¿Cómo usar la fórmula tonificante renal para proteger el daño oxidativo de las células MES23.5?

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Yihui Xu,¹weilin,²Shuifen Ye,³huajin wang,⁴wang tinting,⁵youyan su, ⁵Liang Ning Wu,⁶Yuan Wang Wang,⁷qian xu,⁵Chuan Shan Xu,⁸y Jing Cai 5 , *

Resumen

Daño oxidativojuega un papel fundamental en la etiología de los trastornos neurodegenerativos, incluida la enfermedad de Parkinson (EP). En nuestro estudio, un antiguo chinotonificante renalSe investigó la fórmula, que consta de Cistanche, Epimedii y Polygonatum cirrhifolium, para proteger las neuronas dopaminérgicas MES23.5 contra el peróxido de hidrógeno (H2O2-) inducidodaño oxidativo. Los efectos nocivos del H2O2 sobreCélulas MES23.5y los efectos protectores de KTF contraoxidativoel estrés se evaluó mediante ensayo MTT, microscopía electrónica de transmisión (TEM), inmunocitoquímica (ICC), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) e inmunotransferencia. Los resultados mostraron que la viabilidad celular se redujo drásticamente después de una exposición de 12 h a 150 μM H2O2. La observación de TEM encontró que el H2O2-tratadoCélulas MES23.5presentó daño en los organelos celulares. Sin embargo, cuando las células se incubaron con KTF (3,125, 6,25 y 12,5 ug/ml) durante 24 h después de la exposición al H2O2, se observó un efecto protector significativo contra el daño inducido por el H2O2-enCélulas MES23.5. Usando ICC, encontramos que KTF inhibía la reducción de la tirosina hidroxilasa (TH) inducida por H2O2, regulaba al alza la expresión de ARNm y proteínas de HO-1, CAT y GPx-1, y reducía la expresión de caspasa 3. Estos resultados indicaron que KTF puede proporcionar protección neuronal contra el daño celular inducido por H2O2-mediante la mejoraoxidativoestrés, y nuestros hallazgos proporcionan una nueva estrategia potencial para la prevención y el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

BENEFICIO DE LA CITANCHE:tratamiento de la enfermedad de Parkinson

1. Introducción

Las enfermedades neurodegenerativas se han convertido recientemente en un importante problema de salud pública. La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. Aunque la causa de la EP aún no se ha aclarado, varias líneas de evidencia sugieren fuertemente quedaño oxidativoy la disfunción mitocondrial juegan un papel importante en los mecanismos patológicos de la EP [1-3]. AumentóoxidativoEl estrés resulta de un desequilibrio entreoxidativoproductos tales como especies reactivas de oxígeno (ROS) y moléculas antioxidantes en la célula [4]. Mejorar la capacidad antioxidante de las células cerebrales se ha convertido en una estrategia eficaz para proteger las células nerviosas contra el daño por estrés oxidativo.

La EP es una enfermedad difícil de tratar que amenaza a los ancianos en todo el mundo. Los fármacos terapéuticos actuales tienen una eficacia limitada con efectos secundarios graves. Las hierbas y fórmulas chinas tradicionales se han utilizado ampliamente en la medicina popular para tratar enfermedades neurodegenerativas, incluida la EP, durante mucho tiempo. Según la teoría de la medicina china, la deficiencia de lariñónes el principal mecanismo patológico de la EP. Cistanche deserticola YC Ma, una especie de Cistanche que pertenece a la familia Orobanchaceae, es una hierba muy conocida en la medicina tradicional china con los llamadostonificante renaleficacia y se utiliza para el tratamiento deriñóninfertilidad femenina, leucorrea mórbida, neurastenia y estreñimiento senil [5]. Se ha informado que los glucósidos totales de Cistanche ejercen efectos protectores sobre las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra en modelos de ratones y células de EP [6, 7]. Además, se ha documentado que los ingredientes activos de Cistanche poseen un efecto neuroprotector al mejorar la capacidad antioxidante e inhibir la apoptosis de las neuronas [8–15]. Herba Epimedii es también un tradicionaltonificante renalHierba china con actividad significativamente antioxidante, que se utiliza ampliamente en el tratamiento de la osteoporosis y las enfermedades cardiovasculares y en la mejora de las funciones sexuales y neurológicas [16]. Polygonatum sibiricum a menudo se emplea como asistente para mejorar la eficacia de la droga monarca y la droga ministro en la fórmula tradicional china. Un informe reciente mostró que los extractos de agua de Polygonatum sibiricum son antioxidantes naturales.

