos que definen un camino tubular dado se muestra como ejemplo). El grado en que las trayectorias tienden a "salir de su plano" se puede representar mediante el ángulo indicado aquí como "beta". (Continuado)

Figura 5|(Continuación) Este ángulo se mide entre el segmento p3-p4 con respecto al plano (definido por los puntos inmediatamente anteriores p3, p2 y p1) y representado por un rectángulo gris oscuro en el esquema. Luego se calculó recursivamente el cálculo de los ángulos beta a lo largo del conjunto de puntos en una trayectoria tubular. Para evaluar el alcance del sesgo de estos ángulos beta, simulamos una caminata aleatoria (simulación de Monte Carlo [MC]) utilizando el mismo conjunto de ángulos alfa consecutivos de cada trayectoria tubular (medidos entre todos los segmentos consecutivos). Esta ruta generada de caminata aleatoria con un conjunto idéntico de ángulos alfa y ángulos beta aleatorios. ( c ) Gráficos de violín de la distribución global de ángulos beta y el resultado de MC en el túbulo proximal (PT), rama delgada (TL) del asa de Henle, rama ascendente gruesa (TAL) del asa de Henle, túbulo contorneado distal ( DCT) y túbulo conectivo (CNT). MC, P <>

DISCUSIÓN

Los métodos histológicos tradicionales tienen una capacidad limitada para detectar cambios patológicos que afectan la forma global de las nefronas. Aquí, presentamos un poderoso enfoque basado en la limpieza de tejidos que tiene el potencial de abordar preguntas cruciales sobre la arquitectura renal con un detalle espacial sin precedentes en condiciones normales y patológicas. Nuestros resultados confirmaron la existencia de 3 tipos de nefronas, que difieren en su ubicación, forma y tamaño, de acuerdo con sus especificidades funcionales. Además, demostramos que las nefronas tienden a estar en planos y adaptarse a la organización espacial de los vasos. Curiosamente, cuando aplicamos esta técnica a un modelo deenfermedad renal quística, observamos que se desarrollan quistes en todos

nefronas, pero sólo en segmentos específicos. Curiosamente, mostramos que la forma del quiste varía según el segmento de la nefrona, y que a lo largo de la misma nefrona, los quistes se intercalan con los túbulos normales no dilatados. En conjunto, estos resultados proporcionan la primera caracterización 3D de la disposición espacial de las nefronas y los vasos y, lo que es más importante, proporcionan la base para comprender un proceso patológico, como la cistogénesis.

El aclaramiento óptico del riñón es un desafío debido a los altos niveles de autofluorescencia y densidad celular. Al comparar diferentes protocolos de limpieza, identificamos en BABB una poderosa técnica para implementar la visualización y reconstrucción de estructuras ubicadas en la parte más profunda delriñón, es decir, la médula. Además, BABB es rápido y escalable y, una vez limpias, las muestras se pueden almacenar durante meses antes de la adquisición de imágenes. Otra de las principales ventajas de esta técnica es su bajo coste. Los agentes aclaradores pueden provocar el encogimiento o el agrandamiento de las estructuras.9–17 Sin embargo, debido a que estas modificaciones del tamaño del riñón son isotrópicas, no se espera que las medidas relativas se vean afectadas o sesguen su interpretación. Una de las limitaciones más importantes es la anotación de estructuras que consume mucho tiempo. Sin embargo, existe un número creciente de técnicas basadas en el aprendizaje profundo que deberían superar rápidamente esta limitación.

De acuerdo con los resultados obtenidos por las técnicas clásicas, nuestro estudio mostró que las nefronas difieren en su forma y longitud según su posición. En particular, observamos que los JN tienen PT contorneados más desarrollados y glomérulos más grandes y son 2 veces más largos que los SN. El aumento de longitud es el resultado de un proceso armonioso porque el alargamiento afecta proporcionalmente a todos los segmentos de la nefrona. También observamos que los JN tienen HL más grandes. En conjunto, estos datos muestran claramente que la microanatomía de SN y JN es significativamente diferente y que los MN muestran características intermedias. Curiosamente, los estudios fisiológicos han demostrado que las nefronas también son funcionalmente diferentes.2 Los eventos morfogenéticos que subyacen a estas diferencias aún no se conocen. Por lo tanto, es tentador especular que la estructura particular de los JN puede explicar la especificidad de sus funciones.

