Las variantes de la apolipoproteína L1 asociadas con la enfermedad renal muestran una ganancia de función en la actividad del canal catiónico

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Jonathan Bruno y John C. Edwards

Se sabe que las variantes de la apolipoproteína L1 (ApoL1) son responsables del aumento del riesgo de algunosriñónenfermedadesentre las personas de ascendencia africana. ApoL1 es una proteína anfitrópica que puede insertarse en las membranas de fosfolípidos y conferir permeabilidad selectiva de aniones o cationes a las membranas de fosfolípidos según el pH. Se desconoce si estas actividades difieren entre las variantes o si contribuyen a la patogénesis de la enfermedad. Utilizamos ensayos de flujo de iones impulsado por voltaje de vesículas de fosfolípidos y de asociación de membrana estable para evaluar las diferencias entre las isoformas de ApoL1. Hay un aumento significativo (aproximadamente el doble) en la actividad de la permeasa iónica selectiva de cationes de las dos variantes asociadas a enfermedades renales en comparación con la proteína de referencia. Por el contrario, no encontramos diferencias en la actividad permeasa selectiva de aniones a pH bajo entre las isoformas. En comparación con la secuencia de referencia, las dos variantes asociadas a la enfermedad muestran una mayor asociación estable con vesículas de fosfolípidos en condiciones que respaldan la actividad permeasa de cationes, lo que sugiere que la el aumento de la actividad puede deberse a una asociación e inserción más eficientes de la membrana. No hay diferencia en la asociación de la membrana entre las isoformas en condiciones óptimas para la actividad de la permeasa aniónica. Estos datos respaldan un modelo en el que la permeabilidad catiónica mejorada puede contribuir a las enfermedades renales progresivas asociadas con los alelos ApoL1 de alto riesgo.

Se sabe que dos variantes distintas en la proteína ApoL1 son responsables del aumento reconocido del riesgo de proteinuria progresiva.riñónenfermedaden personas de ascendencia africana, particularmente por glomeruloesclerosis focal y segmentaria, nefroesclerosis hipertensiva y nefropatía asociada al VIH(1–3). Las funciones funcionales de ApoL1 en las células humanas, el impacto de las variantes asociadas a la enfermedad en estas funciones y cómo puede acelerarse la inactividad de dichas alteracionesenfermedad del riñonno están claros (4, 5).

La única actividad bioquímica que se sabe que posee la proteína ApoL1 es la de funcionar como un canal iónico. Se ha observado que el dominio N terminal de ApoL1 tiene una similitud estructural con la colicina bacteriana A1 (6). Al igual que la colicina A1, ApoL1 es una proteína anfitrópica que, en determinadas circunstancias, puede entrar en una membrana lipídica desde una solución acuosa y luego funcionar como una permeasa iónica (6–9). La ApoL1 de tipo salvaje recombinante purificada es estable en una solución de detergente a pH neutro (8, 9). A un pH bajo, la ApoL1 puede entrar en las membranas de fosfolípidos y aumentar la permeabilidad selectiva de aniones de las membranas (6, 7, 9). Cuando el pH cis vuelve a subir a neutro, se suprime la permeabilidad selectiva de aniones y se activa un canal selectivo de cationes (8, 9). Estos datos respaldan un modelo en el que ApoL1, presentado en un compartimento ácido a lo largo de las vías exocítica o endocítica, podría insertarse en la membrana limitante del orgánulo, lo que aumentaría la permeabilidad a los aniones. El tráfico posterior de la proteína a otros compartimentos de la membrana donde el pH cis sería neutro (como la membrana plasmática o las membranas mitocondriales) suprimiría la permeabilidad del anión y activaría la permeasa de cationes. Si estas actividades de permeasa de iones juegan un papel en la patogenia de la ApoL1-asociadarenalenfermedadesno esta claro.

Utilizamos métodos basados ​​en vesículas para analizar las diferencias en las actividades de la permeasa iónica y la unión a la membrana entre la secuencia de referencia (de tipo salvaje), denominada G0, y las dos variantes asociadas a la enfermedad, denominadas G1 y G2. Encontramos que, en comparación con G0, las isoformas G1 y G2 muestran una actividad específica aumentada de la actividad permeasa catiónica a pH neutro sin alterar la actividad permeasa selectiva de aniones a pH bajo. Además, las isoformas G1 y G2 asociadas a la enfermedad muestran una asociación de membrana estable aumentada en comparación con G0 en condiciones que respaldan la actividad de permeasa de cationes pero no en condiciones que respaldan la actividad de permeasa de aniones. No encontramos ningún efecto sobre el patrón de sensibilidad al pH de la etapa de unión o la etapa de salida de la actividad del canal catiónico, y no encontramos ningún efecto sobre la sensibilidad al pH de la actividad permeasa selectiva de aniones. Llegamos a la conclusión de que las variantes de ApoL1 asociadas a la enfermedad mejoran selectivamente la actividad del canal de cationes de la proteína, probablemente al menos parcialmente al mejorar la inserción en la membrana. Proponemos que esta actividad mejorada del canal contribuya a la progresivariñónenfermedaden personas portadoras de genotipos de alto riesgo.

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Resultados

Las isoformas recombinantes de ApoL1 con la secuencia de señal N-terminal eliminada y reemplazada con una etiqueta de epítopo 6His/T7 se expresaron y purificaron. Los tres mostraron propiedades cromatográficas idénticas a través de la purificación y eran indistinguibles por electroforesis en gel Figura 1.

