Extracción asistida por ultrasonido de ácidos fenólicos, flavonoles y flavan{1}oles a partir de pieles y semillas de uva moscatel utilizando disolventes eutécticos profundos naturales y modelado predictivo mediante redes neuronales artificiales

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ResumenEl objetivo de este estudio fue investigar la eficiencia de extracción de 9 solventes eutécticos profundos naturales (NDES) con la ayuda de ultrasonido paraácidos fenólicos, flavonolesy flavan-3-oles en pieles y semillas de uva moscatel (Carlos) en comparación con etanol al 75 %. Se aplicó una red neuronal artificial (ANN) para optimizar el contenido de agua NDES, el tiempo de ultrasonicación, la proporción de sólido a solvente y la temperatura de extracción para lograr los rendimientos de extracción más altos para ácido elágico, catequina y epicatequina. Una NDES recién formulada (#1) consiste en cloruro de colina:ácido levulínico: etilenglicol 1:1:2 y 20 por ciento de agua extrajeron la mayor cantidad de ácido elágico en la piel con 22,1 mg/g. Este rendimiento fue 1.73-vez del obtenido con etanol al 75 por ciento. Una NDES modificada (#3) que consiste en cloruro de colina: prolina: ácido málico 1:1:1 y 30 por ciento de agua extrajo la mayor cantidad de catequina (0.61 mg/g) y epicatequina (0,89 mg/g) en la piel y 2,77 mg/g y 0,37 mg/g en la semilla, respectivamente. El rendimiento óptimo de ácido elágico en la piel utilizando NDES #1 fue de 25,3 mg/g (observado) y 25,3 mg/g (previsto). El rendimiento óptimo de (catequina más epicatequina) en semilla utilizando NDES #3 fue de 9,8 mg/g (observado) y 9,6 mg/g (predicho). Este estudio mostró la alta eficiencia de extracción de NDES seleccionadas para polifenoles en condiciones optimizadas.

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Introducción

Los disolventes eutécticos profundos naturales (NDES) se preparan mezclando donantes de enlaces de hidrógeno con aceptores de enlaces de hidrógeno en una proporción molar apropiada [1]. El punto de fusión de un componente debe ser más bajo que el punto de fusión del otro [1]. Después de calentar y mezclar, este medio se vuelve líquido a temperatura ambiente. Se añade agua para estabilizar y polarizar la mezcla. La investigación en el campo de la extracción fitoquímica usando NDES se ha expandido debido a su efectiva extractabilidad y solubilidad. No obstante, múltiples factores juegan un papel importante al comparar NDES con solventes orgánicos, incluidos el rendimiento, el costo, la recuperación y la toxicidad. Investigaciones anteriores investigaron NDES sobre la extracción de diferentes polifenoles de varias matrices alimentarias. Por ejemplo, Búbalo et al. (2016) compararon 5 NDES, agua, metanol al 70 % (v/v) y metanol acidificado al 70 % (v/v) para extraer antocianinas, catequina y quercetina-3-O-glucósido de la piel de las uvas rojas. Se encontró que una NDES que consiste en cloruro de colina: ácido oxálico (1:1) con 25 por ciento de agua (v/v) es el solvente de extracción más eficiente [2]. En otro estudio, Pani´c et al. (2019) probaron 8 NDES y acidificaron el 70 por ciento de etanol y observaron cloruro de colina: ácido cítrico (2:1) con 30 por ciento de agua (v/v) como la mejor NDES para extraer antocianinas del orujo de uva [3]. Las uvas Muscadine (Vitis rotundifolia) son nativas de los estados del sureste y la primera uva silvestre cultivada en los Estados Unidos [4]. Las uvas Muscadine