Seguimiento a largo plazo de la inmunidad específica contra Mycoplasma Hyopneumoniae en cerdos vacunados

Abstracto

Mycoplasma hipopnea mobile es el principal agente de neumonía enzoótica en cerdos. Para minimizar las pérdidas económicas causadas por esta enfermedad, se practica habitualmente la vacunación móvil contra M. hipopnea. Sin embargo, aún no se ha investigado la persistencia de la inmunidad inducida por la vacuna de M. hyopneumoniae, especialmente la inmunidad mediada por células, hasta el momento del sacrificio. Por lo tanto, en dos granjas comerciales, 25 cerdos (n=50) recibieron una bacterina comercial por vía intramuscular a los 16 días de edad. Cada mes, se analizó la presencia de anticuerpos séricos específicos de M. hyopneumoniae y se evaluó la proliferación de la producción de TNF-, IFN- e IL-17A por diferentes subconjuntos de células T en la sangre mediante ensayos de recuerdo. En ambas granjas se asumió una infección natural por M. hyopneumoniae. Sin embargo, los cerdos estudiados siguieron siendo negativos a M. hyopneumoniae durante casi todo el ensayo. No se observó seroconversión después de la vacunación y todos los cerdos se volvieron seronegativos a los dos meses de edad. La cinética de las frecuencias del subconjunto de células T fue similar en ambas granjas. Se encontraron células T CD4+CD8+ productoras de citoquinas específicas de Mycoplasma hipopnea en la sangre de cerdos de ambas granjas al mes de edad, pero disminuyeron significativamente a medida que aumentaba la edad. Por otro lado, se observó proliferación de células T tras la estimulación in vitro de M. hyopneumoniae hasta el final del periodo de engorde. Además, no se observaron diferencias en las respuestas inmunes humorales y mediadas por células después de la vacunación con M. hyopneumoniae entre cerdos con y sin anticuerpos maternos. Este estudio documenta las respuestas inmunes a largo plazo inducidas por la vacuna móvil de M. hipopnea en cerdos de engorde en condiciones de campo. Se justifica realizar más investigaciones para investigar la influencia de una infección natural en estas respuestas.

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Palabras clave

Mycoplasma hyopneumoniae, cerdos, estudio longitudinal, inmunidad inducida por vacuna, inmunidad mediada por células

Introducción

Uno de los patógenos respiratorios más importantes en los cerdos es Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae). Es el principal agente de neumonía enzoótica, endémico presente en la mayoría de las granjas y responsable de importantes pérdidas económicas en la producción porcina en todo el mundo [1, 2]. La vacunación es la práctica de manejo más comúnmente utilizada para controlar M. hyopneumoniae, ya que puede minimizar los signos clínicos y las pérdidas de rendimiento, y reducir los costos del tratamiento [3]. El objetivo de la vacunación contra M. hyopneumoniae es generar respuestas inmunitarias específicas del patógeno que respondan rápida y eficazmente a una infección natural por M. hyopneumoniae. La mayoría de las vacunas contra M. hyopneumoniae disponibles comercialmente para cerdos están registradas para su administración entre una y tres semanas de edad [4]. El inicio de la inmunidad específica de los móviles de M. hipopnea varía de una a cuatro semanas y tiene como objetivo proteger contra infecciones durante todo el período de engorde, hasta el sacrificio [4]. En general, la vacunación o infección de los cerdos desencadena la diferenciación de las células B de memoria y las células T CD4+CD8+, lo que garantiza una rápida respuesta inmune mediada por células y anticuerpos después de un segundo contacto con el patógeno [5]. . La vacunación contra M. hyopneumoniae puede provocar seroconversión y un aumento de anticuerpos específicos de M. hyopneumoniae localmente en el tracto respiratorio [6–9]. En animales vacunados, se observaron niveles más altos de linfocitos productores de IFN- -junto con una mayor tasa de proliferación de linfocitos después de la estimulación in vitro con M. hyopneumoniae en comparación con animales no vacunados [9-11]. Además, se encontraron células T CD4+CD8− y CD4−CD8+ polifuncionales, que producen INF- y TNF-, después de la vacunación con M. hyopneumoniae [12]. Sin embargo, no está completamente claro cuánto tiempo persiste la inmunidad inducida por la vacuna específica de móviles de M. hipopnea. En la mayoría de los estudios de eficacia de la vacuna contra M. hyopneumoniae, los cerdos ya son desafiados unas semanas después de la vacunación para investigar la tos, los parámetros inmunológicos, la carga de patógenos y las lesiones pulmonares [13-16]. Cuando se estudió la eficacia a largo plazo, principalmente en ensayos de campo, a menudo sólo se examinaron los parámetros de producción y las lesiones pulmonares en el sacrificio y los parámetros inmunológicos no se investigaron o se investigaron de manera deficiente [17-20]. Hasta donde sabemos, aún no se ha investigado la inmunidad mediada por células inducida por la vacuna específica de M. hyopneumoniae desde el momento de la vacunación hasta el sacrificio en condiciones de campo. Además de la vacunación de los lechones, la vacunación con M. hyopneumoniae de las primerizas reproductoras es una práctica de aclimatación comúnmente utilizada [21]. Después de la vacunación de animales reproductores están presentes CD4+CD8+ productoras de citocinas específicas de Mycoplasma hyopneumoniae y células T CD4-CD8-polifuncionales y polifuncionales [22]. Los lechones que amamantan el calostro de cerdas inmunizadas tienen altos niveles de anticuerpos maternos (MDA) específicos de M. hyopneumoniae e inmunidad mediada por células en su sangre que pueden persistir hasta el destete o incluso más [7, 22, 23]. Cuando los lechones se vacunan contra M. hyopneumoniae en presencia de (altos niveles de) MDA, a menudo falta seroconversión [24-26]. Sin embargo, la respuesta de proliferación de linfocitos después de la estimulación in vitro fue significativamente mayor en lechones vacunados con M. hyopneumoniae en comparación con lechones no vacunados, independientemente de los niveles de MDA [26]. Aunque estos autores demostraron que la inmunidad mediada por células se preparó con la vacunación con M. hyopneumoniae en presencia de altos niveles de MDA, se necesita una mayor diferenciación de los subconjuntos de células T y su producción de citoquinas para obtener mejores conocimientos sobre estas respuestas inmunes mediadas por células. y, finalmente, la influencia de una infección natural en estas respuestas. El objetivo del presente estudio fue investigar las respuestas inmunes humorales y mediadas por células tras la vacunación con M. hyopneumoniae en cerdos en dos granjas comerciales. Para ello, se controlaron los anticuerpos séricos y la proliferación y producción de citocinas por diferentes subconjuntos de células T desde el momento de la vacunación a los 16 días de edad hasta la edad de sacrificio. También se investigó la posible influencia de la inmunidad materna específica de M. hyopneumoniae sobre las respuestas humorales y celulares a las vacunas en lechones.