Las fracciones máximas se diluyeron a 100 ug/ml y se sometieron a ensayos de eflujo de vesículas para determinar la capacidad de conferir permeabilidad al cloruro y al potasio. El ensayo consta de dos etapas separadas. En la etapa de asociación, ApoL1 se mezcla con vesículas de fosfolípidos cargadas con KCl y se permite que se inserte en las membranas. Luego, el KCl extravehicular y el tampón se eliminan pasándolos a través de una columna de centrifugación desalinizadora equilibrada en sacarosa isotónica, lo que genera grandes gradientes de adentro hacia afuera tanto de K como de K. iones Cl. En la etapa de eflujo, el eluato de la columna de centrifugación se diluye en una solución isotónica de sacarosa tamponada que mantiene el gradiente de KCl al pH deseado. La concentración de Cl extravehicular se controla con un electrodo selectivo de cloruro. Incluso si hay permeabilidad selectiva de K o Cl, ninguno de los iones podrá salir de las vesículas debido a la falta de movimiento del contraión. El flujo de salida de iones impulsado por voltaje se inicia mediante la adición de una concentración de saturación de un ionóforo de contraión. La adición del ionóforo selectivo de K, valinomicina (Val), inducirá un gran potencial de membrana negativo interno que, si hay permeabilidad de Cl, impulsará el flujo de salida de KCl que será detectado por el electrodo selectivo de cloruro; por tanto, después de Val, la tasa de salida de Cl refleja la permeabilidad al Cl. Por el contrario, la adición del ionóforo selectivo de Cl, ionóforo de cloruro 1 (CI1), inducirá un potencial de membrana positivo en el interior que impulsará el flujo de salida de KCl si hay una permeabilidad de K presente. Por lo tanto, después de la adición de CI1, la tasa de salida de Cl refleja la permeabilidad al K. Por lo tanto, este ensayo puede servir como un ensayo de permeabilidad al Cl o al K, según el ionóforo que se use. La tasa inicial de eflujo de iones que sigue a la adición de ionóforo se toma como la permeabilidad específica iónica de las vesículas. Tenga en cuenta que el flujo de salida de Cl antes de la adición del ionóforo indica cierta permeabilidad tanto para K como para Cl. Incluso en esta circunstancia, la tasa de salida de Cl después de la adición de un exceso del ionóforo de contraión representa la permeabilidad al ion de interés: Cl después de la adición de Val y K después de la adición de CI1.

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Actividad de permeasa de cloruro

Nuestros estudios anteriores demostraron que la permeabilidad aniónica es mayor cuando tanto el paso de asociación de la membrana como el paso de salida se llevan a cabo a pH 5.0, y estas condiciones se usaron para comparar la actividad de permeabilidad al Cl de las tres isoformas, usando Val para iniciar Salida de Cl dependiente de la permeabilidad. En la Figura 2A se muestran ejemplos de datos sin procesar, que muestra la salida del electrodo selectivo de Cl en milivoltios representados frente al tiempo. El registro comienza antes de la adición del eluido de la columna de centrifugado que contiene vesículas y proteínas, y el valor de mV refleja la concentración de Cl 10 μM. El eluido de la columna de centrifugación libre de Cl se agrega en la primera flecha, diluyendo el Cl, lo que se refleja en la desviación hacia arriba del trazado de mV. Val se agrega en la segunda flecha, lo que desencadena el flujo de salida de Cl si hay permeabilidad de Cl, lo que se refleja en la caída progresiva de mV. Se agrega Triton X-100 en la tercera flecha, liberando todo el cloruro intravesicular restante. Después de la conversión de mV a concentración de cloruro utilizando una curva estándar generada para el electrodo en las condiciones del ensayo, se determina la tasa inicial fraccionaria de liberación de Cl después de la adición de Val y se toma como la permeabilidad al cloruro. En comparación con el control sin proteína (trazado azul), la alta tasa de liberación de Cl después de la adición de Val indica que ApoL1 confiere una permeabilidad sustancial al Cl que parece comparable entre las tres isoformas (trazados rojo, verde y amarillo). La muy baja tasa de salida antes de Val indica que la permeabilidad al potasio es mucho menor que la permeabilidad al Cl. Se analizó una gama de concentraciones de las isoformas de ApoL1 para la actividad de permeasa de Cl (Fig. 2B). Como se informó anteriormente para G0, encontramos que la actividad de Clpermease está relacionada linealmente con la masa de proteína en el ensayo para las tres isoformas. La actividad de permeasa en cada concentración no es diferente entre las tres isoformas. La curva de concentración se realizó dos veces usando dos conjuntos diferentes de preparaciones de proteína, dando el mismo resultado.

Se analizaron seis preparaciones independientes de las tres proteínas para la actividad de permeasa de Cl a pH 5. 0 como se resume en la Figura 2C. En ninguno de los conjuntos de preparaciones encontramos una diferencia significativa en la actividad de la permeasa de Cl entre las isoformas (p > 0.05 para la comparación de G0 con G1 o G2 en cada conjunto) . Las tasas de flujo de salida promedio de las seis preparaciones (etiquetadas como ALL en la Fig. 2C) fueron 1,21 ± 0,32 por ciento /s para la secuencia de referencia G0, 1,36 ± 0,41 por ciento /s para G1, y 1,18 ± 0,34 para G2 (media ± SD, n=6 para cada uno; p=0,47 y 0,94 para la comparación de G0 con G1 y G2, respectivamente). Para determinar si las mutaciones asociadas a la enfermedad alteran la sensibilidad al pH de la permeasa aniónica, se analizó la permeabilidad al Cl conferida por cada isoforma a través de un rango de valores de pH, usando el pH indicado para los pasos de asociación y eflujo del ensayo (Fig. 2D). diferencias significativas entre las isoformas. Este experimento se realizó dos veces usando dos conjuntos diferentes de preparaciones de proteínas, dando el mismo resultado. Por tanto, la actividad de Clpermeasa no es significativamente diferente entre las dos variantes asociadas a la enfermedad y la secuencia de referencia.