se producen en 12 estados y suman alrededor de 5000 acres [5]. Hay 100 variedades de uva moscatel y cada una varía en características físicas, sensoriales o químicas [4]. Entre ellos, Carlos es una uva moscatel ampliamente plantada debido a su alto rendimiento y consistencia de crecimiento [4]. La uva Carlos muscadine es de tamaño mediano, de color bronce, más gruesa en la piel y contiene cuatro semillas en promedio [6]. Las uvas Muscadine contienen cantidades significativas depolifenolesque se sabe que reducen la inflamación [7], inhiben el crecimiento del tumor de próstata [8] y mejoran las respuestas metabólicas de los diabéticos [9]. El orujo de uva moscatel, un subproducto del jugo de uva moscatel o de la vinificación, consiste en pieles y semillas. Un estudio de investigación anterior utilizó una mezcla de acetona: agua: ácido acético (70:29,7:0,3, v/v) para extraer compuestos fenólicos de las semillas, la piel y la pulpa de ocho cultivares de uva moscatel cultivada en Florida, incluido Carlos [10]. Sin embargo, el uso de solventes orgánicos inflamables y su baja eficiencia de extracción dificultaron las aplicaciones prácticas. La mayor parte del orujo de uva moscatel todavía se desecha como desecho. La red neuronal artificial (ANN) es un sistema de mapeo no lineal compuesto por varias unidades básicas de procesamiento conectadas por asociaciones ponderadas. Estas unidades de procesamiento se denominan "neuronas" [11]. Las redes neuronales artificiales son un enfoque de aprendizaje automático para predecir o pronosticar una respuesta basada en múltiples entradas [11]. Investigaciones anteriores han aplicado métodos de superficie de respuesta (RSM) para la optimización y predicción de la extracción. Sin embargo, pocos estudios han utilizado ANN para el mismo propósito. Por ejemplo, Sinha et al. (2013) sugirieron que ANN tiene un mejor rendimiento de predicción que RSM en la extracción de colorante natural de semillas de Bixa Orellana (Annatto) [12]. En un estudio similar, Ciric et al. (2020) informaron que el modelo ANN era mejor que RSM para predecir las extracciones de compuestos fenólicos del ajo [13]. El objetivo de esta investigación fue investigar la eficiencia de extracción de 9 NDES para ácidos fenólicos, flavonoles y flavanoles-3- en comparación con etanol al 75 por ciento con la ayuda de ultrasonido. Se aplicó ANN para predecir y optimizar las condiciones de extracción sobre el rendimiento fenólico. La hipótesis era que las NDES con composiciones específicas extraen cantidades más altas de ácidos fenólicos, flavonoles y flavanoles que el 75 % de etanol, y la mayor eficiencia de extracción se puede lograr mediante un modelo predictivo basado en ANN.

2. Materiales y Métodos 2.1. Productos químicos y reactivos El cloruro de colina, el ácido levulínico, el 1,2-propanodiol, el ácido DL-málico, el ácido oxálico, el ácido clorhídrico y el ácido fórmico se obtuvieron de Acros Organics (Morris Plains, NJ, EE. UU.). El ácido láctico, el etilenglicol, la glicina, el acetonitrilo de grado HPLC, el metanol y el etanol se adquirieron de Fishers Scientific (Waltham, Massachusetts, EE. UU.). La L-prolina y el clorhidrato de betaína se adquirieron de Alfa Aesar (Ward Hill, MA, EE. UU.). Se adquirieron estándares de grado HPLC de ácido elágico, ácido gálico, ácido ferúlico, ( plus )-catequina, (-)-epicatequina, miricetina, quercetina y kaempferol de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).

