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L.P. Arantes1, M.L. Machado1, D.C. Zamberlan1, T.L. da Silveira1, T.C. da Silva1, I.B.M. da Cruz1 , E.E. Ribeiro2, M. Aschner3 y F.A.A. Soares1

1Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil 2Universidade Aberta da Terceira Idade, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM, Brasil

3Departamento de Farmacología Molecular, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY, USA

Cistanche tiene efecto antienvejecimiento

Abstracto

El guaraná (Paullinia cupana) es ingerido habitualmente por personas en la región amazónica y es un ingrediente clave en varias bebidas energéticas consumidas en todo el mundo. La extensión de la longevidad y la baja prevalencia de enfermedades crónicas relacionadas con la edad se han asociado a la ingesta habitual de guaraná.El antienvejecimientotambién se demostró potencial de guaraná en Caenorhabditis elegans; sin embargo, los mecanismos involucrados en sus efectos no están claros. Aquí, investigamos las vías putativas que regulan los efectos del extracto etanólico de guaraná (GEE) en la vida útil utilizando C. elegans. Las principales vías de longevidad conocidas se analizaron a través de gusanos mutantes y el ensayo RT-qPCR (DAF-2, DAF-16, SKN-1, SIR-2.1, HSF-1). También se investigó la posible implicación de la señalización purinérgica. Este estudio demostró que GEE actúa a través deantioxidanteactividad, vías DAF-16, HSF-1 y SKN-1, y ortólogo del receptor de adenosina humana (ADOR-1) para extender la vida útil. GEE también reguló a la baja skn-1, daf-16, sir-2.1 y hsp-16.2 en C. elegans de 9 días de edad, lo que podría reflejar una menor necesidad de activar estos genes protectores debido a la dirección directaantioxidanteEfectos. Nuestros resultados contribuyen a la comprensión de los efectos del guaraná in vivo, lo que podría ser útil para prevenir o tratar los trastornos asociados al envejecimiento, y también sugieren la señalización purinérgica como un objetivo terapéutico plausible para los estudios de longevidad.

Palabras clave: Envejecimiento; Antioxidante; Guaraná; Vida útil; Productos naturales; Xantinas

Introducción

Paullinia cupana, también conocida como guaraná, es una planta nativa de la cuenca del Amazonas y especialmente común en Brasil. El polvo de sus semillas es ingerido habitualmente por personas de todas las edades en la región amazónica principalmente por sus propiedades tónicas y estimulantes (1). Además, el guaraná es un ingrediente clave en varias bebidas energéticas consumidas en muchos países (2). Otros efectos farmacológicos informados del guaraná incluyen la pérdida de peso, la reducción de la síntesis de tromboxaneas plaquetarias, la protección contra las lesiones gástricas, la actividad antioxidante y los efectos antiinflamatorios [para su revisión ver: (1)]. Sin embargo, cuando se consume en exceso, el guaraná también puede afectar negativamente a la salud humana, causando ansiedad, interrupción del sueño y taquicardia, por ejemplo, debido a su alto contenido de cafeína (2,3).

La extensión de la longevidad en las personas que viven en Maués, una región amazónica en Brasil, se ha asociado a la dieta amazónica, incluida la ingesta habitual de guaraná (4). Además, un estudio epidemiológico asoció la ingestión de guaraná con una baja prevalencia de enfermedades crónicas relacionadas con la edad en la población amazónica (5). Recientemente, un estudio también demostró elantienvejecimientopotencial de extracto de semilla de guaraná en Caenorhabditis elegans (6). Sin embargo, no se identificaron los mecanismos subyacentes a los efectos del guaraná sobre el envejecimiento.

C. elegans ha sido un modelo adecuado para las respuestas de los organismos subyacentes a diversos compuestos sintéticos y naturales y su influencia en el envejecimiento y la vida útil. Las vías biológicas vitales y numerosos aspectos del envejecimiento son análogos en nematodos y mamíferos, incluidos los humanos (7).

Dado que el porcentaje de personas mayores está creciendo en todo el mundo acompañado de una mayor frecuencia de enfermedades relacionadas con la edad, es esencial identificar terapias eficaces y dianas terapéuticas que podrían mejorar la calidad de vida (8). Aquí, investigamos las vías putativas que regulan los efectos del guaraná en la vida útil utilizando C. elegans.