Basado en estos beneficios de los antiguos chinostonificante renalfórmula (KTF) que consta de Cistanche, Epimedii y Polygonatum cirrhifolium, planteamos la hipótesis de que KTF podría proteger las neuronas dopaminérgicas MES23.5 contra el peróxido de hidrógeno (H2O2-) inducidodaño oxidativo. Aquí, como prueba de concepto, llevamos a cabo una serie de experimentos para examinar los efectos de KTF en la muerte celular y la expresión de enzimas antioxidantes en el H2O2-tratadoCélulas MES23.5.

La fórmula tonificante renal puede proteger el daño oxidativo de las células MES23.5

2. Materiales y métodos

2.1. Sustancias químicas y reactivos

Los anticuerpos HO-1, CAT, caspasa 3 y -actina se obtuvieron de Cell Signaling Technology Inc. (Boston, EE. UU.). El anticuerpo GPx-1 era de Abcam (Cambridge Science Park, Reino Unido). La antitirosina hidroxilasa de conejo era de Boster (BA1454, China). La IgG1 anti-conejo de cabra conjugada con un marcador de peroxidasa de rábano picante era de Santa Cruz Biotechnology Inc. (California, EE. UU.). El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) se adquirió de GIBCO BRL Co. Ltd. (Gaithersburg, MD, EE. UU.). Todos los demás reactivos, a menos que se indique lo contrario, fueron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit fue de Fermentas Inc. (Burlington, EE. UU.). DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) era de Fermentas Inc. (Burlington, EE. UU.). Bio DL100 era de BioFlux (Tokio, Japón). Polink-2 más el sistema de detección de polímero HRP para anticuerpos primarios de conejo (PV-9001) y DAB (tetrahidrocloruro de 3,3′-diaminobencidina) (ZLI-9032) fueron de ZSGB-BIO (Beijing, Porcelana). Los kits ELISA para medir CAT, GPx-1 y GSH eran de Hufeng Biotechnology Inc. (Shanghai, China). Los extractos de ginkgo biloba (GE) procedían de Shanghai Sine Promod Pharmaceutical Co., Ltd. (Shanghai, China).

2.2. Elaboración y Estandarización de Fórmula Tonificante Renal

los componentes de latonificante renalfórmula, Cistanche deserticola, Epimedium brevicornum y Polygonatum sibiricum, fueron suministrados por el Second Affiliated People's Hospital, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, y cuidadosamente autenticados de acuerdo con la farmacopea china (The Pharmacopoeia Commission of China, 2005). Para preparar las muestras de KTF, Cistanche deserticola, Epimedium brevicornum y Polygonatum sibiricum en una proporción de peso de 1: 1: 1,2 se mezclaron y molieron en polvo y luego se sumergieron en un volumen total de 10 veces (p/v) de agua destilada durante 1 h y se hierve durante 2 h. Después de filtrar la solución, se recogió el filtrado. Todo el residuo se recogió y se hirvió adicionalmente con un volumen total de 8 veces (p/v) de agua destilada durante 2 h. La solución se filtró y los dos filtrados se combinaron, concentraron y liofilizaron. El rendimiento del extracto seco final fue del 25 por ciento (p/p) de las materias primas herbarias iniciales y se almacenó a -20 grados hasta su uso. La solución madre de KTF (10 mg/ml) se preparó disolviendo KTF en una solución tampón de fosfato (PBS), seguido de sonicación, esterilización a 100 grados y filtración.