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Materiales y métodos

Descripción del rebaño y selección de animales.

Two commercial farrow-to-finish farms were included in the study based on the willingness of the farmer to participate. On both farms, circulation of M. hyopneumoniae was assumed based on the presence of the pathogen in tracheobronchial swabs (TBS) taken from fattening pigs in the past. Danbred breeding gilts were reared on farm A and purchased on farm B. On-farm A, the breeding gilts were vaccinated once against M. hyopneumoniae four weeks before first insemination with Ingelvac MycoFLEX® (Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, Germany). On-farm B, breeding gilts were vaccinated with Stellamune® Mycoplasma (Elanco, Utrecht, The Netherlands) at six months of age upon arrival at the farm and a second time four weeks later. Furthermore, on-farm B gilts were also booster-vaccinated twice shortly before farrowing. On both farms, sows were not vaccinated against M. hyopneumoniae. Farm A practiced a 5-week batch-farrowing system and piglets were weaned and moved to the nursery unit at approximately 22 days of age. The piglets were vaccinated at 16 days of age against M. hyopneumoniae with an inactivated whole cell J strain-based bacterin (Ingelvac MycoFLEX®, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim am Rhein, Germany), porcine circovirus type 2 (PCV2) (Ingelvac CircoFLEX®, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) (UNISTRAIN® PRRS, HIPRA, Amer, Spain). Pigs were moved to the fattening unit at 9 weeks of age. Farm B worked in a 4-week batch-farrowing system and piglets were weaned and moved to the nursery unit at approximately 22 days of age. Tey was vaccinated at 16 days of age against M. hyopneumoniae with the same vaccine as in farm A (Ingelvac MycoFLEX®, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH) and PRRSV (UNISTRAIN® PRRS, HIPRA). The piglets were moved to the fattening unit at 10 weeks of age. On both farms, five breeding animals (two gilts and three sows of mixed parity) were included in the study. The growing process was monitored by the main investigator and from each litter, five healthy piglets (birth weight>1 kg), se les hicieron muescas en las orejas y se les dio seguimiento mensual desde el nacimiento hasta el sacrificio (n=25 lechones/granja). No se permitió la crianza cruzada de lechones con muescas en las orejas y los cerdos no recibieron antibióticos activos contra M. hyopneumoniae en ambas granjas durante todo el ensayo.

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Diseño del estudio y muestreo.