Material y métodos

Productos químicos

El agar, el etanol (96%), el cloroformo, el colesterol, el FUDR (5-fluoro-20-desoxiuridina), el inhibidor de la proteasa, los cócteles inhibidores de la fosfatasa, los cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la albúmina sérica bovina (BSA) se compraron a Sigma (EE. UU.). Los cebadores TaqMans utilizados para el análisis qRT-PCR y Trizol se compraron a Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific Corporation (EE. UU.). Todos los demás reactivos fueron comprados a Synth (Brasil).

Tensiones y mantenimiento

Las cepas utilizadas en este estudio fueron Bristol N2 (tipo salvaje); CB1370, daf-2 (e1370) III; CF1038, daf-16 (mu86) I; EU1, skn-1(zu67); PS3551, hsf-1(sy441) I; TK22, mev-1(kn1); y VC199, sir-2.1(ok434), obtenido del Caenor- habditis Genetics Center (CGC), Universidad de Minnesota, EE.UU., así como la Escherichia coli OP50. La cepa EG6890, ador-1 (ox489), fue suministrada amablemente desde el laboratorio del Dr. Erik Jorgensen (Universidad de Utah, EE. UU.). Esta cepa tiene una deleción de 1 kb aguas arriba y los tres primeros exones del gen ador-1, y fue superada 6 veces; El gen ador-1 codifica un ortólogo del receptor de adenosina humana (9).

Los nematodos se mantuvieron y ensayaron a 20 °C en placas de agar de medio de crecimiento de nematodos (NGM) que llevaban un césped de E. coli OP50 (10). La sincronización de los cultivos de nematodos se logró mediante el tratamiento de blanqueamiento de hermafroditas grávidos y se dejó que los huevos eclosionaran durante la noche en tampón M9 (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl y 1 mM MgSO4) (10).

Preparación de material vegetal y extracto

El polvo de semillas tostadas de Paullinia cupana Kunth var. sorbilis (Mart.), el guaraná, fue aislado y suministrado por EMBRAPA Oriental (Agropecuary Research Brazilian Enterprise) ubicada en el oeste de la Amazonía en Maués, Amazo- nas, Brasil. El extracto hidroalcohólico se obtuvo como se describe en otra parte (11). Brevemente, el extracto se produjo utilizando etanol al 70%. Después de 24 h, se filtró la solución resultante, se eliminó el etanol y se liofilizó el extracto. Las xantinas y catequinas predominantes presentadas en el extracto de guaraná fueron analizadas mediante HPLC, mostrando las siguientes concentraciones: cafeína=12,240 mg/g, teobromina=6,733 mg/g y catequinas totales=4,336 mg/g (11).

Tratamiento de los gusanos

Las placas NGM que llevan un césped de E. coli OP50 (como fuente de alimento) se incubaron previamente a 37 ° C durante la noche. El extracto etanólico de guaraná liofilizado (GEE) se disuelvió en agua destilada en frío en autoclave (121 °C, 30 min) y se extendió sobre las placas a concentraciones finales de 100, 500 y 1.000 mg/ml de agar. Las larvas L1 sincronizadas (10) se transfirieron con una pipeta a la superficie de las placas de tratamiento y se cultivaron hasta la edad adulta a 20 ° C.

Vida útil

Los análisis de vida útil comenzaron en larvas L4 en placas NGM sembradas con E. coli OP50 en ausencia o presencia de GEE (día 0). Los animales fueron transferidos a platos frescos con o sin GEE cada dos días para evitar la confusión de generaciones, y se anotaron al mismo tiempo hasta la muerte. La ausencia de respuesta a un estímulo mecánico se calificó como muerte. Los gusanos eran censurados si se arrastraban fuera de la placa, mostraban órganos internos extruidos o morían debido a la progenie eclosionante dentro del útero. Los ensayos de vida útil se repitieron tres veces con 60-120 gusanos por ensayo. A través de cepas mutantes, se analizaron las principales vías de longevidad conocidas (12,13): i) daf-2 y daf-16, la señalización del factor de crecimiento similar a la insulina / insulina (IGF)-1 (IIS), que el receptor DAF-2 señala a través de una vía PI3-quinasa / AKT conservada y regula DAF-16 / FOXO, responsable de promover la expresión de genes que confieren longevidad prolongada y una mayor resistencia al estrés; ii) skn-1, que está relacionado con las proteínas de la familia de los vertebrados Nrf y promueve la expresión de enzimas de desintoxicación en respuesta al estrés oxidativo, como la glutatión-S-transferasa; iii) sir-2.1, que codifica una proteína similar a la histona desacetilasa que integra el estado metabólico con la vida útil, y se asocia a la restricción calórica; y iv) hsf-1, que codifica el factor de transcripción de choque térmico-1 (HSF-1) e induce la activación de varios genes de choque térmico o chaperonas involucradas en el mantenimiento de la homeostasis conformacional de las pro-teínas, entre otras funciones importantes. También se investigó una posible relación entre la longevidad y la señalización purinérgica a través de la cepa mutante ador-1.