2.3. Cultivo celular y tratamiento con H2O2

Células MES23.5fueron cultivadas y expuestas a H2O2 como se describe en nuestro artículo anterior [10]. Brevemente,Células MES23.5se cultivaron en medio DMEM/F12 (GIBCO BRL Co. Ltd., Gaithersburg, MD, EE. UU.) que contenía 5 por ciento (vol/vol) de FBS (GIBCO BRL Co. Ltd., Gaithersburg, MD, EE. UU.), 1{{12} }0 U penicilina/estreptomicina, L-glutamina 2 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE. UU.) y Sato's (50 × Sato's: insulina 25 mg; transferencia 25 mg; ácido pirúvico, 243 mg; putrescina 20 mg; 1 mg/ml de selenato de sodio, 25 ul; 0,315 mg/ml de progesterona) a 37 grados con 5 por ciento de CO2. crecido durante la nocheCélulas MES23.5se incubaron adicionalmente con H2O2 150 μM durante 12 h.

2.4. Tratamiento KTF

Células MES23.5se dividieron aleatoriamente en grupo de control (medio de cultivo fresco), grupo H2O2 (medio de cultivo H2O2), grupo de extracto de Ginkgo biloba (GE) (medio de cultivo H2O2 y GE) y grupos KTF que incluyen la dosis baja de tratamiento KTF, una dosis media de tratamiento FTF y dosis altas de tratamiento KTF.Células MES23.5en la fase logarítmica se sembraron en una placa de cultivo recubierta con poli-L-lisina (PLL) durante 24 h. Las células del grupo de control se trataron con el medio de cultivo fresco y las de todos los demás grupos se trataron con el medio de cultivo que contenía H2O2 150 μM durante 12 h. Las células del grupo GE se trataron con el medio de cultivo que contenía 12,5 ug/ml de GE, y las del grupo de KTF de dosis baja, el grupo de KTF de dosis media y el grupo de KTF de dosis alta se trataron con KTF a concentraciones de 3,125, 6,25, y 12,5 ug/ml durante 24 h, respectivamente.

2.5. Viabilidad celular

Después del tratamiento con KTF durante 20 horas, las células se incubaron con MTT (0,5 mg/ml) durante 4 horas a 37 grados, se retiraron cuidadosamente los medios y se agregaron 150 μl de DMSO a cada pocillo. Los cristales de formazán se disolvieron durante 10 min y se midió la absorbancia a 490 nm. La densidad óptica (DO) de cada pocillo se midió mediante espectrofotómetro (BIO-TEK ELX 800, BioTek Instruments Inc., Vermont, EE. UU.). Se usó medio de cultivo celular fresco como control negativo.

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2.6. Observación de morfología ultraestructural

Después del tratamiento con KTF durante 24 h, las células se recolectaron, suspendieron y fijaron con glutaraldehído al 3 por ciento en una solución de paraformaldehído al 1,5 por ciento (pH 7,3) a 4 grados durante 24 h. Luego, las suspensiones celulares se enjuagaron dos veces con PBS y se posfijaron con ácido ósmico al 1 por ciento y solución de hexacianoferrato (II) de potasio al 1,5 por ciento (pH 7,3) y se incubaron a 4 grados durante 2 h; luego, las suspensiones celulares se deshidrataron en una serie graduada de alcohol durante 5 minutos cada una. Los gránulos deshidratados se embebieron tres veces con óxido de propileno durante 1 hora y se infiltraron con una mezcla de resina/óxido de propileno en una proporción de 1:1 durante 2 horas y luego con resina durante 12 horas a temperatura ambiente. La inclusión se realizó con resina epoxi 618 y Araldite y la polimerización se realizó a 60 grados durante 48 h. Finalmente, las secciones ultrafinas (80 nm) se tiñeron con acetato de uranilo y se contrastaron con citrato de plomo durante 5 min. Las células teñidas se examinaron con el microscopio electrónico de transmisión H7650 (Hitachi, Japón).