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina Veterinaria y la Facultad de Ingeniería en Biociencias de la Universidad de Gante (número de aprobación 2020/31). De las cerdas se recogió el calostro durante el proceso de parto. Dentro de las 6 horas posteriores al parto, se extrajo de las cerdas un TBS (catéter de succión de 60 cm, Medinorm GmbH, Spiesen-Elversberg, Alemania) y sangre en un tubo de suero estéril (sangre coagulada). A los dos días de edad, se extrajo sangre de los lechones en tubos de suero. Desde el año hasta los seis meses de edad, cada mes se extrajo sangre de los lechones en tubos estériles de suero y EDTA (sangre no coagulada) y en un TBS. En la granja A, los cerdos fueron sacrificados a los 177 días de edad, por lo que la última muestra se tomó a los 5,5 meses de edad. En la granja B, los cerdos fueron enviados al matadero a los 191 días de edad por lo que la última muestra se tomó a los 6 meses de edad. Las muestras de calostro y suero se almacenaron a -20 grados y las muestras de TBS a -80 grados hasta su posterior análisis. La sangre no coagulada se procesó inmediatamente para el análisis de inmunidad mediada por células. PCR digital para la detección de ADN de M. hyopneumoniae Para probar la presencia de M. hyopneumoniae, se extrajo ADN de las muestras de TBS utilizando un kit comercial (DNeasy® Blood & Tissue kit, Qiagen, Venlo, Países Bajos) y una PCR digital (dPCR ) El protocolo dirigido al gen P102 se realizó siguiendo un protocolo descrito previamente [27]. Anticuerpos específicos de Mycoplasma hyopneumoniae Los anticuerpos específicos de Mycoplasma hyopneumoniae en muestras de suero y calostro se analizaron mediante un ELISA indirecto comercial (prueba M. hyo Ab, IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, ME, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se consideraron positivas si la relación muestra-positiva (S/P) era superior a 0,40 y negativas si la relación S/P era igual o inferior a 0,40.

Producción de citoquinas de células T.

A partir de sangre fresca, no coagulada, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizando un gradiente de densidad Lym phoprep™ (Stemcell technologies, Van - - couver, Canadá). El aislamiento, la estimulación y la tinción de las PBMC se realizaron como se describió anteriormente con algunas modificaciones menores [22]. Las células se estimularon durante la noche (20 h) con bacterina de cepa J de M. hyopneumoniae de fabricación propia y, para cada animal, se incluyeron un medio negativo y un control positivo de Concanavalina A (ConA). La bacterina de cepa M. hyopneumoniae J se elaboró ​​según el protocolo para la producción de bacterina M. hyopneumoniae F7.2 C [16]. Para investigar la producción de citocinas, se añadió Brefeldin A (eBioscience™, San Diego, CA, EE. UU.) a cada pocillo durante las últimas 4 h de estimulación para inhibir la secreción de proteínas. Para la tinción extracelular, las PBMC se incubaron con anticuerpos monoclonales anti-CD3 (clon PPT3), anti-CD4 (clon 74-12-4) y anti-CD8 (clon 11-295-33). A continuación, los anticuerpos secundarios correspondientes anti-ratón IgG1 APC-Cy7 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-ratón IgG2b FITC (Biolegend, San Diego, CA, EE. UU.) y anti-ratón IgG2a PE-Cy7 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) fueron agregados. Posteriormente, se realizó una etapa de bloqueo con IgG1 de ratón (10 µg/mL). Después de la tinción de la superficie, las células se fijaron y permeabilizaron, y se realizó una tinción intracelular para TNF-, IFN- e IL-17A [22]. Los datos se adquirieron con un citómetro de flujo CytoFLEX (Beckman Coulter, Bea, CA, EE. UU.) y los resultados se analizaron adicionalmente con el software CytExpert (Beckman Coulter). La jerarquía de activación se muestra en el archivo adicional 1.

Ensayo de proliferación de células T.

Las PBMC aisladas se estimularon in vitro con bacterina de cepa J de M. hyopneumoniae de fabricación propia para evaluar la proliferación de células T. El protocolo utilizado se describió en detalle en un estudio anterior [22]. Para la tinción de la superficie, las células se incubaron primero con anticuerpos monoclonales anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD8 y posteriormente con los correspondientes anticuerpos secundarios anti-IgG1 de ratón APC-Cy7 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-IgG2b de ratón FITC (Biolegend, San Diego, CA, EE. UU.) e IgG2a anti-ratón AlexaFluor 647 (Biolegend, San Diego, CA, EE. UU.) junto con yoduro de propidio. Los datos se adquirieron con un citómetro de flujo CytoFLEX y los resultados se analizaron adicionalmente con el software CytExpert. La jerarquía de activación se muestra en el archivo adicional 2.