2.2. Diseño de NDESNDES #1-2 en la Tabla 1 se diseñaron en nuestro estudio anterior [14]. El cloruro de colina en NDES #1-2 se seleccionó como aceptor de hidrógeno, mientras que se seleccionaron dos donantes de hidrógeno diferentes para cada nueva NDES. Las relaciones molares entre los donantes y aceptores de hidrógeno y el contenido de agua se determinaron en experimentos preliminares. NDES #3–9 en la Tabla 1 fueron seleccionados de la literatura ya que estudios previos los han designado como NDES efectivos en la extracción de polifenoles. El contenido de agua en NDES #3 se modificó a partir de la literatura citada. Se aplicó un método de calentamiento para preparar la NDES [15]. Brevemente, el aceptor de enlaces de hidrógeno se mezcló con cada uno de los componentes donantes de enlaces de hidrógeno en matraces Erlenmeyer con una barra de agitación. La mezcla en el matraz se cerró y se calentó a 50 ◦C durante aproximadamente 30 min o hasta que se formó un líquido transparente y permaneció estable a temperatura ambiente. Los contenidos de agua en la Tabla 1 se calcularon de acuerdo con el volumen final de las mezclas de NDES. El pH de las NDES enumeradas en la Tabla 1 se midió con un medidor de pH (AB15, Accumet, Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). 2.3. Preparación de muestras/Extracción asistida por ultrasonido Paulk Vineyards (Wray, Georgia, EE. UU.) proporcionó pieles y semillas de uva moscatel (Vitis rotundifolia) congeladas (cultivar: Carlos). Después de eliminar las cáscaras, las hojas o los pecíolos, el orujo se separaba en semillas y piel. Luego, las muestras se secaron usando un horno de vacío (Isotemp, Modelo 285A, Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) a 60 ◦C y una presión de vacío inferior a − 30 in.Hg. A continuación, las muestras se homogeneizaron en un polvo fino utilizando un molinillo quimérico (A1{{105}}00, RRH Inc., 2800 W, Zhejiang, China). Utilizando una proporción inicial de sólido a disolvente de 1:20 (g: ml), se mezclaron 0,50 g de piel o semilla de uva moscatel en 10 ml de NDES o etanol al 75 por ciento por triplicado. Luego, las muestras se colocaron en un baño de agua (60 ◦C) y se sonicaron (VCX 1500, Sonics & Materials Inc., 1500-Watt, 50/60 Hz, Newtown, CT, EE. UU.) durante 30 min al 100 por ciento. amplitud durante dos rondas (15 min/ronda). A continuación, las muestras se centrifugaron inmediatamente (Sorvall ST 8, Fisher Scientific, Suzhou, China) a 3260 g hasta obtener un sobrenadante claro. Por último, los sobrenadantes se recogieron y almacenaron en un congelador a −20 ◦C para análisis HPLC de ácidos fenólicos (ácido elágico, ácido gálico, ácido ferúlico), flavonoles (miricetina, quercetina y kaempferol) y flavanoles-3- (catequina y epicatequina). 2.4. Análisis HPLC de ácidos fenólicos, flavonoles y flavan-3-oles Los ácidos fenólicos, flavonoles y flavan{49}}oles se analizaron en un sistema HPLC (Agilent Technologies 1200, Waldbronn, Alemania) de acuerdo con el método descrito en Sandhu y Gu (2013) [16]. El sistema de HPLC consta de una bomba binaria, un muestreador automático, un compartimento de columna termostatizado, un detector de matriz de diodos y un detector de fluorescencia. Los extractos de piel o semilla de uva se hidrolizaron antes de los análisis de ácidos fenólicos y flavonoles. La hidrólisis se realizó mezclando 1 ml del extracto con 4 ml de solución de hidrólisis (HCl 1,2 M con 50 por ciento de metanol) y se colocó en un baño de agua (Precisión, Modelo 2837, 400 W, 50/60 Hz, Thermo Scientific, Marietta , OH, EE. UU.) a 90 ◦C durante 