2.7. Ensayo inmunocitoquímico de tirosina hidroxilasa (TH)

Después del tratamiento con KTF durante 24 h, las células se lavaron dos veces durante 2 min con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 min. Las células fijadas se lavaron 3 veces y luego se trataron con 0,5 por ciento de Triton X-100 durante 20 min. Posteriormente, las células se lavaron 3 veces y se trataron con H2O2 al 3 por ciento durante 10 min. Las células tratadas con H2O2- se lavaron 3 veces y luego se secaron con suero de cabra durante 20 min. Después de la transferencia, se añadió anti-TH de conejo (1:400) a cada muestra a 4 grados durante la noche. A continuación, las muestras se lavaron 3 veces y se trataron con Polymer Helper durante 20 min. Después del tratamiento con polímero, las células se lavaron 3 veces y se trataron con poli-HRP anti-IgG de conejo durante 20 min. Las células se lavaron 3 veces y se trataron con DAB durante 3 min. Finalmente, las muestras se lavaron con agua corriente y se trataron con contratinción de hematoxilina durante 1 min y luego se lavaron con agua corriente y se sellaron con medio de montaje primordial.

2.8. Medición de Enzimas Antioxidantes por ELISA

Después del tratamiento con KTF durante 24 h, se midió el nivel de actividad de CAT intracelular, GPx-1 y GSH utilizando un kit ELISA (Hufeng Biotechnology Inc., Shanghái, China) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 100 μL de sobrenadante homogeneizado del lisado de las células tratadas a los pocillos de ELISA y luego se incubaron a 37 grados durante 30 min. Después de lavarse cinco veces y secarse, se añadieron 50 μL de solución de trabajo de anticuerpo marcado con enzima a cada pocillo (tubo de control esperado). La solución resultante se incubó durante 30 min a 37 grados y se lavó cinco veces y se secó. Se añadió solución de trabajo de sustrato (150 μL) a cada pocillo y se incubó durante 15 min a 37 grados. Finalmente, se agregó una solución de parada (50 μL) a cada pocillo y se determinó el valor de absorbancia a 450 nm utilizando un lector automático de ELISA (XL800, BioTex, Incorporated, Houston, TX, EE. UU.).

2.9. Análisis de Western Blot

Después del tratamiento con KTF durante 24 h, las células se lavaron con PBS helado y las proteínas se extrajeron en un tampón de lisis que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, Nonidet P al 1 %{{ 9}}, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y aprotinina 10 ug/ml. La concentración de proteínas se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific Pierce, Rockford, Illinois, EE. UU.). La proteína se separó mediante electroforesis SDS-PAGE y se transfirió a PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). El bloqueo se realizó con leche en polvo descremada al 5 por ciento; la membrana se incubó con el anticuerpo de conejo anti-rata HO-1, CAT, caspasa 3, -actina (1 : 1000, señalización celular) y anticuerpo de conejo anti-rata GPx-1 (1 : 1000 , Abcam) durante la noche a 4 grados. La membrana tratada se lavó y luego se expuso a cabra anti-IgG1 de conejo conjugada con un marcador de peroxidasa de rábano picante (1: 5000, Santa Cruz, EE. UU.) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de cinco lavados más, se visualizó la reactividad cruzada usando reactivos de detección de transferencia Western de electroquimioluminiscencia (ECL) y se analizó usando densitometría de barrido en un sistema de imagen (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.).

2.10. Análisis de RT-PCR

Los cebadores de PCR de HO-1, CAT, GPx-1 y -actina se adquirieron de Sangon Biotech Co. Ltd. (Shanghai, China). Después del tratamiento con KTF durante 24 h, se aisló el ARN total de las células utilizando el reactivo Trizol según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa (RT) se realizó utilizando el sistema de transcripción inversa AMV (Fermentas, Burlington, EE. UU.). El fragmento de ADNc y la actina se amplificaron utilizando el kit Green PCR master MIX (Fermentas, Burlington, EE. UU.). El ADN se amplificó inmediatamente con un solo ciclo a 94 grados durante 5 min y 30 ciclos a 94 grados durante 30 s y 58 grados durante 30 s y 72 grados durante 30 s para actina, y se realizó un paso de extensión final a 72 grados durante 10 minutos. Los geles teñidos con bromuro de etidio se escanearon y calificaron utilizando el software Tanon Image. La intensidad de cada banda se normalizó frente a la intensidad de -actina.

