La microgravedad simulada influye en los biomarcadores relacionados con la inmunidad en el cáncer de pulmón

Abstracto: La microgravedad es una estrategia novedosa que puede servir como herramienta complementaria para desarrollar futuras terapias contra el cáncer. En el cáncer de pulmón, se aborda bien la influencia de la microgravedad en los procesos celulares y la capacidad migratoria de las células. Sin embargo, su efecto sobre los mecanismos que impulsan la progresión del cáncer de pulmón aún está en sus inicios. En este estudio, se demostró que 13 genes expresados ​​diferencialmente están asociados con el pronóstico del cáncer de pulmón en microgravedad simulada (SMG). Mediante el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes, estos genes se enriquecen en vías de inmunidad humoral. En su lugar, se expusieron células alveolares basales-epiteliales (A549) a SMG mediante un sistema clinostato 2D in vitro. Además del cambio morfológico y la disminución de la tasa de proliferación, SMG revirtió el fenotipo de transición epitelial a mesenquimal (EMT) de A549, un mecanismo clave en la progresión del cáncer. Esto se evidenció por un aumento de la expresión de E-cadherina epitelial y una disminución de la expresión de N-cadherina mesenquimatosa, por lo que se exhibe un estado menos metastásico. Curiosamente, observamos una mayor expresión de FCGBP, BPIFB, F5, CST1 y CFB y su correlación con EMT bajo SMG, lo que los convierte en potenciales biomarcadores supresores de tumores. En conjunto, estos hallazgos revelan nuevas oportunidades para establecer nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento del cáncer de pulmón.

Palabras clave: microgravedad simulada; paramédico; cáncer de pulmón; metástasis; supresor de tumor; biomarcador

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1. Introducción

El espacio es conocido por carecer del vector de gravedad, que afecta al cuerpo a nivel de órganos, tejidos y células. La microgravedad, una condición de aparente ingravidez, es un importante factor de estrés espacial que se sabe que afecta significativamente la salud humana, como la pérdida ósea, la atrofia muscular y el descondicionamiento cardíaco [1,2]. El impacto de la microgravedad en las células cancerosas también ha sido un creciente punto de interés en la investigación espacial y del cáncer. Se ha demostrado que la microgravedad suprime la actividad de las células inmunitarias y altera los sistemas multicuerpos, lo que puede aumentar el riesgo de desarrollar cáncer [2–4]. Debido a estos obvios problemas de salud, el entorno de microgravedad ha permitido a los investigadores estudiar los mecanismos biofísicos afectados por la microgravedad y ha ayudado a descubrir terapias para los trastornos neurodegenerativos, inmunoterapias y terapias anticancerígenas potencialmente mejores y más específicas [4-6]. Numerosos estudios han documentado y revisado bien la gran implicación que tiene la microgravedad en la progresión celular, la proliferación y la apoptosis en innumerables líneas celulares tumorales, incluido el cáncer de pulmón [7-12]. Sin embargo, muchos otros estudios que involucran microgravedad han demostrado que inducen cambios en la expresión genética que están involucrados en la proliferación, metástasis y supervivencia de las células cancerosas, cambiando las células hacia un fenotipo menos agresivo [13,14]. Esto puede arrojar luz sobre nuevos conocimientos sobre la biología y el diagnóstico de los tumores, destacando así la microgravedad como una herramienta innovadora para descubrir nuevos objetivos con la esperanza de desarrollar nuevos enfoques de investigación y mejorar las estrategias terapéuticas. El cáncer de pulmón, siendo el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) el tipo más destacado, es una de las principales causas de muerte, representa el 12% de todos los cánceres y es el cáncer más comúnmente diagnosticado [15]. En estudios que involucran microgravedad, que pueden guiarnos para comprender mejor el proceso cancerígeno, se demostró que las células de cáncer de pulmón pierden su fuerza después de la exposición a la microgravedad, lo que afecta el crecimiento y la función de las células cancerosas [11]. Un estudio de Ahn et al. demostró que la exposición de células de cáncer de pulmón (A549) a la microgravedad inducía una rápida migración y proliferación. Esto se explica por los niveles elevados de metaloproteasas de matriz (MMP-2 y MMP-9) en condiciones de microgravedad, lo que desempeña un papel crucial en la invasión y migración del cáncer [10]. En otro estudio, Chung et al. Descubrieron que la microgravedad simulada no afectaba significativamente la proliferación de células de cáncer de pulmón, sino que aumentaba la migración en comparación con el grupo de control en condiciones de gravedad normal [16]. Por el contrario, Chang et al. mostró una reducción en la migración en la línea celular de cáncer de pulmón A549 después de 24 h de exposición a condiciones de microgravedad [17]. A pesar de los importantes efectos de la microgravedad sobre el comportamiento celular, que comprende la apoptosis, la migración y la invasividad, su efecto sobre el cáncer de pulmón aún no se ha dilucidado por completo. Está bien establecido que las células epiteliales experimentan varios cambios bioquímicos para establecer un fenotipo mesenquimatoso que mejora la resistencia a la apoptosis, la invasividad y las capacidades migratorias. Este proceso biológico se conoce como transición epitelial a mesenquimal (EMT), un sello distintivo de la progresión del cáncer [18]. La relación de la EMT con la progresión del cáncer ha sido bien discutida. Se sabe que los tumores activan la EMT regulando positivamente los factores de transcripción, expresando proteínas de la superficie celular y produciendo enzimas que degradan la ECM. Una vez que se activa la EMT, las células tumorales pierden su adhesión entre células y adquieren propiedades migratorias e invasivas [19]. Sólo dos estudios han demostrado que la microgravedad simulada induce una transición epitelial a mesenquimatosa (EMT) transitoria en los queratinocitos [9]. Además, estos fenómenos se destacaron en células MCF-7 y HUVEC [20]; sin embargo, ningún estudio se ha centrado en el efecto de la microgravedad en la EMT en el cáncer de pulmón. A pesar de los muchos descubrimientos cruciales realizados sobre la capacidad de la microgravedad para modular los procesos tumorigénicos y metastásicos del cáncer, los mecanismos exactos impulsados ​​por la microgravedad siguen siendo relativamente desconocidos, por lo que quedan abiertas preguntas sobre los cambios adaptativos que ocurren a nivel molecular. En este estudio, hemos identificado una firma de genes relacionados con el sistema inmunológico (FCGBP, BPIFB1, F5, CFB y CST1) que exhibieron significativamente una mayor expresión de ARNm en células A549 bajo el efecto de microgravedad simulada (SMG). Además, hemos evaluado la contribución de SMG en la progresión del cáncer A549 mediante la regulación de EMT. FCGBP, BPIFB1, F5, CFB y CST1 y su correlación con los marcadores clave de EMT mostraron un fenotipo de cáncer de pulmón potencialmente menos metastásico bajo SMG. Los hallazgos de este estudio proporcionan una base para futuras investigaciones necesarias para identificar los mecanismos subyacentes, que desarrollarán nuestra comprensión y ayudarán en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento del cáncer de pulmón.