Curiosamente, al proporcionar por primera vez la reconstrucción 3D de las nefronas y sus vasos circundantes, descubrimos una restricción espacial entre los vasos arqueados y un subgrupo de nefronas. Por lo tanto, es concebible pensar que los barcos pueden dictar la formanefronasalargan durante el desarrollo.34,35 La inspección de las formas 3D de las nefronas combinada con simulaciones computacionales también reveló que las nefronas nunca se entremezclan y que cada nefrona tiende a estar en un plano. Queda por dilucidar el significado funcional de esta observación.

Desarrollo de quistes durantepoliquistico enfermedad en los riñonessigue siendo un proceso intrigante. NPHP, una condición patológica caracterizada por el desarrollo de quistes, es la enfermedad genética más común que causa enfermedad renal en etapa terminal en niños y adolescentes. Veinte genes NPHP han sido identificados hasta el momento.36 Entre ellos, NEK8 codifica un miembro de la familia de quinasas relacionadas con A que nunca está en mitosis, que desempeña un papel en la función de los cilios y la progresión del ciclo celular.37 Nek8 se caracterizó originalmente como el gen mutado en jck.32 En particular, se ha demostrado que una mutación en el mismo dominio proteico conduce a NPHP9 en humanos.38 2Estudios D sugirieron que el desarrollo de quistes difiere drásticamente entre las diferentes formas de poliquistosis renal.27,29 En particular , en NPHP, los quistes parecen derivar exclusivamente de CD y DCT.31 Aunque informativos, estos estudios inmunohistoquímicos no pueden argumentar en contra de la posibilidad de que la pérdida de marcadores tubulares específicos39 explique artificialmente esta observación. Por lo tanto, nuestro estudio 3D proporciona la primera evidencia clara de que el desarrollo de quistes es un proceso que puede involucrar solo segmentos específicos de nefronas. Curiosamente, aunque la quinasa 8 relacionada con NIMA (Never In mitosis gene A) (NEK8) se expresa en el citoplasma de todos los segmentos de la nefrona, su expresión en los cilios está restringida a DCT y CD. Debido a que solo estos segmentos son propensos a desarrollar quistes,31 podemos postular que la interrupción de la función ciliar de NEK8 es el evento crucial para la formación de quistes. Curiosamente, también hemos observado que los quistes fusiformes están en continuidad con los túbulos normales no dilatados. El hecho de que una mutación recesiva de la línea germinal conduzca a un fenotipo patológico solo en un subconjunto de células sugiere que un segundo evento podría desencadenar el desarrollo de quistes en estas células, como se sugiere para poliquistosis autosómica dominante.enfermedad del riñon.40,41

También observamos que el agrandamiento del quiste es más predominante en los JN que en los NS, al menos considerando los quistes que se ubican entre PT y CNT. De manera consistente, se ha informado que en el contexto de la glomeruloesclerosis, las lesiones glomerulares se encuentran con mayor frecuencia en los JN que en los SN.1,21,42 Si el exceso de trabajo debido al aumento de lanefronaLas tasas de filtración glomerular y las actividades de transporte/enzimáticas explican la mayor susceptibilidad de los JN a deteriorarse es una hipótesis interesante que merece una mayor investigación.

En resumen, describimos una nueva técnica para obtener imágenes de riñones en 3D con suficiente especificidad y resolución molecular para registrar directamente la distribución espacial y cuantitativa de estructuras internas específicamente etiquetadas (nefronas, vasos y quistes). Dada la conveniencia, la velocidad y la capacidad de cuantificación directa, anticipamos que esta técnica se convertirá en una herramienta poderosa para comprender la fisiopatología renal.

Figura 6|La reconstrucción tridimensional (3D) de la nefrona revela que los quistes se desarrollan solo en segmentos específicos de la nefrona. (a) Imágenes 3D representativas con representación del volumen del quiste de una nefrona completa (paneles izquierdos) desde los glomérulos hasta el conducto colector en la corteza superficial (azul), la corteza media (verde) y la región yuxtamedular (roja) en ratones jck. Segmentación de nefronas (paneles de la derecha) para los 3 tipos diferentes de nefronas. Barra ¼ 150 mm. (b) Probabilidad de desarrollar quistes en los diferentes segmentos de nefrona en ratones jck. (Continuado)