Actividad de la permeasa de potasio

Nuestros estudios anteriores indicaron que la permeabilidad de los cationes es mayor cuando el paso de asociación de la membrana se lleva a cabo a pH 6.0 y el paso de salida se lleva a cabo a pH 7,5, y usamos estas condiciones a menos que se especifique lo contrario. En la Figura 3 se muestran ejemplos de datos sin procesar de un ensayo de permeasa K. Al igual que con los ensayos de permeabilidad de Cl, el eluido de la columna de centrifugación se agrega en la primera flecha, el ionóforo (en este caso, Cloruro Ionóforo1, CI1) se agrega en la segunda flecha y se agrega detergente en la tercera flecha. Las tasas iniciales de eflujo después de la adición de ionóforo, que representan la permeabilidad K, se muestran mediante líneas discontinuas grises. El trazo azul es del control sin proteína, que muestra la permeabilidad de fondo endógena de las vesículas solas. El trazo rojo muestra la actividad de la variante G0(wild type), demostrando claramente la presencia de una permeabilidad K mayor que las vesículas de control conferidas por la proteína como se informó previamente (9). Los trazos amarillos y verdes muestran la actividad de las variantes G1 y G2, respectivamente. Las pendientes iniciales después de la adición del ionóforo son claramente mayores para G1 y G2 que para G0, lo que indica que las variantes asociadas a la enfermedad soportan una mayor actividad de permeasa K que G0.

En contraste con el ensayo de permeabilidad de Cl, y como se informó anteriormente para la isoforma G0 (9), en las condiciones del ensayo de permeasa K, hay algo de flujo de salida antes del ionóforo en las vesículas que contienen cualquiera de las tres isoformas, representadas por la pendiente descendente. de las grabaciones después de la adición de muestra y antes de la adición de ionóforo. Mientras que la alta tasa de salida después de la adición del ionóforo indica la presencia de una permeabilidad sustancial al K, la salida antes del ionóforo también indica la presencia de cierta permeabilidad al Cl, lo que permite que ambos iones se escapen de las vesículas en ausencia del ionóforo. Es probable que esta fuga explique tanto el aumento embotado en la salida del electrodo inmediatamente después de la adición del eluato de la columna de centrifugación como la pendiente descendente subsiguiente antes de CI1 que se observa en todos los registros que contienen ApoL1. Suponiendo que esta fuga comienza cuando la muestra pasa a través de la columna de centrifugado, también explicaría las diferencias en la concentración final de Cl después de agregar detergente, ya que cualquier pérdida de KCl en la columna de centrifugado significaría menos KCl total agregado al ensayo. La interpretación cuantitativa de la tasa de ionóforo no es sencilla, aparte de que debe ser una función de las permeabilidades tanto para K como para Cl. Como antes (9), atribuimos esta actividad a la actividad de permeasa de Cl residual que vemos a pH 7,5 como en la Figura 2D (ver también Bruno et al. (9), Fig. 4D).

Los ensayos de permeasa de potasio se llevaron a cabo en un rango de concentraciones de proteína (Fig. 4A). La actividad se relacionó linealmente con la masa de proteína en el ensayo para cada isoforma, pero las dos isoformas asociadas a la enfermedad mostraron una actividad de eflujo sustancialmente mayor en comparación con G0. Esta curva de concentración se reprodujo con tres conjuntos separados de preparación de proteínas que produjeron resultados muy similares.

Se ensayó la actividad de salida de K en seis preparaciones independientes de las tres isoformas usando 2 ug de proteína en cada ensayo. En cada uno de los seis conjuntos, la actividad de las isoformas G1 y G2 fue significativamente mayor que la de G0 (Fig. 4B). El promedio de los seis conjuntos de datos produjo tasas de flujo de salida de 0.349 ± 0.063 por ciento /s para G{{10}}, {{15} }.709 ± 0.176 por ciento /s para G1, y 0.673 ± 0.142 por ciento /s para G2 (media ± DE, n=6 para cada uno; p < 0,00001="" para="" la="" comparación="" de="" g0="" con="" g1="" o="" g2).="" las="" actividades="" específicas="" de="" la="" permeasa="" k="" de="" g1="" y="" g2="" son="" 2.03-="" y="" 1.93-veces="" mayores,="" respectivamente,="" que="" g0="" según="" este="">

Se analizó por separado la dependencia de la actividad de la permeasa K del pH del paso de asociación de membrana y del paso de salida de iones. Aunque confirmamos que la actividad de salida total de G1 y G2 es mayor que la de G0 en condiciones "estándar" (unión a pH 6, salida a pH 7,5), no encontramos diferencias significativas en la forma de la curva. ofactividad versus pH externo (cis) del paso de asociación de membrana (Fig. 4C) o el paso de salida de iones (Fig. 4D). Tampoco encontramos diferencias entre las isoformas en la dependencia de la actividad con un pH intravesicular (trans) alto o la necesidad de la presencia de un catión divalente (Fig. 4E), y además, tenga en cuenta que el calcio o el magnesio son igualmente eficientes para proporcionar el catión divalente necesario para la completa actividad. Cada uno de estos experimentos se realizó dos veces usando diferentes conjuntos de proteína purificada, dando resultados idénticos.

Asociación de membrana estable

Anteriormente hemos demostrado que la ApoL1 recombinante purificada se une espontáneamente a las membranas de fosfolípidos mostrando una dependencia similar del pH y la composición de fosfolípidos que la de las actividades de la permeasa de iones (9). Usando métodos similares, comparamos las propiedades de unión de vesículas lipídicas de la versión de referencia de ApoL1 con las variantes asociadas a la enfermedad renal en condiciones que soportan actividades óptimas de permeasa de Cl o K (Fig. 5). Para las condiciones de Clpermease, la proteína se incubó con vesículas lipídicas a pH 5.0 antes de la extracción caotrópica para eliminar las proteínas que no estaban asociadas de manera estable con las vesículas. La proteína unida a la membrana se aisló mediante flotación a través de una sucrosecusión y se evaluó mediante transferencia de Western cuantitativa. Los resultados se muestran en la Figura 5A. No hubo una diferencia significativa en la cantidad de proteína unida a las vesículas entre las isoformas G{{10}} y G1 o G2. De los 500 ng de proteína en cada reacción, la cantidad unida a las vesículas fue de 223 ± 33 ng para G0, 239 ± 38 ng para G1 y 191 ± 28 ng para G2 (media ± DE n=8 para cada grupo, p=0.35 y 0.076 para la comparación de G0 con G1 y G2, respectivamente). Aproximadamente el 40-50 por ciento de la proteína en el ensayo se une a las membranas en estas condiciones. Este experimento se realizó dos veces y arrojó resultados muy similares.