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2. Resultados

2.1. Principales genes comunes expresados ​​diferencialmente identificados en células de cáncer de pulmón bajo microgravedad simulada (SMG) en comparación con gravedad terrestre (GG)

Para identificar genes implicados en el cáncer de pulmón en microgravedad simulada (SMG), inicialmente investigamos genes que se expresan diferencialmente en SMG en comparación con la gravedad terrestre (GG) para el cáncer de pulmón humano utilizando la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) disponible públicamente. Se eligieron dos conjuntos de datos, GSE78210 y GSE36931, que incluyen la expresión genética de dos líneas celulares diferentes de cáncer de pulmón humano, A549 y Colo699, cultivadas en condiciones de cultivo celular 2D y 3D. Las diferencias en los perfiles de expresión genética entre las muestras de SMG y GG se presentaron en parcelas de volcán (Figura 1). Los genes expresados ​​diferencialmente (DEG; Figura 2) identificados para cada conjunto de datos se dividieron en aquellos que están regulados positivamente en el cáncer de pulmón (21 genes en A549 y 29 genes en Colo699 del conjunto de datos GSE78210 y 47 genes en A549 del conjunto de datos GSE36931) y aquellos que son cáncer de pulmón I regulado negativamente (40 genes en A549 y 27 genes Colo699 del conjunto de datos GSE78210 y 87 genes en A549 del conjunto de datos GSE36931), como se representa en la Tabla 1. Trece DEG se expresaron significativamente en células A549 de los conjuntos de datos GSE78210 y GSE36931 en SMG en comparación con la condición GG. Los genes más comunes se identificaron utilizando la herramienta web InteractiVienn (Figura 2A). Los genes candidatos incluyen AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP y BPIFA1. Para establecer si los DEG identificados están involucrados en vías comunes, los genes candidatos se cargaron en Metascape (http://metascape.org; consultado el 11 de noviembre de 2021). Curiosamente, estos genes están enriquecidos en vías que implican la respuesta inmune humoral y la exocitosis regulada (Figura 2B).

Figura 1. Gráfico de volcán que muestra genes expresados ​​diferencialmente (DEG) utilizando GEO Omnibus. (A) Gráfico de volcán que muestra DEG bajo los efectos SMG y GG en células A549 utilizando conjuntos de datos (A) GSE78210 y (B) GSE36931. (C) Gráfico de volcán que muestra DEG bajo los efectos SMG y GG en la línea celular Colo699 utilizando el conjunto de datos GSE78210. El color rojo indica genes regulados positivamente, mientras que el color azul indica genes regulados negativamente.

Tabla 1. Genes totales que se expresan diferencialmente en SMG en comparación con GG en las líneas celulares de cáncer de pulmón A549 y Colo699. A cada conjunto de datos se le ajustaron los cambios para extraer el 5% superior de los DEG. Para GSE36931, el cambio en veces (FC) se ajustó para incluir solo genes con un FC mayor o igual a 4 o menor o igual a −4. Para GSE78210, el FC se ajustó para incluir solo genes con un FC mayor o igual a 3 o menor o igual a −3.

Figura 2. Trece DEG comúnmente compartidos entre los conjuntos de datos GSE78210 y GSE36931 en cáncer de pulmón. (A) Diagrama de Venn que muestra 134 DEG en GSE36931 (línea celular A549), 61 DEG en GSE78210 (línea celular A549) y 56 DEG en GSE78210 (línea celular Colo699) en condiciones de SMG en comparación con GG. Del total de 251 genes identificados, se encontró que 13 DEG eran comunes entre los dos conjuntos de datos, GSE78210 y GSE36931, en la línea celular A549. El diagrama de Venn se generó utilizando InteractiVinn.

2.2. Los genes expresados ​​diferencialmente se correlacionan con el pronóstico clínico de los pacientes con adenocarcinoma de pulmón

Los genes expresados ​​diferencialmente se correlacionan con el pronóstico clínico de los pacientes con adenocarcinoma de pulmón Para evaluar el valor pronóstico clínico de los genes candidatos en pacientes con adenocarcinoma de pulmón, Kaplan-Meier plotter (http://www.kmplot.com/; consultado el 11 de noviembre de 2{ {44}}21) se utilizó para comparar la supervivencia general (SG) de pacientes con adenocarcinoma de pulmón (LUAD) con expresión alta/intermedia versus baja de genes candidatos (Figura 3). Altos niveles de expresión de ARNm de NOX1 (índice de riesgo (HR), 1,45; intervalo de confianza (IC) del 95 %, 1,11–1,9; p=0.0058), GDA (HR , 1,74; IC 95 %, 1,33–2,26; p=3.2e-05), TCN1 (HR, 1,62; IC 95 %, 1,26–2,08; p=0.00014), y BPIFA1 (HR, 1,44; IC 95 %, 1,12–1,84; p=0.0026) se asociaron significativamente con un mal pronóstico (Figura 3A-D). Por otro lado, los niveles altos de expresión de ARNm de FCGBP (HR, 0,63; IC 95 %, 0,46–0,85; p=0.0026) se asociaron con un mejor pronóstico y una mayor supervivencia general en pacientes con LUAD (Figura 3E). No hubo correlación significativa entre el ARNm

Figura 3. FCGBP, CST1, F5, CFB y BPIFB1 se correlacionaron con el pronóstico clínico de los pacientes con adenocarcinoma de pulmón. Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de los niveles de expresión de ARNm de genes candidatos: (A)NOX1; (B) GDA; (C) NTP1; (D) PLUNC; (E) FCGBP; (F)AZGP1; (G) H2Bf; (H) B7X; (I) AGR3; (J) CEACAM6; (K) F5; (L) BPIFB1; y (M) CST1 en pacientes con adenocarcinoma de pulmón. HR: índice de riesgo.