80 min. A continuación, las muestras se enfriaron a 25 ◦C seguido de sonicación durante 5 min. La hidrólisis del extracto no fue necesaria para el análisis de catequina y epicatequina. Los extractos hidrolizados y no hidrolizados se filtraron a través de una membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,45 μm antes de los análisis de HPLC. Para analizar ácido elágico, ácido gálico, ácido ferúlico, miricetina, quercetina, kaempferol, catequina y epicatequina, se inyectaron 10 µL en una columna SB-C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm, Zorbax, Agilent, Santa Clara, CA, EE.UU). Las fases móviles fueron (A) 0,5 por ciento de ácido fórmico y (B) 100 por ciento de acetonitrilo. La velocidad de flujo fue de 1 ml/min con un gradiente modificado de 25 min de la siguiente manera: 0–5 min, 10–30 por ciento de B; 5–10 min, 30–40 por ciento B; 10–20 min, 40–50 por ciento B; 20–25 min, 50–10 por ciento B; seguido de 5 min de equilibrio. La temperatura de la columna se fijó en 30 ◦C. La longitud de onda de detección fue de 260 nm para ácido elágico, ácido gálico y ácido ferúlico y de 360 ​​nm para miricetina, quercetina y kaempferol en un detector de matriz de fotodiodos. La excitación y emisión de catequina y epicatequina fueron de 230 nm y 321 nm, respectivamente, utilizando un detector de fluorescencia. Los compuestos de polifenoles se cuantificaron utilizando curvas estándar de ácido elágico, ácido gálico, ácido ferúlico, miricetina, quercetina, kaempferol, catequina y epicatequina. Todas las curvas estándar tenían 7 puntos y R2 > 0,99. 2.5. Diseño personalizado para redes neuronales artificiales Cuatro variables de extracción independientes con cuatro niveles: contenido de agua (15 a 60 por ciento), tiempo de ultrasonicación (5 a 35 min), proporción de sólido a solvente (1:5 a 1:20) y extracción temperatura (30–60 ◦C) (Tabla S1) para optimizar el rendimiento de extracción de ácidos fenólicos, flavonoles y flavanoles-3-. A diferencia de los diseños clásicos, como el diseño de superficie de respuesta, el diseño basado en ANN no requiere repetir ejecuciones y prefiere una estructura de datos diferente. En nuestro estudio anterior [14], ANN fue un método más confiable para predecir el rendimiento de extracción que RSM. Por lo tanto, se seleccionó ANN en este estudio para predecir el rendimiento de extracción de ácido elágico, catequina y epicatequina. Se generó un diseño personalizado con 40 ejecuciones (Tabla S2) en JMP Pro (Versión 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.) para proporcionar datos específicamente para el modelado predictivo ANN. Se aplicó la aleatorización de las 40 ejecuciones para eliminar cualquier sesgo. La ecuación principal de ANN se muestra a continuación: the=∑jj=1 wh jpg plus bhk, k=1toK (1) donde h es el número de neuronas en la capa oculta, j y k son el número de variables de entrada y neuronas ocultas, respectivamente, p es la variable de entrada, bh es el sesgo de la capa oculta y wh es el peso en la capa oculta. Los rendimientos de extracción de ácido elágico, catequina y epicatequina en relación con las cuatro variables independientes se analizaron utilizando ANN entrenando primero los datos y luego eligiendo el mejor tipo de activación y una cantidad de neuronas que resulte en un ajuste adecuado de los datos. Para evaluar el éxito de los modelos de predicción, se han evaluado tres valores: R-cuadrado, la raíz cuadrada del error de predicción cuadrático medio (RASE) (ecuación (2)), y el error absoluto promedio (AAE). RASE es RASE=̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ SSE/n √ (2) Donde SSE dona el cuadrado y suma los errores de predicción (diferencias entre las respuestas reales y las respuestas pronosticadas) y n para una serie de observaciones. R-cuadrado cercano a 1 con RASE y AAE cercano a cero significa un mayor ajuste de los datos en el modelo. 