Para evaluar la unión en condiciones óptimas para la actividad de Kpermease, la proteína se incubó con vesículas a pH6.0, luego se cambió a pH 7,5 antes de la extracción caotrópica para eliminar la proteína insertada de forma no estable. La proteína unida a la membrana se aisló por flotación de las vesículas de la membrana a través de un cojín de sacarosa y se evaluó mediante transferencia de Western cuantitativa. Los resultados se muestran en la Figura 5B. Las variantes asociadas a la enfermedad muestran una unión significativamente más eficaz en comparación con la G0. De los 500 ng de proteína añadidos a cada reacción, la cantidad unida a las vesículas fue de 43,5 ± 14,5 ng (n=8) para G{{30}} ,73.0 ± 17,7 ng (n=7) para G1 y 69,3 ± 10,3 ng (n=8) para G2 (media ± DE; p=0,00076 y 0,0018 para la comparación de G0 con G1 y G2, respectivamente). Aproximadamente el 9 por ciento de la proteína G0 en la reacción se asoció de manera estable con las vesículas en comparación con aproximadamente el 14 por ciento de G1 y G2 en estas condiciones. Este experimento se realizó dos veces usando preparaciones independientes que arrojaron resultados similares.

Discusión

Aquí presentamos los resultados de estudios de actividades de permeasa iónica de ApoL1 y suriñón-enfermedad-variantes asociadas que arrojaron varios resultados significativos. En primer lugar, encontramos que las variantes de ApoL1 asociadas a la enfermedad han aumentado sustancialmente la actividad de la permeasa K, que es aproximadamente el doble que la isoforma G0 en nuestros ensayos. En segundo lugar, en contraste con la Kpermeasa, no hay diferencias significativas en la actividad específica de la actividad de la permeasa Cl a pH 5.0 entre las isoformas. En tercer lugar, no hay diferencias en la sensibilidad al pH de las actividades de permeasa K o Cl, o el requisito de pH trans alto y la necesidad de catión divalente para la actividad permeasa K entre las isoformas. En cuarto lugar, en condiciones óptimas que soportan la permeasa K, las variantes asociadas a la enfermedad muestran una asociación de membrana estable mejorada en comparación con G0, pero ninguna diferencia en la asociación de membrana en condiciones óptimas para la actividad de la permeasa Cl.

Nuestros hallazgos que demuestran un aumento de la permeasa K sin efecto sobre la permeasa Cl son muy sólidos. Usando condiciones óptimas para cada actividad de permeasa, encontramos resultados esencialmente idénticos entre seis conjuntos independientes de preparaciones, con la actividad de Kpermease de las variantes asociadas a la enfermedad significativamente mayor que G0 en cada uno. Cada juego fue preparado y analizado al mismo tiempo usando reactivos comunes. La validez de las concentraciones de proteína determinadas por el ensayo BCA fue confirmada por la intensidad comparable de la tinción de Coomassie en SDS-PAGE. Estos datos incluyen todos los intentos exitosos de purificación simultánea; nunca generamos con éxito un conjunto de las tres variantes en las que no se observaron estas actividades relativas.

Asimismo, la ausencia de diferencias en la actividad específica anión-permeasa a pH 5 fue consistente entre todos los conjuntos de preparaciones. Por lo tanto, nuestra principal conclusión es que las variantes de ApoL1 asociadas a la enfermedad confieren una ganancia selectiva de función en la actividad de la permeasa K sin afectar la actividad de la permeasa Cl, según se ensaya en condiciones óptimas para cada una de estas actividades. La presencia de diferencias sustanciales en la actividad de los canales de cationes de las variantes de ApoL1 que se correlacionan con la capacidad de impulsar la enfermedad tiene implicaciones para los posibles mecanismos patogénicos. La naturaleza selectiva del aumento de la permeabilidad iónica indica que el aumento de la actividad de la permeasa catiónica de las variantes asociadas a la enfermedad podría contribuir a la enfermedad, pero es poco probable que la actividad de la permeasa aniónica a pH bajo, que no es diferente entre las isoformas, desempeñe un papel crítico.

Las investigaciones de los efectos de las variantes sobre las sensibilidades al pH de las actividades y sobre el grado de unión estable a la membrana por parte de la proteína arrojan luz sobre el mecanismo por el cual puede potenciarse la actividad de la permeasa K. En primer lugar, además de confirmar la actividad mejorada de la permeasa K en condiciones óptimas, no encontramos diferencias en las formas de las curvas que muestran los efectos del pH en la asociación de membranas y los pasos de eflujo de la actividad de la permeasa K o del efecto del pH en la actividad general de la permeasa Cl. Además, no hubo diferencias en el requerimiento de pH elevado del interior de las vesículas o en el requerimiento de presencia de catión divalente en la reacción para la actividad de permeasa K entre todas las isoformas. Por lo tanto, no encontramos evidencia de una diferencia en las propiedades intrínsecas del propio canal. Por el contrario, las variantes mostraron una asociación estable significativamente mayor con vesículas de fosfolípidos en condiciones que respaldan la actividad de Kpermease, siendo la escala de este efecto aproximadamente el mismo rango que la inactividad del cambio. Tomados en conjunto, los datos sugieren que la base para el aumento de la actividad de la permeasa K es simplemente una inserción de membrana más eficiente en las condiciones que soportan la actividad, sin la necesidad de invocar un cambio fundamental en las propiedades de la proteína insertada.

Se han identificado tres dominios en la estructura de ApoL1(6). Se cree que la actividad del canal de iones se encuentra en el dominio "formador de poros" homólogo a la colicina, que ocupa alrededor del 60 por ciento de la proteína en su extremo N. Las variaciones de secuencia asociadas con la enfermedad no se encuentran en el dominio de formación de poros, sino que se encuentran a cierta distancia de él en un dominio de espiral enrollada, que comprende alrededor del 16 por ciento de la proteína en el extremo C terminal. La deleción de este dominio no tiene efecto sobre la actividad tripanolítica pero está altamente conservada entre las isoformas de Apol tanto dentro como entre especies (10). Se ha sugerido que esta región funciona como un dominio controlado (10), y nuestros datos indican que los mutantes causantes de enfermedades en este dominio tienen una mayor unión a la membrana en condiciones que respaldan la actividad del canal catiónico y una mayor actividad del canal catiónico. Una interpretación es que el dominio C-terminal sirve para suprimir la asociación/inserción de membrana necesaria para la actividad catiónica permeasa, y la mutación de este dominio relaja esta supresión.