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2.3. Expresión de FCGBP, BPIFB1, F5, CFB y CST1 en microgravedad post-simulada de células A549

Para validar la expresión de los genes identificados in silico (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP y BPIFA1), se realizó una aplicación in vitro mediante qRT-PCR. Curiosamente, al utilizar qRT-PCR, nuestros datos mostraron una regulación positiva significativa de la expresión del ARNm de FCGBP, específicamente a las 48 y 72 h en células A549, después de SMG en comparación con GG (Figura 4A). Además, las expresiones de ARNm de CFB, F5 y BPIFB1 aumentaron significativamente a las 72 h después de SMG y, en comparación con GG, en células A549 (Figura 4B, C, E). Se detectó un ligero aumento, aunque no significativo, en la expresión de ARNm para CTS1 en condiciones de SMG en comparación con GG (Figura 4D). Las expresiones de AZGP1, AGR3, GDA, VTCN1, BPIFA1, NOX1, CEACAM5 y TCN1 estaban indeterminadas tanto para SMG como para GG (datos no mostrados).

Figura 4. Regulación positiva de FCGBP, CST1, F5, CFB y BPIFB1 en condiciones de SMG in vitro. Niveles de expresión de ARNm de (A) FCGBP, (B) CFB, (C) F5, (D) CTS1 y (E) BPIFB1, cuantificados mediante qRT-PCR y normalizados a GAPDH en células A549 sometidas a condiciones GG y SMG durante 24 , 48 y 72 h. Los gráficos de barras muestran los resultados de 3 experimentos independientes (n=3). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 y **** p < 0,0001.

En general, estos datos implican que FCGBP, F5, CFB y BPIFB1 expresados ​​diferencialmente en el cáncer de pulmón pueden desempeñar un papel importante en la progresión del cáncer de pulmón.

2.4. La microgravedad simulada reduce la viabilidad celular y revierte la transición epitelial a mesenquimatosa en la línea celular de cáncer de pulmón A549

Para investigar si SMG afecta el potencial de proliferación de las células A549, se realizó un ensayo de viabilidad celular utilizando un ensayo de exclusión de azul tripán. Nuestros datos revelaron que SMG indujo significativamente una disminución dependiente del tiempo en la proliferación celular (Figura 5B). La disminución en la proliferación celular fue significativa principalmente después de 48 y 72 h después de SMG en comparación con GG, que mostró un aumento en la proliferación celular de células A549. Paralelamente, se detectó un cambio en la morfología celular en células A549 bajo SMG. Para evaluar estos cambios, las células se retiraron de la condición SMG, se sembraron en placas de pocillos 24- y se observaron bajo microscopía óptica después de 1 h de aplicación de SMG. Curiosamente, las células expuestas a SMG revelaron una morfología granular y agrupada después de SMG. (Figura 5A).

Figura 5. La microgravedad simulada reduce la viabilidad celular e induce cambios morfológicos en las células A549 de manera dependiente del tiempo. (A) Micrografías representativas de células A549 parentales (GG) y células A549 sometidas a SMG durante 24, 48 y 72 h antes de sembrarlas nuevamente durante 1 hora bajo GG. Las imágenes se tomaron con un aumento de 10X. (B) La viabilidad celular de las células A549 se evaluó mediante un ensayo de exclusión del tinte azul tripano. La viabilidad celular promedio de 3 experimentos independientes se muestra como un control porcentual. **** p < 0.0001. Figura 5. La microgravedad simulada reduce la viabilidad celular e induce cambios morfológicos en las células A549 de manera dependiente del tiempo. (A) Micrografías representativas de células A549 parentales (GG) y células A549 sometidas a SMG durante 24, 48 y 72 h antes de sembrarlas nuevamente durante 1 hora bajo GG. Las imágenes fueron tomadas con un aumento de 10X. (B) La viabilidad celular de las células A549 se evaluó mediante un ensayo de exclusión del tinte azul tripano. La viabilidad celular promedio de 3 experimentos independientes se muestra como un control porcentual. **** p < 0,0001.

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Para comprender los datos obtenidos sobre la disminución de la proliferación celular en A549, evaluamos la contribución de SMG al mecanismo de transición epitelial a mesenquimal (EMT). La EMT es un sello distintivo y un mecanismo importante que impulsa la progresión del cáncer y la metástasis, mejorando así su motilidad celular y sus propiedades invasivas [19]. Los marcadores clave de EMT (E-cadherina, N-cadherina, ZO-1 y Snail) y los niveles de expresión de ARNm de metaloproteinasas MMP-2 y MMP-9 se midieron mediante qRT-PCR en A549, bajo tanto GG como SMG (Figura 6). Tras la aplicación de SMG, se observó un aumento significativo en la expresión del ARNm de E-cadherina, paralelo a una disminución significativa de la expresión del ARNm de N-cadherina, a las 48 y 72 h después de la SMG (Figura 6A, B). Se detectó un aumento no significativo en ZO-1 y MMP-9 y una disminución en el factor de transcripción Snail con SMG (Figura 6C-E). MMP-2 disminuyó significativamente en A549 a las 48 h después de la SMG (Figura 6F), lo que indica una forma menos invasiva. En conjunto, estos datos respaldan un fenotipo de transición mesenquimal-epitelial (MET) inducido por SMG en A549.