2.11. Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con SPSS 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Todos los datos se mostraron como media ± SD (desviación estándar), y la significación estadística de la diferencia se realizó mediante ANOVA unidireccional y LSD (desviación estándar lineal). Se consideró que una diferencia era significativa en P <>

La fórmula tonificante renal puede proteger el daño oxidativo de las células MES23.5

3. Resultados

3.1. Los efectos dañinos del H2O2 en las células MES23.5 y los efectos protectores de KTF contra el estrés oxidativo

Como se muestra en la Figura 1(a), el H2O2 exhibió una inhibición dependiente de la dosis y el tiempo en la viabilidad de las células neuronales dopaminérgicas MES23.5. Después de 12 h de exposición a H2O2 50 μM, se observó una pérdida significativa de viabilidad celular, y la pérdida de viabilidad celular aumentó gradualmente con el aumento de la dosis de H2O2 a 150 μM. Sin embargo, aumentar aún más la dosis de H2O2 de 200 a 500 μM no resultó en una pérdida significativamente mayor de viabilidad celular. ExtensiónCélulas MES23.5la exposición a H2O2 de 12 h a 24 h y 48 h aumentó la pérdida de viabilidad celular a concentraciones más bajas de H2O2. Se observó una pérdida significativa de la viabilidad de las células MES23.5 después de 24 h de exposición a 25 μM H2O2 y 48 h de exposición a 12,5 μM H2O2. Se observó una pérdida de viabilidad celular dependiente del tiempo en todas las concentraciones de H2O2 analizadas.

Figura 1 Los efectos dañinos del H2O2 enCélulas MES23.5y los efectos protectores de KTF contraoxidativoel estrés se evaluó utilizando el ensayo MTT. (a) Efectos de diferentes concentraciones de tratamiento con H2O2 sobre el daño celular. Las células MES23.5 se trataron con 12,5, 25, 50, 100, 150, 200, 300, 400 y 500 μMol/L H2O2 durante 12, 24 y 48 h. (b) Efectos protectores de diferentes concentraciones de tratamiento con KTF sobre el daño celular inducido por H2O2-. El tratamiento de KTF resultó en un aumento de la viabilidad de las células MES23.5 después de la adición de H2O2.Células MES23.5se incubaron con GE (12,5 ug/ml) o KTF (3,125, 6,25, 12,5 ug/ml) durante 24 h después de la adición de H2O2. La viabilidad celular se midió con MTT. Los datos se expresan como media ± SD (desviación estándar) en tres experimentos independientes. #P < 0.05="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="" control.="" ∗p="">< 0,05="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" tratado="" con="">

ExposiciónCélulas MES23.5a KTF solo no tuvo un efecto citotóxico significativo incluso cuando la concentración de KTF fue de hasta 100 ug/ml. Las células MES23.5 cocultivadas con H2O2 150 μM durante 12 h provocaron una pérdida de viabilidad celular del 46,76 %. El efecto citotóxico del H2O2 en las células MES23.5 se atenuó significativamente con el tratamiento con KTF durante 24 h (Figura 1(b)). Viabilidad aumentada del H2O2 tratadoCélulas MES23.5se restauró al 95,86 por ciento ± 7,18 por ciento, 96,49 por ciento ± 15,07 por ciento y 99,04 por ciento ± 10,57 por ciento mediante tratamiento con KTF a concentraciones de 3,125, 6,25 y 12,5 ug/ml, respectivamente.