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Las observaciones sobre la unión a la membrana tienen implicaciones adicionales e iluminan algunos aspectos de la relación entre las actividades de la permeasa aniónica y catiónica. Aquí encontramos que sustancialmente más proteína se une a las membranas en condiciones óptimas de actividad de permeasa de aniones (pH 5.0) que en condiciones de unión óptimas que respaldan la actividad de permeasa de cationes (pH 6.0), y esto es cierto para todos isoformas (Fig. 5). Tenga en cuenta la diferencia en las sensibilidades de pH de la actividad de permeasa de aniones (Fig. 2D) y el paso de unión a la membrana de la actividad de permeasa de cationes (Fig. 4C): la permeasa de aniones aumenta drásticamente por debajo del pH 6, mientras que la capacidad de la proteína insertada en la membrana para soportar el catión la actividad de la permeasa cae significativamente. Nuestros datos informados anteriormente mostraron que la asociación de membrana estable de G0 aumenta sustancialmente a medida que el pH cae en ese mismo rango de pH, y ese es el rango en el que la fluorescencia de la proteína intrínseca se suprime más dramáticamente (9), lo que indica una transición significativa en la estructura de la proteína . En conjunto, los datos sugieren que la inserción de membrana a pH 6.0 es fundamentalmente diferente a la inserción de membrana a pH 5.0. A pH 6.0, una fracción más pequeña de la proteína se asocia con las membranas, acompañada de solo un cambio menor en la fluorescencia intrínseca y una actividad limitada de la permeabilidad aniónica, pero con la capacidad de pasar a una forma permeable a los cationes cuando el compartimento cis se titula a pH7 .5. Además, la eficacia de esta unión es mayor para las variantes asociadas a la enfermedad, en paralelo con el aumento de la actividad de permeasa de cationes después del cambio de pH. Por el contrario, a pH 5.0 una fracción mucho mayor de la proteína se asocia con las membranas; esta unión se acompaña de un gran cambio en la fluorescencia intrínseca y la aparición de una actividad anión permeasa mucho mayor. Ni la unión a la membrana ni la actividad de la permeasa aniónica son diferentes entre las isoformas. La capacidad para que esta proteína insertada haga la transición a la confirmación de permeasa catiónica se reduce considerablemente. Presumimos que el cambio informado anteriormente en la fluorescencia intrínseca a medida que el pH cae de 6 a 5 refleja una transformación estructural a una forma que es incapaz de pasar a la conformación de permeasa catiónica, y las diferencias entre las isoformas no tienen efecto en las propiedades de permeasa iónica de esta conformación.

Una nueva observación adicional es que los iones de calcio y magnesio son igualmente efectivos para apoyar la actividad del canal catiónico de ApoL1. Esto sugiere fuertemente que el papel del catión divalente no se debe a una unión de alta afinidad por parte de la proteína, sino más probablemente a un efecto puente de carga menos específico que permite que la proteína cargada negativamente interactúe con la superficie cargada negativamente de las membranas de fosfolípidos.

Se han publicado otras investigaciones que evalúan las diferencias en la actividad de los canales iónicos de las isoformas de ApoL1. Thompson y Finkelstein (8) utilizaron métodos electrofisiológicos con técnicas de bicapa lipídica planar para evaluar la actividad del canal de ApoL1 recombinante purificada y no informaron diferencias en las características del canal entre las isoformas. Es importante tener en cuenta que los métodos de bicapa lipídica planar y los ensayos de eflujo basados ​​en vesículas, si bien ambos son ensayos de canal, arrojan diferentes tipos de información y pueden considerarse sistemas experimentales complementarios. Los métodos de bicapa lipídica son un enfoque incomparable para definir las propiedades de un solo canal de la proteína purificada, pero son herramientas menos poderosas para cuantificar la actividad específica, mientras que los ensayos de eflujo de vesículas pueden proporcionar datos cuantitativos sobre la actividad de una población, pero poca información sobre las propiedades de un solo canal. Por lo tanto, las observaciones de Thompson y Finkelstein no son inconsistentes con las nuestras, que tampoco muestran diferencias aparentes en las propiedades intrínsecas del canal, sino solo una diferencia en la actividad específica de aproximadamente el doble, una escala de diferencia que sería bastante difícil de medir. detectar en sistemas de bicapa lipídica.

Las investigaciones con proteínas y lípidos purificados tienen la virtud de revelar propiedades claramente debidas a la propia proteína y no alteradas por ningún otro componente, cinética de expresión o tráfico de membrana que comprometa sistemas más complejos. Sin embargo, guardan necesariamente silencio sobre el efecto final que estas actividades tienen en las células vivas. Se han informado estudios que utilizan sistemas de expresión basados ​​en células para descubrir las actividades de los canales iónicos de ApoL1 (revisado en Friedman y Pollak, 2019 (3)). Olabisi et al.(11) expresaron isoformas de ApoL1 en células HEK y evaluaron la concentración de potasio intracelular en estado estacionario. Encontraron potasio intracelular más bajo en las células que expresan G1 y G2 en comparación con las células que expresan G0. Si bien esta observación podría ser consistente con una mayor permeabilidad al K de la membrana plasmática, la menor K intracelular también podría ser una consecuencia inespecífica del mayor efecto citotóxico de la variante a través de cualquier mecanismo, lo que lleva a una actividad de NaK ATPasa menos activa y/o una ruptura de la integridad de la membrana plasmática. O'Toole et al. (12) calibraron cuidadosamente los niveles de expresión en células HEK y evaluaron la apariencia de la actividad del canal catiónico de la membrana plasmática, sin encontrar diferencias entre las isoformas. Sha et al. (13) informaron de la orientación de ApoL1 a las mitocondrias donde las variantes asociadas a la enfermedad inducían la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial, lo que concuerda con la evidencia reciente de citotoxicidad del tripanosoma. No está claro si este efecto requiere la actividad del canal iónico de ApoL1. Con cada uno de estos estudios, debido a la complejidad de los sistemas de expresión basados ​​en células, no se puede asegurar si las diferencias observadas se deben a las propiedades intrínsecas de la proteína oa otros componentes que interactúan presentes en las células.