Figura 6

2.5. La vía de transición epitelial a mesenquimatosa se correlaciona con la expresión de FCGBP, BPIFB1, F5, CFB y CST1

Para obtener una visión más mecanística del papel potencial de los genes identificados en A549 y su posible correlación con EMT en condiciones de SMG, se realizó un análisis de interacción genética utilizando GeneMANIA contra marcadores de genes EMT. La Figura 7 muestra las interacciones genéticas trazadas entre los genes EMT E-cadherina (CDH1), N-cadherina (CDH2), TJP1, CTNNB1, SNAI1 (Snail), ZO-1 y -catenina, respectivamente. Conociendo sus importantes funciones en la invasión y migración del cáncer, también se incluyeron en el análisis las metaloproteinasas MMP-2 y MMP-9. Los nodos identifican patrones de coexpresión entre genes de diferente intensidad según el grosor del nodo. Los genes candidatos muestran cierto grado de coexpresión entre sí; BPIFB1 se coexpresa con CFB y CST1; FCGBP se coexpresa con F5, CST1 y CFB; CST1 se coexpresa con CFB y F5 se coexpresa con CFB, CST1 y BPIFB1. También se identificaron nodos de coexpresión entre los genes EMT y los genes candidatos; CDH1 se coexpresa con FCGBP y F5; CDH2 se coexpresa con F5, CST1, BPIFB1 y FCGBP; CTNNB1 se coexpresa con CST1 y FCGBP; SNAI1 se coexpresa con CST1, F5 y BPIFB1; TPJ1 se coexpresa con CST1, FCGBP y F5; CTNNB1 se coexpresa con CST1 y FCGBP; MMP2 se coexpresa con BPIFB1 y CST1; y MMP9 se coexpresa con F5, CST1, FCGBP y CFB. Estos hallazgos sugieren una correlación significativa entre los nuevos genes identificados y los marcadores de EMT en condiciones de SMG, posiblemente relacionados con las vías de EMT.

Figura 7. FCGBP, CST1, F5, CFB y BPIFB1 se correlacionan con la vía EMT. Red de interacción gen-gen de genes candidatos seleccionados; FCGBP, CST1, F5, CFB y BPIFB1 con genes EMT; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 y SNAI1, así como los genes relacionados con la migración celular MMP2 y MMP9 generados por GeneMANIA (http://genemania.org/; consultado el 11 de noviembre de 2021) para identificar interacciones entre los genes candidatos con EMT y marcadores de migración celular. Los diferentes colores del borde de la red indican los métodos bioinformáticos aplicados: predicción del sitio web (naranja), interacciones físicas (rojo), coexpresión (púrpura), dominios proteicos compartidos (marrón), vía (azul claro), colocalización (oscuro). azul) e interacciones genéticas (verde)