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Análisis de datos

Statistical analyses were performed using IBM SPSS® Statistics Version 27 (IBM, Chicago, IL, USA) to compare results within farms. A descriptive analysis was performed for M. hyopneumoniae-specific antibody levels and the frequency of different T cell subsets. Kolmogorov-Smirnov and Shapiro-Wilk tests were used as tests for the normality of the residuals. For normally distributed data, repeated measures analyses of variance were used and post-hoc pairwise comparisons were made with a Bonferroni correction to assess possible differences between successive sampling moments. For not mally distributed data, a non-parametric Friedman test was used together with a Wilcoxon signed rank test with Bonferroni correction to compare the different sampling moments. Descriptive results were given to discuss whether the presence (S/P>{{0}}.40) o ausencia (S/P menor o igual a 0,40) de MDA influyó en la inmunidad humoral y mediada por células después de la vacunación de los lechones.

Resultados

En cada granja, cinco cerdos fueron excluidos durante el ensayo debido a la muerte o la pérdida de una marca en la oreja. Los datos de estos cerdos se incluyeron en el análisis hasta el último momento de muestreo correctamente documentado.

Presencia de infección natural por M. hyopneumoniae en las granjas

En la granja A, todas las muestras de TBS (de cerdas, lechones y cerdos de engorde) dieron negativo para la presencia de ADN de M. hyopneumoniae. En la granja B, todas las muestras de TBS de cerdas, lechones y cerdos de engorde dieron negativo para la presencia de ADN de M. hyopneumoniae hasta los cinco meses de edad. A los seis meses de edad, cuatro cerdos de engorde dieron positivo para M. hyopneumoniae con 300, 7, 22 y 14 organismos de M. hyopneumoniae/μL de ADN.

Persistencia de anticuerpos específicos de M. hyopneumoniae en cerdos

En ambas granjas, cuatro de cada cinco cerdas tenían anticuerpos específicos de M. hyopneumoniae en suero y calostro al momento del parto (Figuras 1A y C). Los lechones de dos días de edad que amamantaron el calostro de esas cerdas tenían anticuerpos maternos específicos de M. hyopneumoniae (MDA presente), mientras que los lechones de cerdas seronegativas también eran seronegativos (MDA ausente) (Figuras 1B y D). A pesar de la vacunación a los 16 días de edad, en ambas granjas, el nivel de anticuerpos específicos de M. hyopneumoniae en el suero de los cerdos disminuyó significativamente de los dos días de edad al mes, de un mes a dos meses y de dos meses a tres meses de edad (Figura 1E). No se observaron diferencias significativas entre los momentos de muestreo posteriores. A partir de los dos meses de edad, todos los cerdos, excepto dos de la granja A a los cuatro meses de edad, fueron seronegativos para M. hyopneumoniae. Los niveles de anticuerpos específicos de M. hyopneumoniae de lechones con MDA disminuyeron con el tiempo y a los dos meses de edad alcanzaron los mismos niveles que los de lechones sin MDA (Figura 1F).

Cinética de las frecuencias de los subconjuntos de células T en cerdos.

Durante la vida de un cerdo, la frecuencia de los diferentes subconjuntos de células T en la sangre cambia debido a la maduración del sistema inmunológico y al contacto con microorganismos [28]. Para investigar la cinética de los diferentes subconjuntos de células T, las PBMC sanguíneas del control del medio no estimulado se evaluaron mediante citometría de flujo. Al mes de edad, la frecuencia (%) promedio de células T CD4−CD8+ fue de 13,6 ± 2,8 % y 1 0.5 ± 3,4 % en cerdos de las granjas A y B, respectivamente. Esta frecuencia aumentó significativamente a los dos meses de edad en ambas granjas y volvió a disminuir significativamente a los tres meses de edad en la granja A. A partir de los tres meses de edad se mantuvo estable en la granja A, mientras que en la granja B se observó nuevamente un aumento significativo a los seis meses. meses de edad (Figura 2A). En ambas granjas, la frecuencia de células T CD4+CD8− fue más alta al mes de edad con 37,5±6,0% (granja A) y 42,3±5,9% (granja B). Esta frecuencia disminuyó significativamente a los dos meses de edad. En la finca A, la frecuencia se estabilizó a partir de los dos meses, mientras que en la finca B la disminución se produjo de manera más gradual (Figura 2B). Al mes de edad, la relación CD4/CD8 era de 2,8 (granja A) y de 4,0 (granja B). La proporción cayó a los dos meses de edad y se mantuvo por debajo de 1,0 desde los tres meses de edad en adelante en ambas granjas. La frecuencia de células T CD4-CD8- en cerdos de un mes de edad fue de 31,1 ± 7,2 % y 25,6 ± 5,4 % en las granjas A y B, respectivamente. En ambas granjas, la frecuencia se mantuvo similar a los dos meses de edad, pero aumentó significativamente después para alcanzar los niveles más altos a los cinco meses de edad (Figura 2C). La frecuencia de células T CD4+CD8+ fue más baja al mes de edad con 3,3 ± 1,1 % y 4,0 ± 1,0 % en las granjas A y B, respectivamente. Esta frecuencia aumentó significativamente a los dos meses de edad. En la granja A, permaneció estable después, mientras que en la granja B aumentó gradualmente hasta los cuatro meses de edad para disminuir nuevamente significativamente a los cinco meses de edad (Figura 2D).