Las mutaciones patogénicas con ganancia de función típicamente muestran un patrón de herencia dominante, mientras que lasfenotipo de enfermedad renalasociado con las variantes de ApoL1 es recesivo. Un mecanismo por el cual una mutación con ganancia de función puede ser recesiva es si la proteína funciona como un homomultímero y la WT puede ejercer un efecto negativo dominante sobre la variante activada. Actualmente se desconoce si ApoL1 funciona como un canal como un monómero o un multímero.

Nuestros datos sugieren que el aumento de la permeabilidad de los cationes a niveles similares de expresión de proteínas podría estar contribuyendo a la citotoxicidad en los podocitos u otras células. Sin embargo, puede parecer poco probable que un mero aumento del doble en la actividad pueda convertir una molécula aparentemente benigna en una enfermedad impulsora. No obstante, las enfermedades asociadas con las variantes de ApoL1 tienden a ser lentamente progresivas, y las diferencias sutiles durante un período prolongado de tiempo (meses a años) posiblemente podrían tener un gran efecto acumulativo. Otros posibles mecanismos de acción de ApoL1 responsables deriñónlesiónhan sido propuestos y están respaldados por evidencia (3–5, 11–16), incluidos los efectos sobre la apoptosis, la autofagia, la función mitocondrial, el tráfico de membrana intracelular y los efectos mediadores de las moléculas de señalización extracelular, entre otros. Queda por determinar la importancia relativa de las diferencias en la actividad del canal ApoL1 descritas aquí frente a otros posibles mecanismos de acción en la conducción de enfermedades.

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Procedimientos experimentales

Construcciones de expresión

pET-ApoWT que codifica 6His N-terminal y ApoL1 etiquetado con epítopo T7 (versión G0) se describieron previamente (9). La proteína codificada es idéntica a la del número de acceso de Genbank BC143038 (haplotipo 150K, 228I, 255K) del aminoácido 28 al 398, eliminando la secuencia señal en los aminoácidos 1–27 y con la adición de N-terminal {{ 17}}Epítopos His y T7 codificados por el plásmido pET28a. Los plásmidos que codifican las variantes G1 y G2 se generaron a partir de pET-ApoWT mediante la sustitución del fragmento de restricción AleI por XhoI con fragmentos que contenían las secuencias variantes, sintetizados por Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, y la identidad de los plásmidos resultantes se confirmó mediante secuenciación directa. Las tres construcciones eran idénticas excepto por las sustituciones de aminoácidos S342G e I384M en la isoforma G1 y la deleción N388-Y389 en la isoforma G2. Las isoformas ApoL1 recombinantes se expresaron en bacterias y se purificaron como se describe(8), excepto que el tampón de la columna S200 contenía un 0,03 por ciento de n dodecil- -D-maltósido (DDM) (Millipore-Sigma). Para todos los conjuntos de experimentos que compararon isoformas, los materiales se prepararon al mismo tiempo en condiciones idénticas utilizando los mismos reactivos. La concentración de proteínas se determinó con el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific) utilizando el estándar de albúmina de suero bovino. Para la proteína total como en la Figura 1, los geles se tiñeron con Instant Blue (Expedeon Inc). La proteína en el tampón S200 se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C. Las alícuotas se descongelaron en hielo y se diluyeron en el tampón S200 antes de los ensayos.

ionóforos

Valinomicina (Millipore Sigma) se disolvió a 50 mM en etanol absoluto y se diluyó a 1 mM en etanol absoluto inmediatamente antes de su uso. El ionóforo de cloruro 1 (MilliporeSigma) se disolvió a 100 mM en 1-hexanol y se diluyó a 0,2 mM en etanol absoluto inmediatamente antes de su uso.

Vesículas de membrana

Asolectina (fosfatidilcolina de soja tipo II, Sigma) se extrajo con acetona como se describe (30), se secó y luego se disolvió en cloroformo y se almacenó a -20 °C. Se secó una alícuota de fosfolípidos en cloroformo bajo una corriente de nitrógeno y se suspendió a 20 mg/ml en KCl 200 mM, HEPES 5 mM pH 8,0 mediante cinco ciclos de congelación-descongelación y agitación vorticial vigorosa. Esta suspensión se almacenó a -20 grados. Para generar vesículas unilaminares cargadas con KCl de aproximadamente 200 nm de diámetro, la suspensión lipídica se pasó 15 veces a través de un filtro de membrana de policarbonato de poro de 200 nm utilizando una cámara extrusora (Avanti Polar Lipids) y el protocolo proporcionado por el fabricante (17, 18). Las vesículas extruidas se mantuvieron en hielo y se usaron dentro de las 24 h.