TEM mostró que las células normales en el grupo de control exhibieron una forma ovalada con una membrana celular intacta que tiene muchas corrugaciones y estructuras similares a microvellosidades. El núcleo celular era elíptico en el centro con un solo nucléolo y tenía eucromatina normal y heterocromatina dispersa. Las mitocondrias exhibieron varillas o elípticas, dispersas y con crestas mitocondriales normales. El retículo endoplásmico rugoso estaba bien desarrollado y no presentaba desgranulación evidente (Figura 2(a)). Sin embargo, las células tratadas con H2O2 presentaron características típicasdaño oxidativocon núcleos más pequeños e irregulares y mitocondrias hinchadas. Se encontró desgranulación evidente en el retículo endoplásmico rugoso (Figura 2(b)). En las células tratadas por KTF mejoró H2O2-inducidodaño oxidativo, las mitocondrias exhibieron varillas o elípticas, dispersas y con más crestas mitocondriales. El retículo endoplásmico rugoso no tenía una desgranulación evidente (Figuras 2(d), 2(e) y 2(f)).

Figura 2 Efecto de KTF sobre la ultraestructura celular en H2O2-inducidaCélulas MES23.5. La ultraestructura celular se observó bajo TEM. Morfología normal del citoplasma, orgánulos celulares en el grupo de control ((a), ×15,000), morfología ultraestructural característica dedaño oxidativoen el grupo tratado con H2O2-((b), ×15,000), grupo de tratamiento con KTF (3,125, 6,25 y 12,5 ug/ml, respectivamente) ((d), (e), (f), ×15,000), o extracto de Ginkgo (12,5 ug/ml) ((c), ×15,000).

3.2. Aumento de la expresión de TH en células MES23.5 después del tratamiento con KTF

La TH es una enzima catalizadora fundamental en la conversión del aminoácido L-tirosina en L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), que es el precursor de los neurotransmisores dopamina. La expresión normal de TH es la marca de las neuronas activas. Por lo tanto, comparamos la expresión de TH en el H2O2-incubadoCélulas MES23.5con o sin seguimiento del tratamiento con KTF por inmunohistoquímica. El resultado mostró que H2O2 disminuyó la expresión de TH en las células MES23.5, y después del tratamiento con KTF podría mejorar significativamente la expresión de TH (Figura 3). Esto indica que el tratamiento con KTF pudo restaurar la función de las células MES23.5 tratadas con H2O2-.

Figura 3 KTF mejoró la reducción de TH inducida por H2O2-enCélulas MES23.5. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4 por ciento y la expresión de TH se detectó mediante inmunocitoquímica. (a) Tan representa la expresión positiva de TH (×400). (b) Control negativo. (c) Los resultados se expresan como un grado de gris promedio. Los datos son la media ± SD en tres experimentos independientes. #P < 0,05="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="" control.="" ∗p="">< 0,05="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" tratado="" con="">

3.3. Activación de caspasa 3 inducida por H2O2-suprimida por KTF en células MES23.5

Para investigar más a fondo el mecanismo del daño celular MES23.5, evaluamos la expresión del factor de proapoptosis caspasa 3 mediante inmunotransferencia. El resultado mostró que el tratamiento con H2O2 reguló marcadamente a la baja la expresión de procaspasa 3 y aumentó la expresión de caspasa 3. Por el contrario, el tratamiento con KTF restableció el equilibrio de procaspasa 3 y caspasa 3 al aumentar las expresiones de procaspasa 3 y disminuir la expresión de caspasa 3 (Figura 4 ). Estos hallazgos demuestran que el tratamiento con KTF inhibía eficazmente las activaciones de caspasa 3.