Figura 1 Presencia de anticuerpos específicos de Mycoplasma hyopneumoniae en cerdas y cerdos. A, C

Figura 2 Frecuencia mensual (%) de subconjuntos de células T CD3+ en sangre de cerdos. A

Fig. 3 Persistencia de células T CD3+ proliferantes circulantes en cerdos. A, B

Proliferación de células T

Se analizaron las PBMC estimuladas por M. hipopnea moniae para investigar el porcentaje de células T en proliferación. Como se muestra en las Figuras 3A y B, las células T CD3+ proliferantes estuvieron presentes en la sangre de los cerdos en cada momento de muestreo en ambas granjas después de la estimulación in vitro con la bacterina M. hyopneumoniae, aunque los porcentajes de algunos animales fueron mayores en granja A. En la granja A, el porcentaje de células T en proliferación disminuyó significativamente a los seis meses de edad en comparación con el porcentaje a los cinco meses de edad, mientras que en la granja B, no se pudo lograr ninguna disminución o aumento significativo en el porcentaje de células T en proliferación. ser observado. Las células T CD4-CD8- fueron el subconjunto de células T CD3+ dominante que proliferaba en respuesta a la estimulación de M. hyopneumoniae en ambas granjas, seguido por el subconjunto de células T CD4+CD8- (Figuras 3 C y D).

Figura 4 Células T CD4+CD8+ circulantes específicas de Mycoplasma hyopneumoniae productoras de citoquinas en la sangre de cerdos en ambas granjas. A

Producción de citoquinas de células T.

Para obtener una mejor comprensión de la presencia y persistencia de células T específicas de M. hyopneumoniae en cerdos, se evaluó la producción de TNF-, IFN- e IL-17A por PBMC en sangre estimuladas in vitro con bacterina de M. hyopneumoniae. citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 4, en ambas granjas, las células T CD4+CD8+ estimuladas produjeron citocinas, que fueron más pronunciadas en cerdos de menor edad. El porcentaje de células T TNF- +CD4+CD8+ disminuyó significativamente en los cerdos de la granja A de uno a dos meses de edad y de dos a tres meses de edad en la granja B. A Se observó una caída significativa en las células T IFN- +CD4+CD8+ entre uno y dos meses de edad en cerdos en ambas granjas y entre dos y tres meses de edad en la granja B. El porcentaje de células T CD4+CD8+ que producen tanto TNF- como IFN- disminuyó significativamente en cerdos de uno a dos meses de edad en la granja A y de dos a tres meses en la granja B. Al mes de edad, el porcentaje de células T IL-17A+ CD4+CD8+ fue mayor en comparación con el porcentaje a los dos meses de edad, pero esta diferencia no fue estadísticamente significativa. Los cuatro animales de la granja B que dieron positivo a M. hyopneumoniae a los seis meses de edad tuvieron una producción de citoquinas similar por parte de las células T CD4+CD8+ en comparación con los animales negativos a M. hyopneumoniae. Además del subconjunto de células T CD4+CD8+, también observamos diferencias en la producción de citoquinas por parte de otros subconjuntos de células T en la granja B. La Figura 5 muestra datos de respuestas claras y diferencias significativas en la producción de citocinas por los otros subconjuntos de células T que solo ocurrieron en la granja B. Para los otros parámetros y en la granja A, no se observaron diferencias en la producción de citocinas de CD4−CD8+, CD4+CD8− o CD4−. Células T CD8-. El porcentaje de células T TNF- +CD4+CD8− aumentó significativamente, mientras que el porcentaje de células T IFN- +CD4−CD8+ disminuyó significativamente de uno a dos meses de tratamiento. edad. Es de destacar que el cerdo que fue positivo para M. hyopneumoniae a los seis meses de edad con 7 organismos de M. hyopneumoniae/μL de ADN tenía altos porcentajes de TNF- +CD4+CD8− e IL-17 Células T A+ CD4−CD8+ en su sangre. Los otros cerdos positivos para M. hyopneumoniae a los seis meses de edad tenían porcentajes similares de células T productoras de citoquinas que los cerdos negativos para M. hyopneumoniae.