Ensayos de actividad

Los ensayos de actividad de permeasa iónica que utilizan el flujo de salida de KCl impulsado por el potencial de membrana detectado con un electrodo selectivo de cloruro se realizaron como se describió anteriormente (9). Se añaden veinte microlitros de ApoL1 en tampón S200 (NaCl 15{{20}} mM, Tris 10 mM pH 8,3, DDM al 0,3 %). a 380 ul de mezcla de reacción compuesta por KCl 82 mM, sacarosa 127 mM, tampón 42,1 mM al pH indicado (MES para pH 5–6,5, HEPES para pH 7,0–8,0), 2,63 mMCa(gluconato)2 y 1,84 mg/ml de isolectina extruida vesículas. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 4 minutos antes de pasarla a través de una columna de centrifugación Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad) de 3 ml equilibrada en sacarosa 330 mM. El eluato se añade inmediatamente a 2 ml de sacarosa 330 mM, 10-5 M KCl, Ca(gluconato)2 2,5 mM y tampón 10 mM (MES para pH 5-6,5; HEPES para pH 7-8) como se indica, con monitoreo continuo con un electrodo selectivo de cloruro y registrado como se describe. Después de 20 s, se inició el flujo de salida impulsado por voltaje mediante la adición de un ionóforo (2,5 ul de valinomicina 1 mM o ionóforo 1 de cloruro 0,2 mM en etanol) y se dejó proceder durante 30 s seguido de la adición de Triton X-100 al 0,1 por ciento para liberar el cloruro intravesicular restante. Los datos brutos en mV se convirtieron en concentración de Cl utilizando una curva estándar generada para el electrodo en las condiciones del ensayo. Las tasas fraccionarias iniciales de liberación de cloruro se derivaron de 3 s durante la respuesta inmediata máxima a la adición de ionóforo.

Todas las comparaciones de actividad se realizaron usando material de preparaciones simultáneas de las tres isoformas que se habían diluido a 100 ug/ml de proteína en tampón S200 antes del ensayo. Todos los ensayos usados ​​para la comparación directa entre las variantes se realizaron el mismo día usando los mismos reactivos recién preparados.

Ensayo de asociación de membrana

Los ensayos de asociación de membranas se llevaron a cabo por separado en condiciones óptimas para la actividad de permeasa de Cl y para la actividad de permeasa de K. Para condiciones que apoyen la actividad de Clpermease, 5 ul de 100 ug/ml de proteína en 1{{30}} mM Tris pH8.2, 150 mM NaCl , 0.03 por ciento de DDM se añadió a 95 ul de mezcla de reacción (3,4 mg/ml de vesículas de isolectina (cargadas con KCl 200 mM, HEPES 5 mM pH 8), MES 20 mM pH 5,0, Ca(gluconato) 2,5 mM 2, KCl 100 mM, sacarosa 100 mM) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 min. La proporción de proteína a lípido en el ensayo es 1:680 masa/masa. La muestra se diluyó sin cambio de pH mediante la adición de 200 ul de MES 60 mM pH 5,0, Ca(gluconato)2 2,5 mM, KCl 100 mM, sacarosa 100 mM y se incubó durante 20 s. Se añadieron cien microlitros de urea 8 M, se mezclaron y luego se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. La concentración de sacarosa se llevó al 40 por ciento mediante la adición de 1,6 ml de sacarosa al 50 por ciento. La muestra de 2 ml se depositó por debajo de 1 ml de sacarosa al 30 por ciento en MES 8 mM pH 5,0, que a su vez estaba por debajo de 1,7 ml de MES 8 mM pH 5,0 sin sacarosa. Los gradientes pronunciados se centrifugaron a 200,000g en un rotor Beckman Coulter TLA-110durante 90 min a 4 C. Las vesículas se recogieron de la interfaz de sacarosa del 0 al 30 por ciento. Fracciones iguales de muestras se diluyeron 4 veces y se centrifugaron a 100,000g durante 1 h. Los gránulos de membrana se secaron, separaron mediante SDS-PAGE, se secaron con membrana de fluoruro de polivinilideno y se sondaron mediante transferencia Western con anticuerpo contra el epítopo T7 (MilliporeSigmaproducto n.º 69522-3) con detección de quimioluminiscencia utilizando un sistema de imagen digital. Se incluyeron diluciones en serie de proteína purificada en el gel para generar un isotipo y una curva estándar específica de transferencia para cada proteína.

Para las condiciones que respaldan la actividad de la permeasa K, se agregaron 5 ul de 100ug/ml de proteína en Tris 10 mM pH 8,2, NaCl 150 mM, 0,03 por ciento de DDM a 95 ul de mezcla de reacción (3,4 ug/ml de isolectinvesículas (cargadas con KCl 200 mM, HEPES 5 mM pH 8), MES 20 mM pH 6,0, Ca(gluconato)2 2,5 mM, KCl 100 mM, sacarosa 100 mM) e incubadas a temperatura ambiente durante 1 mín. La muestra se diluyó con cambio de pH a 7,5 mediante la adición de 200 ul de HEPES 60 mM pH 8,0, Ca(gluconato) 2,5 mM, KCl 2100 mM, sacarosa 100 mM y se incubó durante 20 s. Se añadieron cien microlitros de Na2CO3 500 mM y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. La concentración de sacarosa se llevó al 40 por ciento mediante la adición de 1,6 ml de sacarosa al 50 por ciento. La muestra de 2 ml se colocó en capas por debajo de 1 ml de sacarosa al 30 por ciento en Tris 8 mM pH 8,3, que a su vez estaba por debajo de 1,7 ml de Tris 8 mM pH 8,3 libre de sacarosa. Se centrifugaron cojines de sacarosa y se recogió y procesó una muestra como anteriormente.

Estadísticas

La importancia de las diferencias entre pares de medias dentro de los conjuntos de datos se determinó mediante análisis de varianza (ANOVA)(19). Los parámetros estadísticos se determinaron mediante una función integrada en Excel. Los valores de p se calcularon usando socscistatistics.com. Todos los puntos de datos se presentan como la media ± desviación estándar (SD), determinada con la función STDEV.S de Excel para cada grupo individual de réplicas.

Disponibilidad de datosTodos los datos que respaldan este documento se compartirán previa solicitud al Dr. John C. Edwards, john.edwards@health.slu.edu.

Cistanche puede tratarriñónenfermedad

Expresiones de gratitud—Agradecemos a la División de Nefrología y al Departamento de Medicina Interna de la Universidad de Saint Louis por el apoyo indispensable para realizar este trabajo.

Contribuciones de autor—JCE concibió y supervisó el estudio, aseguró la financiación, realizó los ensayos de eflujo, interpretó los datos y redactó el artículo; JB purificó las proteínas, realizó los ensayos de asociación de membranas, interpretó los datos, preparó las figuras y editó el artículo.