Figura 4 Efecto de KTF sobre la expresión proteica de caspasa 3 en H2O2-inducidaCélulas MES23.5. ( a ) La expresión de proteína de caspasa 3 se determinó con western blot y se cuantificó en ( b ). Los datos se expresan como media ± DE en tres experimentos independientes. #P < 0.05="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="" control.="" ∗p="">< 0,05="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" tratado="" con="" h2o2="">

3.4. Aumento de la expresión de enzimas antioxidantes en células MES23.5 por tratamiento con KTF

El ensayo ELISA reveló que CAT, GPx-1 y GSH intracelulares estaban regulados a la baja después del tratamiento con H2O2 150 μM en células MES23.5. Es de destacar que, después del tratamiento de KTF, se restauró la expresión intracelular de CAT, GPx-1 y GSH. El análisis de RT-PCR indicó que el tratamiento con H2O2 reducía la expresión de ARNm de CAT y GPx-1; sin embargo, el tratamiento con KTF restauró las expresiones de ARNm de CAT y GPx-1 enCélulas MES23.5. La inmunotransferencia con anticuerpos específicos también confirmó que la expresión de proteínas CAT y GPx-1 enCélulas MES23.5fueron regulados a la baja por el tratamiento con H2O2, y el tratamiento con KTF pudo restaurar la expresión de proteínas CAT y GPx-1. Además, la expresión del ARNm deoxidativoLa proteína que responde al estrés HO-1 también se inhibió después del tratamiento con H2O2 y luego se restableció siguiendo el tratamiento con KTF. La inmunotransferencia también demostró que la expresión de la proteína HO-1 estaba marcadamente regulada a la baja por el H2O2, pero el tratamiento con KTF pudo restaurar la expresión de la proteína HO-1. Como era de esperar, la concentración de KTF más alta utilizada en nuestra investigación tiene el mejor efecto en la restauración de la expresión de CAT, GPx-1, GSH y HO-1 (Figuras (Figuras 55 y 6).6). En conjunto, los resultados obtenidos demuestran que el tratamiento con KTF aumentó significativamente los sustratos antioxidantes en las células MES23.3 tratadas con H2O2-.

Figura 5 Efecto de KTF en el nivel de CAT intracelular, GPx-1 y GSH en H2O2-inducidaCélulas MES23.5. El nivel de actividad de CAT intracelular, GPx{{0}} y GSH se midieron usando un kit ELISA. Los datos se expresan como media ± DE en tres experimentos independientes. #P < 0.05="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="" control.="" ∗p="">< 0,05="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" tratado="" con="">

Figura 6 KTF aumentó la expresión de proteína y ARNm de enzimas antioxidantes en H2O2-inducidaCélulas MES23.5. (a) Las expresiones proteicas de HO{{0}}, CAT y GPx-1 se determinaron con Western blot y se cuantificaron en (c). (b) Las expresiones de ARNm de HO-1, CAT y GPx-1 se determinaron con RT-PCR y se cuantificaron en (d). Los datos se expresan como media ± DE en tres experimentos independientes. #P < 0.05="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="" control.="" ∗p="">< 0,05="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" tratado="" con="" h2o2="">

4. Discusión

Como un componente importante del sistema redox, ROS juega un papel importante en la regulación de la función celular. Los niveles moderados de ROS pueden funcionar como señales para promover la proliferación y supervivencia celular. En condiciones fisiológicas, el equilibrio entre la generación y la eliminación de ROS mantiene la función adecuada del sistema de señalización sensible a redox. La homeostasis redox puede verse interrumpida por un aumento en la producción de ROS o una disminución de la capacidad de eliminación de ROS, lo que lleva a un aumento general enoxidativoestrés [17, 18], causando posteriormente un daño irreversible de la estructura intracelular e induciendo la muerte celular.

El alto consumo de O2 en el cerebro conduce a la acumulación de ROS; por lo tanto, las neuronas son particularmente vulnerables al ataque deoxidativoestrés. Las investigaciones post mortem han demostrado la peroxidación de lípidos ydaño oxidativoa las células cerebrales en pacientes con EP [19]. Estudios crecientes confirman quedaño oxidativojuega un papel fundamental en la patogenia de las enfermedades degenerativas de las neuronas, como la EA, la EP, la EH y la ELA [18, 20]. En el presente estudio, se observó una pérdida significativa de viabilidad celular en células neuronales dopaminérgicas MES23.5 después de la exposición a H2O2 50 μM durante 12 h, H2O2 25 μM durante 24 h o H2O2 12,5 μM durante 48 h. Como se muestra en la observación de la morfología, las células expuestas durante 12 h a H2O2 150 μM exhibieron una lesión oxidativa típica que incluye múltiples vacuolas membranosas en el citoplasma, alteración del retículo endoplásmico y la mitocondria, y condensación de eucromatina en el núcleo celular.