Figura 5 Subconjuntos de células T productoras de citocinas específicas de Mycoplasma hyopneumoniae circulantes en la sangre de cerdos de la granja B. A

En cada granja, la MDA específica de M. hyopneumoniae estuvo presente en el suero de 20 lechones de dos días de edad y ausente en el suero de cinco lechones, que procedían de la cerda sin anticuerpos séricos específicos de M. hyopneumoniae. Para investigar si MDA tenía una influencia en la inmunidad mediada por células inducida por la vacuna específica de M. hyopneumoniae, se hizo una distinción entre los lechones con y sin MDA, y se investigaron las diferencias entre los dos grupos para los subconjuntos de células T para los cuales la MDA era significativa. Se observaron diferencias en la producción de citocinas (Figuras 6A a E). En la granja B, el porcentaje de células T TNF- +CD4+CD8+ tendía a ser mayor en los cerdos de un mes de edad con MDA, en comparación con los de un mes de edad. cerdos sin MDA. Para las otras células T CD4+CD8+ productoras de citoquinas, los porcentajes promedio fueron similares entre los dos grupos de cerdos al mes de edad, en cada granja. Con el tiempo, hubo una tendencia decreciente en los porcentajes promedio de células T CD4+CD8+ productoras de citocinas en la sangre de los cerdos, con diferencias pequeñas o nulas a los seis meses de edad entre los cerdos con y sin MDA (Figuras 6A a C). Lo mismo se observó con las células T CD8+ productoras de IFN- -en la sangre de los cerdos de la granja B (Figura 6D). Al año y a los dos meses de edad, el porcentaje promedio de células T TNF- +CD4+CD8− en la granja B fue similar para cerdos con o sin MDA, mientras que a los seis meses de edad, un porcentaje mayor de células T CD- -CD4+CD8- productoras de TNF se observó en la sangre de cerdos sin MDA (Figura 6E).

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Discusión

Este es el primer estudio que proporciona información sobre las respuestas inmunes a largo plazo inducidas por la vacuna específica de M. hyopneumoniae en cerdos desde el nacimiento hasta el sacrificio en condiciones de campo. Después de la vacunación no hubo respuesta inmune humoral en suero, evaluada con el IDEXX ELISA, pero sí hubo respuestas inmunes mediadas por células. La proliferación de células T tras la estimulación in vitro de M. hyopneumoniae se observó hasta el final del periodo de engorde. Además, al mes de edad, después de la vacunación con M. hyopneumoniae, estaban presentes células T CD4+CD8+ productoras de citocinas específicas de M. hyopneumoniae, que incluyen células T de memoria, pero disminuyeron con la edad. . Los anticuerpos maternos no parecieron afectar las respuestas inmunitarias humorales y mediadas por células inducidas por la vacuna durante la vida del cerdo, excepto por la presencia de células T TNF- +CD4+CD8+ . Para evaluar la persistencia y las diferencias en la respuesta inmune en lechones vacunados con M. hyopneumoniae a nivel de granja, incluimos dos granjas comerciales. Aunque se asumió la circulación de M. hyopneumoniae en ambas granjas, los cerdos estudiados permanecieron negativos a M. hyopneumoniae durante todo el ensayo, excepto cuatro cerdos en la granja B al final del ensayo, lo que nos permitió investigar la persistencia de la infección inducida por la vacuna. respuestas inmunes sin la influencia de una infección natural. Los cuatro cerdos con PCR positiva para M. hyopneumoniae a los seis meses de edad en la granja B no tenían niveles más altos de anticuerpos específicos de M. hyopneumoniae en comparación con los cerdos negativos para la PCR. A excepción de un cerdo, tampoco tenían porcentajes más altos de células T productoras de citocinas en la sangre después de la estimulación in vitro con M. hyopneumoniae. Esto podría explicarse por el hecho de que la infección por M. hyopneumoniae probablemente ocurrió poco antes del momento del muestreo, lo que no le dio al sistema inmunológico tiempo suficiente para responder a la infección [29-31]. En tres de los cuatro cerdos positivos para M. hyopneumoniae, la carga de patógenos en la muestra de TBS también fue bastante baja.

Figura 6 Porcentaje promedio de subconjuntos de células T productoras de citocinas específicas de Mycoplasma hyopneumoniae según los niveles de anticuerpos de origen materno. C.A.