Figura 6|(Continuación) El eje horizontal es una longitud normalizada de nefronas correspondiente a 50 bins (túbulo proximal [PT], turquesa; asa de Henle [HL], blanco; túbulo contorneado distal [DCT], rosa; túbulo conector [CNT], amarillo) . (c) Imágenes representativas de reconstrucción de quistes en 3D con representación del volumen del quiste de la rama ascendente de HL (paneles izquierdos), DCT (paneles centrales) y CNT y conductos colectores corticales (CCD) (paneles derechos) en superficie (paneles superiores), centro (paneles centrales) y nefronas yuxtamedulares (paneles inferiores) en ratones jck. Barra ¼ 50 mm.

MÉTODOS

animales

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por los "Services Vétérinaires de la Préfecture de Police de Paris" y por el comité ético de la Université Paris Descartes. Se usaron ratones FVB/N de dos meses de edad (n¼ 20) para establecer las condiciones experimentales para la limpieza renal. Luego, el estudio se realizó en ratones macho jck de 2-semanas de edad (n=4) y compañeros de camada de control (n=3).

Preparación de tejidos renales

Antes de sacrificarlos, los ratones se perfundieron mediante cateterismo intracardíaco con 25 ml de solución salina heparinizada (1000 UI/l) seguido de 75 ml de paraformaldehído al 4 por ciento en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los experimentos se realizaron bajo anestesia con xilazina (Rompun 2 por ciento, Bayer, Leverkusen, Alemania, 6 mg/g de peso corporal) y ketamina (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Francia, 120 mg/g de peso corporal).

Para los estudios de limpieza, los riñones se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 4 horas y se incluyeron en agarosa al 4 %. Se cortaron secciones de 1,5- mm de espesor que rodeaban el hilio renal y se almacenaron en PBS a 4 °C.Secciones de riñónprimero se tiñeron y luego se aclararon.

Para estudios inmunohistoquímicos en secciones delgadas,riñonesse fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento durante la noche y se incluyeron en parafina y se cortaron secciones de 4- mm.

tinción

Tinción con ácido peryódico de Schiff. Las secciones de riñón de 1.5- mm se incubaron en ácido peryódico de Schiff puro o diluido en PBS 1:100 durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de aclarar.

Inmunohistoquímica en secciones delgadas incluidas en parafina. Se calentaron secciones de cuatro micrómetros de riñones incluidos en parafina para la recuperación del antígeno y se incubaron durante la noche a 4 °C con lectinas acopladas con flfluorocromo para rastrear los túbulos (aglutinina de maní con rodamina [RL-1072-5] y aglutinina de germen de trigo con rodamina [RL{{ 6}}], Vector Laboratories, Burlingame, CA, diluido a 1:200) y anticuerpo primario específico de segmento para representar distintos segmentos tubulares (lectina de Lotus tetragonolobus biotinilada [B-1325], Vector Laboratories, diluido a 1: 100; ratón anti-Calbindina D28K [D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Alemania, diluido a 1:200; cabra anti AQP2 [C-17], Santa Cruz, diluido a 1:200) . Al día siguiente, las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente (conjugado de Alexa Fluor 488 [S32354], Invitrogen; antigoat Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-mouse Alexa Fluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; todo diluido a 1:500) antes de ser coloreado con 40,6-diamidino-2-fenilindol. Todas las imágenes se adquirieron con un microscopio Nikon Eclipse E800 (Champigny sur Marne, Francia) y se prepararon con el software FiJi (versión 1.50).

Tinción con lectina en secciones gruesas. Las secciones de riñón de 1.5-mm de espesor se incubaron a 4 °C durante 1 mes en Texas Red o lectinas acopladas con isotiocianato de fluoresceína: aglutinina de maní (RL-1072-5) y aglutinina de germen de trigo (RL{{6} }), diluido a 1:100 en azida PBS al 0,1 % y Triton-X al 0,1 %. Luego, las secciones se lavaron todos los días durante 2 semanas con PBS antes de limpiarlas.

compensación óptica

Para la eliminación de incrustaciones, se incubaron secciones de riñón de 1,5- mm en ScaleA2 (4 M de urea, 0,1 por ciento de Triton X-100, 10 por ciento de glicerol) o ScaleB4 (8 M de urea, 0,1 por ciento de Triton X-100) durante 2 semanas, hasta 1 año, a 4 C.