Financiamiento e información adicional—El trabajo fue financiado por recursos institucionales de la Universidad de Saint Louis y por la subvención R01 DK120651 de los Institutos Nacionales de la Salud a JCE. El contenido de este documento es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de la Salud.

Conflicto de intereses—Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés con el contenido de este artículo.

abreviaturas—Las abreviaturas utilizadas son: ApoL1, apolipoproteinL1; CI1, ionóforo de cloruro 1; DDM, n-dodecil- -D-maltósido;PVDF, fluoruro de polivinilideno; DE, desviación estándar; Val, valinomicina.

De: 'Riñón-enfermedadLas variantes asociadas de la apolipoproteína L1 muestran una ganancia de función en la actividad del canal catiónico porJonathan Bruno y John C. Edwards

---J. Biol. química (2021) 296 100238

Referencias

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Uscinski Knob, AL, Bernhardy, AJ, Hicks, PJ, Nelson, GW, Vanhollebeke, B., Winkler, CA, et al. (2010) Asociación de variantes tripanolíticas de ApoL1 conriñónenfermedaden afroamericanos. Ciencia 329, 841–845
2. Parsa, A., Kao, WH, Xie, D., Astor, BC, Li, M., Hsu, CY, Feldman, HI, Parekh, RS, Kusek, JW, Greene, TH, Fink, JC, Anderson , AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP, et al. (2013) Variantes de riesgo de APOL1, raza y progresión de enfermedades crónicasriñónenfermedad. N. ingl. J.Med. 369, 2183–2196
3. Friedman, DJ y Pollak, MR (2020) APOL1 yriñónenfermedad: De la genética a la biología. año Rev. Fisiol. 82, 323–342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF y Sedor, JR (2017) Identificación de la función intracelular de APOL1. Mermelada. Soc. nefrol. 28, 1008-1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H. y Okamoto, K. (2018) Nefropatías por apolipoproteína L1: 2017 en revisión. actual Opinión nefrol. hipertensos. 27, 153–158
6. Perez-Morga, D., Vanhollebeke, B., Paturiaux-Hanocq, F., Nolan, DP, Lins, L., Homble, F., Vanhamme, L., Tebabi, P., Pays, A., Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R. y Pays, E. (2005) La apolipoproteína LI promueve la lisis del tripanosoma al formar poros en las membranas lisosomales. Ciencias 309, 469–472
7. Harrington, JM, Howell, S. y Hajduk, SL (2009) Permeabilización de la membrana por factor lítico de tripanosoma, una lipoproteína de alta densidad humana citolítica. J. Biol. química 284, 13505–13512
8. Thomson, R. y Finkelstein, A. (2015) El factor tripanolítico humano APOL1 forma canales selectivos de cationes regulados por pH en bicapas lipídicas planas: Relevancia para la lisis de tripanosomas. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 112, 2894–2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J. y Edwards, JC (2017) La apolipoproteína L1 confiere permeabilidad de iones con cambio de pH a las vesículas de fosfolípidos. J. Biol. química 292, 18344–18353
10. Vanhollebeke, B. y Pays, E. (2006) La función de las apolipoproteínas L. Cell Mol. Ciencias de la vida 63, 1937–1944
11. Olabisi, OA, Zhang, JY, Verplank, L., Zahler, N., DiBartolo, S., 3rd, Heneghan, JF, Schlondorff, JS, Suh, JH, Yan, P., Alper, SL, Friedman, DJ y Pollak, MR (2016) APOL1riñónenfermedadvariantes de riesgo causan citotoxicidad al agotar el potasio celular e inducir
Proteínas quinasas activadas por estrés. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 113, 830–837
12. O'Toole, JF, Schilling, W., Kunze, D., Madhavan, SM, Konieczkowski, M., Gu, Y., Luo, L., Wu, Z., Bruggeman, LA y Sedor, JR (2018) La sobreexpresión de ApoL1 impulsa la citotoxicidad independiente de la variante. Mermelada. Soc. nefrol. 29, 869–879
13. Shah, SS, Lannon, H., Dias, L., Zhang, JY, Alper, SL, Pollak, MR y Friedman, DJ (2019) APOL1riñónlas variantes de riesgo inducen la muerte celular a través de la translocación mitocondrial y la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial. Mermelada. Soc. nefrol. 30, 2355–2368
14. Hayek, SS, Koh, KH, Grams, ME, Wei, C., Ko, YA, Li, J., Samelko, B., Lee, H., Dande, RR, Lee, HW, Hahm, E. , Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V., et al. (2017) Un complejo tripartito de suPAR, variantes de riesgo de APOL1 e integrina alphavbeta3 en podocitos media enfermedades crónicas.riñón enfermedad. Nat. Medicina. 23, 945–953
15. Ma, L., Chou, JW, Snipes, JA, Bharadwaj, MS, Craddock, AL, Cheng, D., Weckerle, A., Petrovic, S., Hicks, PJ, Hemal, AK, Hawkins, GA, Miller, LD, Molina, AJ, Langefeld, CD, Murea, M., et al. (2017) Las variantes de riesgo renal APOL1 inducen disfunción mitocondrial. Mermelada. Soc. nefrol. 28, 1093-1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z. y Hu, CA (2008) Apolipoprotein L1, a novel Bcl-2 homology domain {{4 }}solo proteína de unión a lípidos, induce la muerte celular autofágica. J. Biol. química 283, 21540–21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G. y Cullis, PR (1985) Producción de vesículas unilamelares grandes mediante un procedimiento de extrusión rápida: Caracterización de la distribución de tamaños, volumen atrapado y capacidad para mantener un potencial de membrana. bioquimica Biografía. Acta 812, 55–65
18. Olson, F., Hunt, CA, Szoka, FC, Vail, WJ y Papahadjopoulos, D. (1979) Preparación de liposomas de distribución de tamaño definida por extrusión a través de membranas de policarbonato. bioquimica Biografía. Acta 557, 9–23
19. Armitage, P. (1971) Statistical Methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Reino Unido