Los niveles de anticuerpos séricos en cerdos de dos días de edad se correspondieron con los niveles de anticuerpos específicos de M. hyopneumoniae en suero y calostro de cerdas al momento del parto, lo que confirma la transferencia de inmunidad materna específica de M. hyopneumoniae a través del calostro [22, 23]. No se observó seroconversión después de la vacunación con M. hyopneumoniae a los 16 días de edad. Por el contrario, los niveles de anticuerpos específicos de M. hyopneumoniae disminuyeron con el tiempo y todos los animales se volvieron seronegativos a los dos meses de edad. Se sabe que la vacuna comercial contra M. hyopneumoniae utilizada en este estudio causa una seroconversión limitada después de una sola administración, lo que también se observó en estudios previos [14, 32, 33]. En un estudio experimental de vacunación de lechones cerca del destete, el 40% de los animales se seroconvirtieron 3 semanas después de la vacunación, mientras que en una prueba de campo, solo 3 de 40 cerdos se seroconvirtieron 7 semanas después de la vacunación [14, 32]. Sin embargo, la presencia (o ausencia) de anticuerpos séricos específicos de M. hyopneumoniae después de la vacunación no se corresponde con la protección (o la falta de ella) contra la infección [14, 25, 34]. Para proteger al huésped contra patógenos bacterianos intracelulares y extracelulares facultativos como M. hyopneumoniae, las células T auxiliares CD4+CD8−, principalmente células T1 y T17, desempeñan un papel importante. Las células T1 producen IFN-, que activa los macrófagos para matar el patógeno, mientras que las células T17 producen IL-17A para fortalecer la barrera mucosa [35-38]. Recientemente, se ha demostrado que un bajo porcentaje de células de M. hyopneumoniae también se puede encontrar intracelularmente y, dado el papel crucial de las células T citotóxicas CD4-CD8+ en la protección del huésped contra patógenos intracelulares, estas células T citotóxicas También podría ser importante para controlar las infecciones por M. hyopneumoniae [31, 35, 39]. Para investigar la cinética de las diferentes frecuencias de subconjuntos de células T y la capacidad de estas células T para proliferar después de la estimulación in vitro con M. hyopneumoniae, se aislaron PBMC de lechones en ambas granjas. El patrón de frecuencia del subconjunto de células T fue similar en estas dos granjas. Según otros estudios, el porcentaje de células T CD4+CD8- es mayor que el porcentaje de células T CD4-CD8+ a una edad más temprana. A medida que aumenta la edad, el porcentaje de células T CD4+CD8− disminuye, mientras que el porcentaje de células T CD4−CD8+ aumenta, lo que resulta en una relación CD4/CD8 decreciente con el tiempo [40–42]. Los lechones nacen casi sin células T CD4+CD8+. Estas células aumentan con la edad cuando los cerdos tienen contacto con microorganismos, ya que algunas de estas células tienen una función de memoria específica del patógeno [5, 22, 42–44]. Sin embargo, en la granja A, la frecuencia de células T CD4+CD8+ se mantuvo en el mismo nivel desde los dos meses de edad en adelante. En la granja B, hubo un aumento gradual hasta los cuatro meses de edad, como se esperaba, aunque el porcentaje de células T CD4+CD8+ disminuyó nuevamente después. La comparación de subconjuntos de células T con otros estudios sigue siendo difícil ya que las PBMC en este estudio no se midieron directamente después del muestreo de sangre, sino que primero se incubaron durante 20 h antes de medir el porcentaje de subpoblaciones de células T. La proliferación de células T CD3+ específicas de Mycoplasma hyopneumoniae persistió hasta el final del período de engorde, lo que confirma la presencia de células T específicas de M. hyo pneumoniae en la sangre de cerdos vacunados a los 16 días de edad. La presencia de células T proliferativas específicas de M. hyopneumoniae podría correlacionarse con la protección contra la neumonía enzoótica porque investigaciones anteriores demostraron que la capacidad de las PBMC para proliferar, después de la estimulación in vitro con el mitógeno ConA, se correlaciona con la resistencia contra enfermedades en los cerdos [45 ]. Las células T CD4-CD8- fueron el principal subconjunto de células T que proliferaron en ambas granjas, seguidas de las células T CD4+CD8-, y los porcentajes fluctuaron con el tiempo. En los cerdos, la mayoría de las células T CD4-CD8- tienen receptores de células T δ invariantes en contraste con las células T específicas de antígeno [31, 42]. Tras la infección de cerdos con otros patógenos como PRRSV, las células T δ también fueron las principales respondedoras proliferativas post-viremia PRRSV [46]. Esas células T también desempeñan un papel en la producción de anticuerpos neutralizantes después de vacunar a los cerdos contra la peste porcina clásica [47]. Además, en el líquido de lavado broncoalveolar de cerdos infectados con Actinobacillus pleuropneumoniae, se observó un aumento de células T CD8-δ [48]. Es necesario realizar más investigaciones para investigar el papel de las células T δ en el control y la protección contra las infecciones por M. hyopneumoniae. En ensayos de recuperación, se evaluó la producción de TNF-, IFN- e IL-17A en diferentes subconjuntos de células T. A los dos meses de edad, el porcentaje de células T CD4+CD8+ productoras de TNF- -, IFN- - y TNF-/IFN- -disminuyó significativamente. en comparación con los porcentajes al mes de edad. Después, los porcentajes fueron variables, disminuyeron aún más o se mantuvieron estables en el tiempo. Se observó el mismo patrón para las células T CD-17CD4+CD8+ productoras de IL-17A, aunque no fue estadísticamente significativo. En primerizas vacunadas contra PRRSV, la producción de IFN por parte de las PBMC también se observó hasta 42 días después de la primovacunación, pero disminuyó después hasta 147 días después de la vacunación [49]. Anteriormente se ha demostrado un mayor número de linfocitos secretores de IFN después de la vacunación con M. hyo pneumoniae [9, 10].