3. Discusión

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Discusión El cáncer de pulmón, una de las enfermedades más importantes y amenazantes a nivel mundial, ha suscitado últimamente mucha atención en la "investigación espacial". Sin embargo, a pesar de los avances en este campo, la progresión del cáncer de pulmón y su respuesta al tratamiento siguen siendo controvertidas debido a la falta de estrategias definitivas de evaluación que ayuden en la prevención o el tratamiento del cáncer [21]. Hasta donde sabemos, este es el primer informe que identifica un conjunto de genes como una firma de la progresión del cáncer de pulmón en un entorno mecánico inducido por microgravedad simulada (SMG). Destacamos el aumento de la expresión de los genes relacionados con la respuesta inmune FCGBP, BPIFB, F5, CST1 y CFB, y su correlación con la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT) bajo SMG, lo que los convierte en biomarcadores potenciales de la progresión del cáncer de pulmón. Aquí, también destacamos el efecto de la SMG inducida sobre la regulación de la EMT, un sello distintivo de la progresión del cáncer [18,22], al apoyar un fenotipo de transición mesenquimatosa a epitelial (MET). En general, este estudio ofrece la base para la asociación de los genes identificados con la EMT; sin embargo, se requieren más investigaciones para desentrañar los mecanismos exactos que ayudan a desarrollar una nueva terapia dirigida para el cáncer de pulmón. En este estudio, mostramos trece genes (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP y BPIFA1) que se expresan significativamente en el cáncer de pulmón en microgravedad simulada (SMG) como en comparación con la gravedad del suelo in silico. Nuestros datos mostraron que estos genes expresados ​​diferencialmente están enriquecidos en vías relacionadas principalmente con la inmunidad humoral y la exocitosis regulada. Interés en paralelo con nuestros hallazgos, aunque la función principal de FCGBP aún no está clara [23]. Esto puede deberse en parte a las funciones contradictorias que exhibe en diferentes tumores [25]. Por ejemplo, se ha demostrado que la FCGBP se asocia significativamente con un mejor pronóstico general y supervivencia específica de la enfermedad en pacientes con cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon y osteosarcoma [25-27], mientras que en los cánceres de ovario y próstata, la alta expresión de FCGBP se asoció con una peor supervivencia general [28]. Es de destacar que el papel de FCGBP se ha atribuido a los mecanismos de defensa inmune, las respuestas antiinflamatorias y la protección celular [29,30], lo que lo convierte en un marcador de pronóstico esencial [31]. Mediante aplicaciones in vitro, hemos evaluado la expresión de los genes identificados en cáncer de pulmón y en condiciones de SMG mediante un clinostato 2D. Existe una amplia selección de tipos de clinostat y otras plataformas de microgravedad que se han desarrollado. Estos incluyen sistemas clinostatos 1/2/3 D, máquinas de posicionamiento aleatorio equipadas con matraces portaobjetos (principalmente para células cancerosas de tiroides) y vasos de pared giratoria desarrollados por la NASA. Cada uno está diseñado para cumplir un determinado objetivo de investigación, donde algunos están diseñados para cultivar células adherentes o en suspensión, y otros se utilizan para medir en línea respuestas cinéticas. Es de destacar que el clinostato es una de las plataformas más simples y adaptables utilizadas por diferentes aplicaciones experimentales. En principio, el clinostato 2D se caracteriza por un eje de rotación que gira continuamente a una velocidad constante ajustada y en una dirección perpendicular a la dirección del vector de gravedad de la Tierra, creando así fuerzas centrífugas que imitan la microgravedad real [14,32,33 ]. Curiosamente, de los trece genes, las expresiones FCGBP, BPIFB, F5, CST1 y CFB aumentaron significativamente en respuesta a la SMG inducida por clinostat 2D en células A549. Las expresiones de FCGBP y BPIFB fueron las más afectadas, mostrando un aumento significativo en todos los momentos evaluados: 24, 48 y 72 h post-SMG. Al igual que FCGBP, se sabe que BPIFB1 contribuye a las respuestas de inmunidad innata [34]. Se ha demostrado que el pliegue BPI que contiene la proteína miembro 1 de la familia B (BPIFB1), que se produce principalmente por los epitelios de las vías respiratorias, participa en los mecanismos de defensa del huésped, junto con efectos bactericidas y antiinflamatorios [35]. En enfermedades respiratorias, se ha demostrado que BPIFB1 exhibe efectos antitumorales y antimetastásicos; sin embargo, los mecanismos exactos siguen sin estar claros, lo que justifica una mayor investigación [34,36]. Un estudio de Wei et al. encontró que BPIFB1 inhibe la migración y la invasión del carcinoma nasofaríngeo [37]. Teniendo esto en cuenta, se descubrió que las mutaciones que ocurren en BPIFB1 promueven el riesgo de cáncer de pulmón y su regulación negativa conduce a un mal pronóstico en pacientes con cáncer de pulmón [38,39]. Además del papel de FCGBP y BPIFB, se ha demostrado que el factor B del complemento (CFB) y el supresor de tumores quimérico 1 (CST1) ejercen funciones protectoras en el cáncer. Por ejemplo, se informó que la alta expresión de CFB se asoció con una mayor supervivencia general y libre de enfermedad del paciente en pacientes con cáncer de pulmón [40]. Además, el sistema del complemento sirve como primera línea de defensa contra patógenos, y es un componente importante tanto del sistema inmunológico innato como del adquirido [41]. En cuanto a CST1, diferentes estudios destacaron sus interesantes propiedades, como su capacidad para suprimir el crecimiento celular, inducir apoptosis y su resistencia a la inactivación por formas oncogénicas de p53, lo que lo convierte en una diana terapéutica atractiva pero alternativa al p{ de ​​tipo salvaje. {74}}tumores humanos resistentes [42]. Además del aumento de la expresión de FCGBP, BPIFB1, F5, CFB y CST1, nuestros datos mostraron de manera interesante dos fenotipos de células A549 relacionados con las células bajo SMG: un cambio de morfología en agregados y células en forma de grupos y una disminución significativa en la proliferación. tasa post-SMG. Esto es en paralelo con algunos otros estudios, donde las células que fueron expuestas a SMG exhibieron pequeños grumos o agregados celulares de múltiples capas [43,44]. Estas diferencias morfológicas se reflejan en los dramáticos cambios funcionales concomitantes en los procesos celulares, parte de los cuales es la EMT. La EMT es un sello distintivo del proceso metastásico, asociado con el escape de la vigilancia inmune y la invasión de la vasculatura, permitiendo así que las células se diseminen a órganos secundarios [19,22]. En principio, las células epiteliales malignas experimentan un mecanismo EMT en las etapas primarias del desarrollo del tumor, donde estas células tienden a expresar propiedades mesenquimales, exhibiendo una mayor motilidad que facilita su escape del nicho primario, mientras que las células metastásicas formadas en el lado secundario muestran propiedades menos desdiferenciadas en comparación con sus correspondientes tumores primarios. En este documento, un proceso MET (mesenquimatoso a epitelial) es parte de dicha progresión de la formación de tumores metastásicos. Sin embargo, eso no descuida la participación de los técnicos de emergencias médicas en diferentes etapas de la progresión del cáncer porque las células cancerosas en sitios secundarios continuarán creciendo y proliferando o entrarán en estado de latencia [45,46]. Esta coordinación de múltiples genes y la aparición de marcadores migratorios específicos que regulan la progresión metastásica de las células cancerosas pueden dar lugar a diferentes resultados tras la exposición al SMG [47]. Por ejemplo, en condiciones de microgravedad, diferentes células de cáncer de mama exhibieron diferentes morfologías, adhesión celular y propiedades migratorias al exponerse a la microgravedad [5]. Es de destacar que la principal característica de la EMT es la pérdida de la molécula de adhesión celular, E-cadherina, lo que afecta la inactividad de la integridad de las células. Por otro lado, el aumento de cadherina neural, N-cadherina, provoca alteraciones en la adhesión celular. Esto es inducido principalmente por el factor de crecimiento transformante (TGF-), que activa factores de transcripción expresados ​​pleiotrópicamente, como las proteínas Snail, Twist y Zeb, y otras vías de señalización implementadas en las vías metastásicas [18,48,49]. En este documento, informamos la mejora del marcador epitelial E-cadherina (CDH1) y la regulación negativa de los niveles de ARNm de N-cadherina mesenquimatosa (CDH2), marcadores clave de EMT [49]. Esto implica que, en combinación con nuestros datos sobre la tasa de proliferación reducida de A549, las células exhiben un estado menos metastásico. Curiosamente, la expresión alterada de marcadores clave de EMT también estuvo acompañada por una regulación negativa significativa de la metaloproteinasa de la matriz MMP-2, que es un componente importante de la membrana basal que normalmente segrega la capa epitelial del mesénquima circundante, lo que conduce a la pérdida de la membrana basal [50]. Esto es en paralelo con un estudio de Chang et al., donde informaron sus hallazgos sobre la reducción del potencial metastásico de las células de adenocarcinoma de pulmón humano mediante la alteración de la expresión de MMP2 [17]. En general, el papel de MMP ha estado bien implicado en la progresión de neoplasias malignas, incluida la metástasis, donde una expresión y actividad enzimática reducidas de MMP (MMP-2 y MMP-9) es una característica de un fenotipo menos metastásico. 50–52]. Teniendo el importante papel de la EMT en la metástasis, nuestros datos resaltan una correlación significativa de FCGBP, BPIFB, F5, CST1 y CFB con los marcadores del gen EMT, así como con los genes MMP2 y MMP9 relacionados con la migración celular. Curiosamente, Xiong et al. han demostrado que FCGBP es un regulador principal de la EMT en la vesícula biliar [53]. Esto significa que los genes identificados pueden servir como biomarcadores potenciales para futuros estudios que puedan predecir y comprender mejor la progresión del cáncer de pulmón. En conjunto, nuestros hallazgos clasifican los genes identificados como reguladores clave de la EMT, promoviendo una mejora potencial de un fenotipo menos metastásico a través de una transición mesenquimatosa a epitelial (MET) de las células de cáncer de pulmón.