Como las bacterias desempeñan un papel en la mortalidad por C. elegans, se evaluó el crecimiento de E. coli OP50 en presencia o ausencia de GEE para investigar si los efectos beneficiosos podrían ser una respuesta a una propiedad antimicrobiana. La absorbancia de la bacteria se midió durante un período de 12 h en medio líquido (14).

Período de salud

Se evaluaron los parámetros de comportamiento relacionados con el período de salud (15). El bombeo faríngeo se evaluó con un microscopio Nikon E200 observando el número de contracciones faríngeas durante un intervalo de 60 s en adultos jóvenes de tipo salvaje.

Se seleccionó la frecuencia de thrash para el análisis de la locomo- ción. Los adultos jóvenes de tipo salvaje de control o tratamientos GEE fueron seleccionados individualmente y colocados en una gota de M9. Se permitió que los gusanos se adaptaran durante 1 minuto y luego se cuantificó el número de golpes con un microscopio Nikon E200 durante un intervalo de 20 s. Un thrash se definió como un cambio en la dirección de flexión en la mitad del cuerpo.

Los análisis se realizaron en tres ensayos independientes. Se examinaron treinta nematodos por grupo.

Aislamiento de ARN y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR)

Los gusanos de tipo salvaje en gusanos adultos de 9 días de edad se analizaron para la expresión génica relacionada con la longevidad y las respuestas al estrés oxidativo. Después de la edad adulta, los gusanos se transfirieron cada dos días a placas que contenían 150 mM de FUDR (5-fluoro-20-desoxiuridina) para inhibir la reproducción, en presencia o ausencia de GEE. El ARN de 20.000 gusanos por condición se aisló utilizando Trizol seguido de la extracción de cloroformo, como se describió anteriormente (16) y 1 mg de ARN de entrada se transcribió inversamente a ADNc mediante el kit de transcripción inversa de cDNA de alta capacidad de Applied Biosystems (Applied Biosystems, EE. UU.). El análisis de la expresión se realizó mediante el análisis Custom TaqMans Array utilizando los ensayos de expresión génica TaqMans correspondientes para la superóxido dismutasa mitocondrial sod-3 (Ce02404515_g1), glutatión-S-transferasa gst-4 (Ce02 458730_g1), gamma glutamilcisteína sintetasa gcs-1 (Ce02436726_g1), daf-16 (Ce02422835_g1), sir-2.1 (Ce02 459018_g1), hsf-1 (Ce02423758_m1), proteína de choque térmico hsp-16.2 (Ce02506738_s1) y skn-1 (Ce02407445_g1) (Applied Biosystems). La expresión génica diana se normalizó a los valores de expresión de actina afd-1 (Ce02414 573_m1). La expresión relativa de cada gen se determinó mediante el método 2 DDCt (17) y los datos se informan como cambios de pliegue en los niveles de ARNm en relación con afd-1. Este experimento se llevó a cabo en tres preparaciones de gusanos independientes, cada una por triplicado.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 5 para Windows (GraphPad Software, USA). Los resultados se informan como medios ±SD de al menos tres experimentos individuales. La prueba t de Student se utilizó para comparar pares de grupos, mientras que un ANOVA de una o dos vías seguido de la prueba post hoc de Bonferroni se utilizó para comparar tres o más grupos. Todas las curvas de supervivencia se analizaron mediante la prueba log-rank (Mantel-Cox). La significación estadística se determinó como Po0,05.

Resultados

En nuestro estudio, los controles silvestres de tipo C. elegans tuvieron una vida útil media de 11 días y una vida útil máxima de 14 días. En los medios que contienen GEE, la vida útil media de los gusanos de tipo silvestre se extendió a 13 días a 100 mg / ml (18%) y a 15 días a 500 y 1,000 mg / ml (36%). La vida útil máxima se extendió en un promedio del 28% en las tres concentraciones probadas (Tabla 1). No hubo diferencias en el crecimiento de E. coli en la presencia o ausencia de 1.000 mg/ml de GEE (datos no mostrados).