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Recientemente, se ha ido acumulando evidencia de que las células T polifuncionales, que producen más de una citocina, tienen un papel fundamental en la protección y eliminación de patógenos. Por ejemplo, en cerdos infectados con especies de Chlamydia, las células T CD4+CD8- polifuncionales se correlacionan con la protección [50]. La vacunación de lechones contra M. hyo pneumoniae también aumentó los porcentajes de células T polifuncionales CD4+CD8- y CD4-CD8+ [12]. En otro estudio, la vacunación de cerdos contra PCV2 dio como resultado niveles más altos de células T TNF- +/IFN- +CD4+CD8+ 24 días después de la vacunación, disminuyendo nuevamente hacia el final del estudio, 56 días después de la vacunación [51]. En nuestro estudio, también observamos que la presencia de células T CD4+CD8+ productoras de citoquinas disminuyó con el tiempo. Este estudio se centró en los linfocitos sanguíneos circulantes, pero la vacunación también induce respuestas inmunitarias locales mediadas por células específicas de M. hyopneumoniae en los pulmones y los ganglios linfáticos bronquiales [8]. Por lo tanto, las investigaciones futuras sobre la inmunidad inducida por la vacuna específica de M. hyo pneumoniae también deberían centrarse en las respuestas inmunitarias locales mediadas por células. Además, para inmunizar a los lechones en este estudio solo se utilizó una vacuna comercial contra M. hyopneumoniae. Las respuestas inmunitarias pueden diferir entre vacunas, ya que están influenciadas por la formulación de una vacuna (adyuvante y antígeno) y la vía de administración [16, 52, 53]. Por ejemplo, se sabe que el carbopol, el adyuvante de la vacuna comercial contra M. hyopneumoniae utilizada, dirige la respuesta inmunitaria hacia una respuesta T1 [54]. En cada granja, cinco lechones eran seronegativos para M. hyopneumoniae, y en el suero de 20 lechones estaba presente MDA específica para móviles de M. hyopneu. Independientemente de su estado de MDA, todos los cerdos eran seronegativos para M. hyopneumoniae a los dos meses de edad y no se observó seroconversión en momentos posteriores. Nuestros hallazgos corresponden a un estudio previo en el que se vacunaron lechones de siete días con y sin MDA contra M. hyopneumoniae [25]. En ambos grupos, no se observó seroconversión después de la vacunación y todos los cerdos fueron seronegativos 42 días después de la vacunación. Por otro lado, otros encontraron que la vacunación con M. hyopneumoniae en presencia de MDA daba como resultado niveles de anticuerpos más altos en comparación con los lechones no vacunados, pero cuanto mayor era el título de MDA, menor era la respuesta [24, 26]. Aunque no siempre se observa una respuesta de anticuerpos después de la vacunación con M. hyopneumoniae, se inducen respuestas inmunes mediadas por células específicas de M. hyopneumoniae [26]. No se observaron diferencias en la proliferación de PBMC aisladas de cerdos vacunados con M. hyopneumoniae, independientemente de los niveles de MDA [26]. En nuestro estudio, dentro de cada granja, no se observaron diferencias en las células T productoras de citocinas entre los cerdos vacunados con M. hyopneumoniae con y sin MDA al mes de edad. Solo en la granja B, los lechones con MDA tendieron a tener porcentajes más altos de células T TNF- +CD4+CD8+ al mes de edad en comparación con los lechones sin MDA. La relevancia de estos hallazgos debería investigarse más a fondo en un estudio que incluya una cantidad mayor e igual de lechones con y sin MDA específico de M. hyopneumoniae. También se deben realizar diez análisis estadísticos, ya que esto no se hizo en este estudio debido al bajo y desigual número de animales en el grupo sin y con MDA. En conclusión, el presente estudio demostró que, aunque faltaba seroconversión después de la vacunación de lechones con M. hyopneumoniae, se detectaron respuestas inmunes mediadas por células específicas de M. hyopneumoniae. Las células T CD4+CD8+ productoras de citocinas polifuncionales estuvieron presentes hasta los tres meses de edad y se observaron células T en proliferación hasta el final del período de engorde, lo que indica la presencia de una inmunidad mediada por células específica del patógeno. en cerdos vacunados con M. hyopneumoniae. Los resultados forman la base para futuras investigaciones que evalúen la influencia de una infección natural por M. hyopneumoniae en la inmunidad inducida por la vacuna en condiciones de campo.

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