4. Materiales y métodos

4.1. Conjuntos de datos para identificar genes expresados ​​diferencialmente (DEG) comunes en líneas celulares de cáncer de pulmón expuestas a microgravedad simulada

Se extrajeron conjuntos de datos relevantes de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) disponible públicamente para el análisis inicial. Esta base de datos se utiliza como análisis genómico funcional disponible públicamente de microarrays y datos de expresión genética de alto rendimiento. Los conjuntos de datos seleccionados cumplieron con los siguientes criterios: conjuntos de datos que utilizan líneas celulares de cáncer de pulmón humano únicamente, estudios que incluyen controles coincidentes de condiciones de gravedad en el suelo (GG), conjuntos de datos con clasificación definida de líneas celulares de cáncer de pulmón y conjuntos de datos con expresión genética de células de cáncer de pulmón humano. usando microarrays. Dos conjuntos de datos se ajustan a este criterio, GSE78210 y GSE36931. En total, se incluyeron 25 muestras en los estudios y se compararon 14 muestras de líneas celulares de cáncer de pulmón en microgravedad simulada (SMG) con 11 controles de GG, como se muestra en la Tabla 2 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). /geo/; consultado el 11 de noviembre de 2021).

Tabla 2. Detalles de los conjuntos de datos extraídos de Gene Expression Omnibus (GEO) utilizados para la identificación inicial de DEG entre células de cáncer de pulmón de microgravedad simulada (SMG) y de gravedad terrestre (GG).

4.2. Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes GEO2R para generar DEG en cada base de datos

En cada conjunto de datos se utilizó GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r; consultado el 11 de noviembre del 2021), una herramienta interactiva en línea utilizada para comparar series GEO. e identificar genes regulados hacia arriba y hacia abajo en condiciones SMG en comparación con condiciones GG. Los genes con valores de p inferiores a 0,05 y un cambio superior a 2 se seleccionaron como genes DEG expresados ​​diferencialmente en condiciones de SMG. En consecuencia, los DEG de cada conjunto de datos se cruzaron entre sí y se identificaron genes comunes.

4.3. Cuantificación de la implicación clínico-patológica de los genes identificados.

A continuación, los genes preseleccionados resultantes se validaron utilizando Kaplan-Meier Plotter (http://www.kmplot.com/; consultado el 11 de noviembre de 2021), una base de datos pública en línea que evalúa el efecto de genes seleccionados en los resultados clínicos de los pacientes. La supervivencia global (SG) se definió como la duración desde el momento del diagnóstico (en meses) hasta la muerte. Los datos de expresión genética y la información de supervivencia se derivan del Gene Expression Omnibus (GEO), el Atlas del genoma del cáncer (TCGA) y el Atlas europeo del genoma y el fenómeno (EGA). Los pacientes se clasificaron en dos grupos: (1) expresión alta (con valores de TPM por encima del cuartil superior) y (2) expresión baja/media (con valores de TPM por debajo del cuartil superior). Se utilizaron gráficos de Kaplan-Meier para comparar la SG de pacientes con adenocarcinoma de pulmón (LUAD) con expresión alta/intermedia versus baja de genes candidatos.

4.4. Agrupación de ontologías enriquecidas para los genes identificados

Para explorar si los genes identificados comparten vías comunes, se realizó un análisis de enriquecimiento de vías de Gene Ontology (GO) para los genes identificados utilizando la herramienta web Metascape (https://metascape.org/; consultada el 11 de noviembre de 2021) para obtener una anotación completa de la lista de genes. y recurso de análisis junto con GEO2R

4.5. Línea celular y cultivo celular

La línea celular epitelial basal alveolar de adenocarcinoma humano (A549), ampliamente utilizada como modelo para el adenocarcinoma de pulmón, se cultivó en medio Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI)-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10 %. (FBS; Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) y 100 unidades/mL de penicilina/estreptomicina (P/S; Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.). La línea celular se cultivó en una incubadora humidificada a 37 ◦C en una atmósfera de 5% de CO2. Cuando las células alcanzaron la confluencia, se recogieron usando tripsina al 0,5%, se centrifugaron a 100 xg durante 5 minutos y se usaron cuando fue necesario.

4.6. microgravedad

Se cultivaron células de cáncer de pulmón (A549) en un sistema clinostato 2D que imita el entorno de gravedad casi cero (microgravedad). Este Rotary Culture Max (RCMW™; Synthecon® Inc—Houston, TX, EE. UU.) es un biorreactor equipado con un recipiente de cultivo celular que incorpora un núcleo de perfusión microporoso y un sistema oxigenador en línea, que proporciona nutrientes y gasificación externa del medio. asegurando así un intercambio de gases adecuado y un entorno de cultivo celular de bajo cizallamiento. La cámara se llenó con los medios de cultivo que contenían las células. Esta cámara giraba horizontalmente alrededor de un eje perpendicular a la fuerza de gravedad a una velocidad de 10 rpm. El clinostato 2D se colocó dentro de la incubadora humidificada a 37 ◦C en una atmósfera de 5% de CO2. Las células A549 se recolectaron después de la microgravedad simulada (SMG) a las 24, 48 y 72 h. Para crear un entorno comparable para el cáncer de pulmón, se cultivaron células A549 en placas de cultivo en GG, en condiciones estáticas o sin rotación, y se mantuvieron cerca del dispositivo dentro de la incubadora humidificada (37 ◦C). Estas células se denominan grupo de control y también se recolectaron a las 24, 48 y 72 h.