Según la teoría de la medicina china, la deficiencia de lariñónes el principal mecanismo patológico de la EP. Vigorizando elriñónes una estrategia importante en el tratamiento de la EP. En el presente estudio, encontramos que el tradicionaltonificante renalfórmula KTF, que consta de Cistanche, Epimedii y Polygonatum sibiricum, mejoró significativamente la viabilidad celular y la expresión de TH de H2O2-tratadoCélulas MES23.5.

La apoptosis celular es un modo de muerte celular programada ante diversos estímulos que activan vías extrínsecas o intrínsecas. Las proteasas específicas de aspartato de cisteinilo (caspasas) están altamente conservadas en organismos multicelulares y funcionan como reguladores centrales de la apoptosis. La activación de caspasas es el eje principal de todos los eventos de apoptosis. Entre esas caspasas, la caspasa 3 se ha identificado como un mediador clave e indicador de la apoptosis celular. Al igual que otras caspasas, la caspasa 3 suele existir como una proenzima inactiva (procaspasa 3). Después del procesamiento proteolítico, producirá dos subunidades que pueden dimerizarse para formar caspasa 3 activa, provocando posteriormente muchos de los cambios bioquímicos y biofísicos para inducir la apoptosis celular [21]. Nuestro presente estudio reveló que el tratamiento con H2O2 aumentó significativamente la caspasa 3, pero esta tendencia se revirtió con el tratamiento con KTF enCélulas MES23.5, lo que indica que KTF redujo la apoptosis celular de las células MES23.5 tratadas con H2O2-.

Las enzimas antioxidantes, como la superóxido dismutasa (SOD), CAT, GPx-1, GSH y HO-1, son importantes mecanismos de defensa de las células contraoxidativoestrés. Como enzima antioxidante, la SOD puede transformar los radicales superóxido en peróxido de hidrógeno, que posteriormente se convierte en H2O mediante CAT y GPx [22]. GSH es también un importante antioxidante. La conversión catalítica de glutatión reducido (GSH) a glutatión oxidado (GSSG) por GPx es útil para convertir H2O2 en O2. Se ha informado que la actividad del antioxidante disminuyó en ratones modelo PD [23–25]. Por lo tanto, los fármacos que regulan la expresión de antioxidantes enzimáticos pueden servir como candidatos potenciales para el tratamiento de la EP. Nuestros datos mostraron que el tratamiento con H2O2 suprimió CAT, GPx, GSH y HO-1 enCélulas MES23.5, mientras que el tratamiento con KTF a diferentes concentraciones restauró de forma eficaz la expresión de CAT, GPx, GSH y HO-1.

En conclusión, nuestros hallazgos demuestran que la hierba china tradicionaltonificante renalLa formulación, que consiste en Cistanche, Epimedii y Polygonatum sibiricum, tiene una fuerte capacidad antioxidante y efectos neuroprotectores significativos. Este estudio proporciona una pista para desarrollar eltonificante renalformulación como agente terapéutico potencial para prevenir y tratar la enfermedad de Parkinson.

La fórmula tonificante renal puede proteger el daño oxidativo de las células MES23.5

Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado por el Fondo Científico de la Comisión Nacional de Salud y Planificación Familiar de la República Popular China (WKJ-FJ-38), el Fondo de Desarrollo de Medicina Integrativa Chen Keji (CKJ2014012) y el Fondo de Disciplinas Clave ( X2014010-terremoto). Los autores expresan su más sincero agradecimiento a la señorita Xin Pan por su valiosa ayuda.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

Contribuciones de los autores

Yihui Xu y Wei Lin comparten la misma contribución al artículo. Chuanshan Xu es el autor correspondiente.

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