2.6. Estadísticas Los rendimientos de extracción de ácidos fenólicos, flavonoles y flavanoles-3- se compararon con ANOVA unidireccional seguido de la prueba t de Student en p menor o igual a 0,05 usando JMP Pro (Versión 14.2, SAS Institute Inc., Cary, Carolina del Norte, EE. UU.). Se compararon cada nde y el etanol al 75 por ciento usando las pruebas de Dunnett a p menor o igual a 0,05. El análisis de componentes principales (PCA) se realizó en JMP Pro (Versión 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.) para los compuestos fenólicos extraídos de la piel y la semilla de la uva moscatel. 3. Resultados y Discusión 3.1. Polifenoles extraídos por NDES de hollejos de uva moscatel Se utilizaron nueve NDES y 75 por ciento de etanol para la extracción de polifenoles de los hollejos de uva moscatel. La Tabla 2 muestra el rendimiento de extracción de ácido elágico, ácido gálico, ácido ferúlico, miricetina, quercetina, kaempferol, catequina y epicatequina. El ácido elágico fue el polifenol extraíble más abundante en la piel de la uva, seguido por el ácido gálico y el ácido ferúlico, respectivamente. Este hallazgo fue consistente con estudios previos [17,18]. NDES #1, #8, #7, #3, #2 y #9 extrajeron cantidades significativamente más altas de ácido elágico en la piel de la uva que el 75 por ciento de etanol. El mayor rendimiento de extracción de ácido elágico se logró con NDES #1 seguido de NDES #8 a 22,1 ± 2,2 mg/g y 21,3 ± 2,5 mg/g, respectivamente (Tabla 2). Sin embargo, no hubo diferencia significativa entre NDES #1 y NDES #8 según la prueba t de Student. Curiosamente, se encontró que NDES #1 es la NDES menos efectiva para extraer antocianinas de

orujo de arándano [14]. Esto sugirió que NDES #1 puede extraer selectivamente ácido elágico o elagitaninos de la matriz alimentaria que también contiene antocianidinas. Tal selectividad puede atribuirse a diferencias en las interacciones moleculares entre la NDES y clases fenólicas específicas. La Figura S1 (panel A) muestra el cromatograma de HPLC de ácido gálico, ácido elágico y ácido ferúlico extraídos de la piel de la uva por NDES #1 y detectados a 260 nm. El etanol al 75 por ciento extrajo 12,7 ± 1,2 mg de ácido elágico por gramo de piel de uva. El rendimiento de extracción más bajo de ácido elágico se observó en NDES #4 a 7,44 ± 0,6 mg/g. El rendimiento de extracción de ácido gálico por NDES #9, #8, #1, #4, #7 y #3 fue comparable y significativamente superior al 75 por ciento de etanol. La cantidad más alta de ácido gálico fue extraída por NDES #9 a 10.4 ± 0.5 mg/g, mientras que la cantidad más baja de 5.55 ± {{40}} Se extrajo 0,1 mg/g por NDES #5. La cantidad más alta de ácido ferúlico fue extraída por NDES #1 a 6.32 ± 0.7 mg/g y la cantidad más baja fue extraída por NDES #5 a 3.11 ± 0.