4.7. Ensayo de viabilidad celular

Para las condiciones GG, se sembraron células A549 en 24-placas de cultivo celular de pocillos a una densidad de 3,0 × 104 células por 500 µl. Las células se recogieron mediante tripsinización a las 24, 48 y 72 h después de la siembra, luego se centrifugaron a 200 x g durante 5 minutos. Los sedimentos celulares obtenidos se reconstituyeron en medios de cultivo. Para las condiciones de SMG, se sembraron células A549 en el sistema giratorio clinostat 2D a una densidad de 6,0 x 104 células por 1 ml. Las células se recogieron a las 24, 48 y 72 h después de la exposición a SMG y luego se centrifugaron a 200 x g durante 5 minutos. Los sedimentos celulares obtenidos se reconstituyeron en medios de cultivo. Se realizó un ensayo de exclusión del colorante azul tripán (Sigma, EE. UU.). El recuento de células se determinó utilizando el contador de células automatizado CellDrop™.

4.8. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

Niveles de expresión génica (niveles de ARNm) de los genes identificados in silico (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP y BPIFA1) junto con marcadores del gen EMT (Tabla 3) También se determinaron en células A549 mediante qRT-PCR. Brevemente, la extracción del ARN total de las células se realizó utilizando el RNEasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania) a las 24, 48 y 72 h en GG y después de la exposición a SMG siguiendo los protocolos del fabricante. Se transcribió inversamente un µg de ARN total a un ADN complementario monocatenario (ADNc) en un volumen de reacción de 20 µl utilizando un kit de síntesis de ADNc iScript™ (Thermo, Waltham, MA, EE. UU.). La qRT-PCR se realizó utilizando la mezcla maestra PowerUp™ Sybr™ Green (Thermo, EE. UU.) en una máquina Quant Studio 5 pcr (Thermo, EE. UU.). Los pasos de amplificación por PCR fueron los siguientes: un paso de desnaturalización inicial a 95 ◦C durante 3 min, una temperatura de hibridación del gen diana durante 30 s y luego 72 ◦C durante 30 s. El valor del ciclo umbral de fluorescencia se obtuvo para cada gen. ∆∆El método Cq se utilizó para calcular el cambio relativo en la expresión génica después de la normalización con el gen constitutivo, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

Tabla 3. Lista de cebadores humanos. NOX1, NADPH Oxidasa 1; GDA, Guanina Desaminasa; TCN1, transcobalamina 1; FCGBP, proteína de unión a Fc gamma; BPIFA1, pliegue BPI que contiene el miembro 1 de la familia A; AZGP1, Alfa-2-Glicoproteína 1; CFB, Factor B del Complemento; VTCN1, dominio V-Set que contiene el inhibidor 1 de la activación de células T; AGR3, gradiente anterior 3; CTS1, supresor de tumores quimérico 1; F5, factor V de coagulación; CEACAM6, molécula 6 de adhesión a células CEA; BPIFB1, pliegue BPI que contiene el miembro 1 de la familia B; ZO-1, proteína 1 de Zonula occludens; MMP-9, metaloproteinasa de matriz 9; MMP-2, metaloproteinasa 2 de matriz; y GAPDH, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa

4.9. Análisis de interacción gen-gen

Los datos de qRT-PCR in vitro se implementaron en el análisis de interacción gen-gen utilizando la herramienta web in silico GeneMANIA (http://genemania.org/; consultado el 11 de noviembre de 2021), un algoritmo de red para predecir funciones genéticas utilizando un gran conjunto de datos de asociación funcional. Esto se realizó para evaluar más a fondo las interacciones entre los genes candidatos seleccionados; FCGBP, CST1, F5, CFB y BPIFB1 con genes EMT; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 y SNAI1, así como genes relacionados con la migración celular, MMP2 y MMP9.

4.10. Análisis estadístico

Se utilizó el software GraphPad Prism para realizar el análisis estadístico. Los resultados se expresan como datos individuales o como media ± desviación estándar (DE). Se utilizó la prueba t de Student para comparar varios grupos. Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante ANOVA de varianza unidireccional (ANOVA). Se determinaron los valores p y se determinaron los valores de p < 0.05, p < 0.01, p < 0,001 ( *, ** y ***, respectivamente). considerado como significativo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado (n=3).

Referencias

1. Blanco, RJ; Averner, MJN Humanos en el espacio. Naturaleza 2001, 409, 1115–6828. [Referencia cruzada]

2. Bradbury, P.; Wu, H.; Choi, JU; Rowan, AE; Zhang, H.; Poole, K.; Lauko, J.; Chou, J. Modelado del impacto de la microgravedad a nivel celular: implicaciones para las enfermedades humanas. Frente. Desarrollo celular. Biol. 2020, 8, 96. [CrossRef] [PubMed]

3. Yuan, M.; Liu, H.; Zhou, S.; Zhou, X.; Huang, YE-E.; Hou, F.; Jiang, W. El análisis integrador del módulo regulatorio revela asociaciones de microgravedad con disfunciones de sistemas multicuerpos y tumorigénesis. En t. J. Mol. Ciencia. 2020, 21, 7585. [CrossRef] [PubMed]

4. Cruciano, BE; Chouker, A.; Simpson, RJ; Mehta, S.; Marshall, G.; Smith, SM; Zwart, SR; Heer, M.; Ponomarev, S.; Whitmire, A.; et al. Desregulación del sistema inmunológico durante los vuelos espaciales: posibles contramedidas para las misiones de exploración del espacio profundo. Frente. Inmunol. 2018, 9, 1437. [CrossRef] [PubMed]

5. Nassef, MZ; Melnik, D.; Kopp, S.; Sahana, J.; Infanger, M.; Lützenberg, R.; Relja, B.; Wehland, M.; Grimm, D.; Krüger, M. Células de cáncer de mama en microgravedad: nuevos aspectos para la investigación del cáncer. En t. J. Mol. Ciencia. 2020, 21, 7345. [Referencia cruzada]