Para la limpieza de BABB, se deshidrataron secciones de riñón de 1,5-mm en enjuagues secuenciales de etanol a temperatura ambiente. Luego, las muestras se incubaron en BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) en una proporción de 1:2 durante al menos 2 días a 4 °C.

Adquisición de imágenes de microscopía de dos fotones

Se tomaron imágenes de los tejidos con gel acuoso en un microscopio multifotónico invertido (LaVision BioTec) equipado con un láser Mai Tai HP Titanium-Sapphire (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (Figura complementaria S1A). La longitud de onda de excitación fue de 815 nm al 8 por ciento de la potencia. Utilizamos un objetivo de inmersión en agua de 20 (XLUMPLFL20XW, Olympus [Tokyo, Japan]; apertura numérica, 0,95; distancia de trabajo, 2,0 mm). Para la adquisición de fluorescencia, usamos un detector no descaneado al 80 por ciento con un filtro de paso de banda de 593/40 nm.

El primer paso consistió en la adquisición de imágenes de mosaico 2D en la pila z central mediante el uso de parámetros de adquisición subóptimos (400 mm 400 mm y 1011 1011 píxeles, con un 10 por ciento de superposición y una línea con un promedio de 2) para guiar la selección de los campos centrales más relevantes. (Figura complementaria S9A). Una vez que se definieron los campos de interés de la cuadrícula xy y z, se ajustaron los parámetros para adquirir imágenes de alta calidad. Tal enfoque redujo la región de interés a 5 12 fifields por pila z. Luego, adquirimos pilas/cortes ópticos de 850 z (tamaño de paso de 1- mm) que rodeaban el hilio renal en la parte media delsección de riñón.

Unión, procesamiento y rastreo de imágenes

Cada pila se dividió en mosaicos de acuerdo con el método desarrollado por Preibisch et al., 43 que permite unir una gran colección de imágenes utilizando el complemento "Grid/Collection stitching" del software Fiji (http://fifiji.sc/Fiji) . Debido a que observamos un cambio importante entre 2 imágenes adyacentes después de unirlas, escribimos un programa personalizado en Python. Este programa compensa el cambio de imagen, lo que nos permite alinear correctamente las imágenes (Figura complementaria S9B). Las imágenes corregidas unidas se analizaron utilizando Imaris versión 8.4.2 (Bitplane, Zúrich, Suiza). Los túbulos y los vasos se rastrearon utilizando el modo manual del paquete de trazador de filamentos de Imaris y se unieron mediante un Imaris Xtension que desarrollamos con MATLAB (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Join{{12 }} Filament_Tool.zip?dl¼0) (Figura complementaria S9C). Los glomérulos y los quistes se reconstruyeron en 3D utilizando el modo manual del paquete de superficie de Imaris. La organización espacial de los glomérulos en 3D se mostró utilizando el modo manual del paquete de manchas de Imaris.

Morfometría

La longitud del segmento tubular, la longitud de la nefrona y la rectitud se determinaron utilizando el paquete de trazador de filamentos de Imaris. Según el software Imaris, la rectitud se cuantificó como la relación entre la distancia entre 2 puntos y la longitud del trayecto del segmento de la nefrona. Treinta y un PT y 12 nefronas completas se reconstruyeron y midieron en 3 ratones de tipo salvaje, mientras que 37 PT y 17 nefronas completas se reconstruyeron y midieron en 4 ratones jck. Quiste y

los volúmenes glomerulares se determinaron utilizando el "paquete de superficie" de Imaris. Se midieron 31 y 34 glomérulos en ratones tipo salvaje y jck, respectivamente. Setenta y cuatro quistes se midieron en total.

Los ángulos "fuera del plano" de los giros tubulares (indicados como "beta") se midieron entre el plano (definido por 3 puntos consecutivos) y la dirección con el próximo cuarto punto consecutivo en el espacio (Figura 5b). Para evaluar la importancia estadística del sesgo observado, simulamos la distribución de ángulos beta con una rotación aleatoria de ángulos beta (simulación de Monte Carlo) en estructuras que estaban compuestas por los mismos segmentos con el mismo conjunto de ángulos alfa.