El período de salud de los gusanos también se prolongó después del tratamiento con GEE. El extracto retrasó la disminución relacionada con la edad en el bombeo faríngeo (100, 500 y 1,000 mg / ml) y thrashes (1,000 mg / ml) a partir del día 9 de la edad adulta (Figura 1 A y B). En consecuencia, se seleccionó la concen- tración de 1.000 mg/ml de GEE y muestras de gusanos adultos de 9 días para su posterior análisis.

Extracto de GEE (1.000 mg/ml) vida útil media extendida de mutantes mev-1 en un 44% y vida útil máxima en un 77,8% (Tabla 1), mostrando una conexión entreantioxidante

Los ensayos de vida útil se realizaron a 20 ° C. La vida útil máxima se representa como la vida útil media del 10% más longevo de la población de gusanos. Cada experimento se repitió tres veces comenzando con al menos 60 nematodos por grupo. Los datos se informan como media±SD. *Po0.05 en comparación con el grupo no tratado (prueba log-rank de Mantel-Cox).

Figura 1. Efectos del extracto etanólico de guaraná (GEE) sobre los parámetros de comportamiento relacionados con la salud. Velocidad de bombeo faríngeo (A) y

frecuencia de thrash (B) durante el envejecimiento en gusanos de tipo salvaje. Los datos se informan como media ±SD (n = 30 gusanos por grupo). *P o0,05 en comparación con el control (ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni.

yantienvejecimientoActividades. El extracto también extendió la vida útil media de los mutantes daf-2 y sir 2.1, estableciendo que el extracto no actuó a través de estas vías para promover la extensión de la vida útil. En contraste, el tratamiento no prolongó la vida útil de los mutantes daf-16, skn-1, hsf-1 y ador-1 (Tabla 1).

Los análisis de PCR evaluaron la modulación génica por GEE (Tabla 2). GEE a 1,000 mg/ml de skn-1 regulado, daf-16, sir-2.1 y hsp-16.2 en adultos de 9 días de edad. No se observó ningún efecto sobre la expresión de hsf-1, gst-4, gcs-1 y sod-3.

Discusión

Como se demostró anteriormente (1), en nuestro estudio, el extracto de guaraná también extendió la vida útil y la duración de la salud de los C. elegans de tipo silvestre. Por lo tanto, las vías putativas que podrían estar implicadas en suantienvejecimientose investigaron los efectos. Aquí dentroantienvejecimientolos efectos se mostraron a una concentración más alta del extracto (1.000 frente a 300 mg/ml como se había demostrado anteriormente). Esta discrepancia puede deberse a diferencias en la preparación del extracto (extracto hidroalcohólico vs acuoso)

Tabla 2. Expresión de ARNm de cambio de pliegue de genes relacionados con la longevidad y el estrés oxidativo en gusanos adultos de 9 días de edad de tipo silvestre tratados con extracto etanólico de guaraná (GEE)

Este experimento fue evaluado por RT-qPCR y llevado a cabo en tres preparaciones de gusanos independientes, cada una por triplicado. Los datos se informan como medios de cambio de pliegue en los niveles de ARNm en relación con afd-1 (actina) ±SD. * Po0.05 en comparación con no tratado (ANOVA bidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni).

y método de administración (agar vs medio líquido) y puede ser el resultado de la deriva natural en la variación genética en la población de gusanos (18,19).

El estrés oxidativo parece ser un factor importante que limita la esperanza de vida tanto en C. elegans como en humanos y se asocia con muchas enfermedades relacionadas con la edad (20,21), lo que dirige la atención haciaantioxidantecompuestos con efectos in vivo. Investigar más a fondo si GEE podría extender la vida útil a través deantioxidanteactividad, se evaluó su efecto sobre los gusanos mev-1. Esta cepa se caracteriza por la sobreproducción de superóxido y tiene una vida útil más corta en comparación con la cepa de tipo salvaje (22). Consistente con lo descrito anteriormenteantioxidanteefectos del extracto de guaraná (6), tratamiento GEE significativamente extendido medio y vida útil máxima de los gusanos mev-1.