6. Takamatsu, Y.; Koike, W.; Takenouchi, T.; Sugama, S.; Wei, J.; Waragai, M.; Sekiyama, K.; Hashimoto, M. Protección contra enfermedades neurodegenerativas en la Tierra y el espacio. NPJ Microgravedad 2016, 2, 16013. [CrossRef]

7. Nassef, MZ; Kopp, S.; Wehland, M.; Melnik, D.; Sahana, J.; Krüger, M.; Corydon, TJ; Oltmann, H.; Schmitz, B.; Schütte, A. La microgravedad real influye en el citoesqueleto y las adherencias focales en las células de cáncer de mama humano. En t. J. Mol. Ciencia. 2019, 20, 3156. [Referencia cruzada]

8. Dietz, C.; Infanger, M.; Romswinkel, A.; Strube, F.; Kraus, A. Inducción de apoptosis y alteración de la adherencia celular en células de cáncer de pulmón humano bajo microgravedad simulada. En t. J. Mol. Ciencia. 2019, 20, 3601. [Referencia cruzada]

9. Ricci, G.; Cucina, A.; Proietti, S.; Dinicola, S.; Ferranti, F.; Cammarota, M.; Filippini, A.; Bizzarri, M.; Catizone, A. La microgravedad induce EMT transitoria en queratinocitos humanos mediante la regulación negativa temprana de la E-cadherina y la remodelación de la adhesión celular. J. Aplica. Ciencia. 2020, 11, 110. [Referencia cruzada]

10. Ahn, CB; Lee, J.-H.; Han, director general; Kang, H.-W.; Lee, S.-H.; Lee, J.-I.; Hijo, KH; Lee, JW La microgravedad simulada con un entorno flotante promueve la migración de cánceres de pulmón de células no pequeñas. Ciencia. Rep. 2019, 9, 14553. [CrossRef] [PubMed]

11. Pisanu, YO; Noto, A.; De Vitis, C.; Masiello, MG; Coluccia, P.; Proietti, S.; Giovagnoli, señor; Ricci, A.; Giarnieri, E.; Cucina, A. Las células madre del cáncer de pulmón pierden su estado predeterminado de tallo después de la exposición a la microgravedad. Res. BioMed. En t. 2014, 2014, 470253. [CrossRef] [PubMed]

12. Infanger, M.; Kossmehl, P.; Shakibaei, M.; Bauer, J.; Kossmehl-Zorn, S.; Cogolí, A.; Curcio, F.; Oksche, A.; Wehland, M.; Kreutz, RJC; et al. La ingravidez simulada cambia el citoesqueleto y las proteínas de la matriz extracelular en las células del carcinoma papilar de tiroides. Res. de tejido celular. 2006, 324, 267–277. [Referencia cruzada] [PubMed]

13. Chen, J.; Microgravedad, L. Células tumorales en microgravedad. En Hacia el espacio: un viaje sobre cómo los humanos se adaptan y viven en microgravedad; IntechOpen: Londres, Reino Unido, 2018; Volumen 139, págs. 259–268.

14. Grimm, D.; Schulz, H.; Krüger, M.; Cortés-Sánchez, JL; Egli, M.; Kraus, A.; Sahana, J.; Corydon, TJ; Hemmersbach, R.; Wise, PM La lucha contra el cáncer por microgravedad: El esferoide multicelular como modelo de metástasis. En t. J. Mol. Ciencia. 2022, 23, 3073. [Referencia cruzada]

15. Schabath, MB; Cote, ML Progreso y prioridades del cáncer: Cáncer de pulmón. Epidemiol del cáncer. Biomarca. Anterior. 2019, 28, 1563–1579. [Referencia cruzada] [PubMed]

16. Chung, JH; Ahn, CB; Hijo, KH; Yi, E.; Hijo, HS; Kim, HS; Lee, SH Efectos simulados de la microgravedad sobre la proliferación y migración de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas. Aerosp. Medicina. Tararear. Llevar a cabo. 2017, 88, 82–89. [Referencia cruzada]

17. Chang, D.; Xu, H.; Guo, Y.; Jiang, X.; Liu, Y.; Li, K.; Pan, C.; Yuan, M.; Wang, J.; Iluminado.; et al. La microgravedad simulada altera el potencial metastásico de una línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano. Vitr. Celúla. Desarrollo. Biol. Animación. 2013, 49, 170-177. [Referencia cruzada]

18. Hanahan, D.; Weinberg, R. Características del cáncer: la próxima generación. Celda 2011, 144, 646–674. [Referencia cruzada]

19. Ribatti, D.; Tama, R.; Annese, T. Transición epitelial-mesenquimatosa en el cáncer: una descripción histórica. Traducción Oncol. 2020, 13, 100773. [Referencia cruzada]

20. Shi, S.; Li, Q.; Cao, Q.; Diao, Y.; Zhang, Y.; Yue, L.; Wei, L. Los factores de transcripción EMT están involucrados en la adhesión celular alterada bajo un efecto de microgravedad simulado o sobrecarga mediante la regulación de E-cadherina. En t. J. Mol. Ciencia. 2020, 21, 1349. [Referencia cruzada]

21. Topal, U.; Zamur, C. Microgravedad, células madre y cáncer: una nueva esperanza para el tratamiento del cáncer. Int. de células madre. 2021, 2021, 5566872. [Referencia cruzada]

22. Ksiazkiewicz, M.; Markiewicz, A.; Zaczek, AJ Transición epitelial-mesenquimal: un sello distintivo en la formación de metástasis que vincula las células tumorales circulantes y las células madre cancerosas. Patobiología 2012, 79, 195–208. [Referencia cruzada] [PubMed]

23. Yan, T.; Tian, ​​D.; Chen, J.; Bronceado, Y.; Cheng, Y.; Sí, L.; Deng, G.; Liu, B.; Yuan, F.; Zhang, S. FCGBP es un biomarcador de pronóstico y está asociado con la infiltración inmune en el glioma. Frente. Oncol. 2021, 11, 769033. [CrossRef] [PubMed]