Para el cálculo de la probabilidad de desarrollar una lesión quística a lo largonefronasegmentos, representamos cada nefrona por un conjunto de puntos en el espacio. Cada punto se anotó con respecto a la presencia de quiste versus estructura normal y el tipo de segmento. La probabilidad en cada longitud estandarizada (establecida en 50 contenedores) se calculó como la relación entre el número de puntos con anotación quística y el número total de puntos en el contenedor.

Para el cálculo de la interdistancia glomerular media se consideró para cada glomérulo la interdistancia glomerular media calculada sobre los 5 glomérulos más próximos.

Análisis de datos y estadísticas.

Los datos se expresan como SEM medio. Las diferencias entre los grupos experimentales se evaluaron mediante análisis de varianza seguido, cuando fue significativo (P < {{0}}.05),="" por="" la="" prueba="" de="" tukey-kramer.="" cuando="" se="" compararon="" solo="" 2="" grupos,="" se="" utilizó="" la="" prueba="" de="" mann-whitney.="" los="" análisis="" estadísticos="" se="" realizaron="" utilizando="" el="" software="" graph="" prism="" (san="" diego,="" ca,="" versión="">

DIVULGACIÓN

Todos los autores declararon no tener intereses en competencia.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Agradecemos al Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), Histology and Imaging Platforms of Structure Federative de Recherche Necker por su asistencia técnica. Agradecemos a Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler y Nicolas Kuperwasser por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, Roche Pharma Research and Early Development (Basilea , Suiza), y el Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (París, Francia).

CONTRIBUCIONES DE AUTOR

TB, NG y MZ diseñaron y realizaron los experimentos y analizaron los datos. FB, LT, MGT y SG también realizaron algunos experimentos y analizaron los datos. MB y CN realizaron los experimentos con ratones. TB y MZ también contribuyeron a escribir el manuscrito. GF revisó el manuscrito. FT y MP proporcionaron el marco conceptual y diseñaron el estudio, supervisaron el proyecto y escribieron el artículo.

la cistanche puede tonificar el riñón

MATERIAL SUPLEMENTARIO

Archivo complementario (PDF)

Figura S1. Configuración experimental, procedimiento de adquisición y procesamiento de imágenes.

Figura S2. Límites de la señal de autofluorescencia en resoluciones xy y z.

Figura S3. Imagen bidimensional de la transición entre PT y TL en secciones de riñón incluidas en parafina de 4- mm.

Figura S4. Imagen bidimensional de la transición entre TAL y DCT en secciones de riñón incluidas en parafina de 4- mm.

Figura S5. Imagen bidimensional de la transición entre DCT y CNT en secciones de riñón incluidas en parafina de 4- mm.

Figura S6. La reconstrucción tridimensional revela 3 formas diferentes de túbulos proximales.

Figura S7. La reconstrucción tridimensional revela que la longitud y la segmentación de las nefronas no se ven afectadas por los quistes.

Figura S8. Densidad de glomérulos en riñones control y quísticos.

Figura S9. Procedimiento de adquisición y procesamiento de imágenes postratamiento.

Tabla S1. Comparación de métodos de compensación. Archivo Suplementario (Películas)

Película S1. La tinción con lectina mejora notablemente la resolución y la relación señal-fondo.

Película S2. Trazado de la trayectoria de un túbulo.

Película S3. Reconstrucción tridimensional de un riñón aclarado que muestra la unión entre el túbulo proximal y la rama delgada del asa de Henle.

Película S4. Reconstrucción tridimensional de un riñón aclarado que muestra la unión entre la rama ascendente gruesa del asa de Henle y el túbulo contorneado distal.

Película T5. Reconstrucción tridimensional de un riñón aclarado que muestra la unión entre el túbulo contorneado distal y el túbulo conector.

Película S6. La forma y el tamaño de los túbulos proximales difieren según su profundidad.

Película S7. Reconstrucción tridimensional de nefronas en ratones de control.

Película S8. Trazado de la trayectoria de un vaso desde un vaso arqueado hasta un vaso cortical radiado.

Película S9. Los vasos arqueados modelan la forma de los túbulos proximales yuxtamedulares.

Película S10. Las nefronas tienden a estar en un plano.

Película T11. La reconstrucción tridimensional de la nefrona muestra un patrón específico para el desarrollo de quistes.

Película T12. La segmentación tridimensional de la nefrona revela que los quistes se desarrollan en segmentos específicos de la nefrona.

Película T13. Disposición espacial e interrelación de nefronas y vasos en un riñón poliquístico

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