Además de eso, las vías DAF-16, HSF-1 y SKN-1, involucradas en la señalización de insulina / IGF (IIS), parecían esenciales para la extensión de la vida útil mediada por GEE. La reducción del IIS se asocia con la longevidad y la adaptación a condiciones ambientales adversas en C. elegans, Drosophila, mamíferos y posiblemente humanos (13). HSF-1 funciona en cooperación con DAF-16 para activar la expresión de genes diana comunes, incluida la familia de sHsp (genes de proteínas de choque térmico pequeño) (23). SKN-1/Nrf integra IIS y regula la respuesta al estrés oxidativo y la expresión de genes de desintoxicación (24).

DAF-16, HSF-1 y SKN-1 también podrían mediar la extensión de la salud y la homeostasis de proteínas (25). DAF-16 está involucrado en la formación de agregados de proteínas de alto peso molecular menos tóxicos (26), y aunque HSF-1 regula la actividad de desagregación de proteínas liberando pequeños agregados tóxicos, podría tener un efecto beneficioso que contribuye al aclaramiento de proteínas a través del metabolismo enzimático (27,28). SKN-1 es mejor conocido como un regulador deantioxidantey la defensa xenobiótica, pero también se ha implicado en funciones adicionales que incluyen la proteostasis y la regulación metabólica (24).

Las metilxantinas, como la cafeína, son los principales componentes del guaraná y es bien sabido que estos compuestos pueden actuar a través de los receptores de adenosina en mamíferos (29). La cafeína se ha asociado con efectos beneficiosos, incluidos los efectos relacionados con el envejecimiento (30,31) y la mejora de los fenotipos de deterioro cognitivo al antagonizar los receptores de adenosina A1 y A2A en roedores (32). Por lo tanto, probamos si la extensión de la vida útil inducida por GEE también podría depender de ADOR-1, un homólogo del receptor de adenosina (33). Nuestros resultados indicaron que los gusanos ador-1 (ox489) no mostraron una vida útil prolongada, demostrando, por primera vez, un posible papel del sistema purinérgico en la extensión de la vida útil. En consecuencia, la señalización purinérgica puede estudiarse de manera rentable en el futuro como un objetivo potencial para la modulación de la longevidad.

Aunque GEE tiene altos niveles de cafeína, y estudios previos describieron los efectos de la cafeína en los gusanos (34-36), elantienvejecimientolos efectos de GEE podrían estar relacionados con los efectos sinérgicos de diferentes compuestos. La concentración de cafeína en el extracto es mucho menor que la concentración efectiva previamente demostrada y se demostró que el extracto alcaloide de guaraná no tuvo los mismos efectos beneficiosos (6). Además, los datos de la literatura muestran que los extractos podrían tener mayores actividades farmacológicas que los compuestos aislados (37,38).

La regulación a la baja de skn-1, daf-16, sir-2.1 y hsp-16.2 en C. elegans de 9 días de edad tratados con GEE podría reflejar una menor necesidad de activar estos genes para reparar el daño celular durante el envejecimiento en comparación con los gusanos no tratados, posiblemente debido a la dirección directaantioxidanteefectos ejercidos por el extracto (39,40).

Por lo tanto, este estudio mostró que elantienvejecimientolos efectos del guaraná están mediados porantioxidanteactividad y vías DAF-16, HSF-1 y SKN-1. Además, ADOR-1 también fue necesario para los efectos de GEE en la vida útil, lo que indica una posible participación del sistema purinérgico en la longevidad. Nuestros resultados contribuyen a la comprensión de los efectos del guaraná in vivo, lo que podría ser útil para prevenir o tratar los trastornos asociados al envejecimiento, y sugieren la señalización purinérgica como un objetivo terapéutico plausible para los estudios de longevidad.

Reconocimientos

Los autores están agradecidos a Caenorhabditis Genetics

Centro (CGC) en la Universidad de Minnesota, EE.UU. para el suministro de cepas de gusanos y al laboratorio del Dr. Erik Jorgensen (Universidad de Utah, EE.UU.) para suministrar amablemente la cepa EG6890. Este estudio fue apoyado por el Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil (CNPq), Coordenac ̧ão de Aperfeic ̧oamento de Pessoal a Nível Superior, Brasil (CAPES), PRONEM/FAPERGS/ CNPq y MCTI/CNPq #472669/2011-7 y #475896/ 2012-2. Michael Aschner fue apoyado en parte por la subvención R01 ES10563 de los NIH. Las fuentes de financiación no estaban involucradas

en el diseño del estudio o la interpretación de los datos.