{{5{{52 }}}}mg/g. Además, no hubo diferencia significativa entre NDES #1 y el 75 por ciento de etanol en la extracción de ácido ferúlico (Tabla 2). La mayor cantidad de catequina y epicatequina fueron extraídas por NDES #3 en 0.61 ± 0.1 mg/g y 0.89 ± 0.1 mg/ g, respectivamente (Cuadro 2). Mientras tanto, NDES #3 y #6 extrajeron cantidades significativamente mayores de epicatequina que el 75 por ciento de etanol. La Figura S2 (panel A) muestra el cromatograma de HPLC de catequina y epicatequina extraídos por NDES #3 de la piel de la uva. Sin embargo, no se detectó catequina en el extracto de etanol al 75 por ciento. Las cantidades más bajas de catequina (0.02 mg/g) y epicatequina ({{90}}.14 mg/g) fueron extraídas por NDES #2 y NDES # 5, respectivamente. La miricetina fue el flavonol más abundante y el kaempferol el que menos. La prueba de Dunnett reveló que las ECM y el etanol al 75 por ciento fueron comparables en la extracción de miricetina, quercetina y kaempferol (Tabla 2). La mayor cantidad de miricetina se extrajo con NDES n.° 1 (1,84 mg/g), seguido de etanol al 75 % (1,73 mg/g) y luego NDES n.° 8 (1,67 mg/g). La cantidad más alta de quercetina se extrajo con etanol al 75 % (0,41 mg/g), NDES n.º 1 (0,40 mg/g) y NDES n.º 8 ({ {143}},38 mg/g). En contraste, las cantidades más bajas de miricetina y quercetina fueron extraídas por NDES #5 a 0.87 mg/g y 0.27 mg/g, respectivamente. Este hallazgo enfatiza aún más una débil capacidad general de NDES #5 para extraer polifenoles de la piel de la uva. La cantidad más alta de kaempferol se extrajo con etanol al 75 por ciento (0.05 mg/g), y la más baja se extrajo con NDES #5 y NDES #6 (0,03 mg/g). La Figura S1 (panel B) muestra el cromatograma de HPLC de miricetina, quercetina y kaempferol extraídos de la piel de la uva por NDES #1 detectado a 360 nm. La suma más alta de ácidos fenólicos, flavonoles y flavan{103}oles fue de 40,7 mg/g extraídos con NDES n.° 1, seguido de 39,8 mg/g extraídos con NDES n.° 8, mientras que la suma más baja fue de 18,4 mg/g extraídos. por NDES #5 (Tabla 2). El pH de NDES osciló entre 0,3 y 3,3 (Tabla 1). La correlación Rcuadrada entre el pH de las ECM y los rendimientos de ácidos fenólicos, flavonoles y flavanoles{-3-oles se enumeran en la Tabla 2. La falta de correlación entre el pH y los rendimientos de extracción sugirió que el pH no afectó la eficiencia de extracción. 3.2. Polifenoles extraídos por NDES de semillas de uva moscatel Los rendimientos generales de extracción de ácidos fenólicos, flavonoles y flavanoles de semillas de uva fueron notablemente más bajos que los de las pieles (Tabla 3). Los polifenoles extraíbles más abundantes en las semillas fueron catequina y epicatequina, mientras que no se detectó kaempferol. La compleja matriz de semillas que contiene aceite (13 por ciento, p/p de base seca) es una posible explicación de la baja capacidad de extracción de los compuestos fenólicos de las semillas de uva [19]. La mayor cantidad de catequina fue extraída por NDES #3 a 2,77 mg/g (Tabla 3). Este rendimiento fue significativamente mayor que todos los demás NDES y 75 por ciento de etanol. La Figura S2 (panel B) muestra el cromatograma de HPLC de catequina y epicatequina extraídos por NDES #3 de semillas de uva. La cantidad más baja de catequina se extrajo mediante NDES #5 a 0,30 mg/g. Todas las NDES excepto las NDES #1, #2 y #9 extrajeron cantidades significativamente más altas de epicatequina que el 75 por ciento de etanol (Tabla 3). Las concentraciones más altas de epicatequina se extrajeron con NDES #4 (0,71 mg/g) y NDES #5 (0,68 mg/g), mientras que las más bajas se extrajeron con etanol al 75 por ciento (0,11 mg/g). El ácido gálico fue el ácido fenólico extraíble más abundante en las semillas de uva, seguido por el ácido ferúlico y el ácido elágico, respectivamente. La mayor cantidad de ácido gálico fue extraída por NDES #4 a 0,45 mg/g, seguida por NDES #9 y NDES #8. Estas ECM extrajeron cantidades significativamente más altas de ácido gálico que el 75 por ciento de etanol. La cantidad más baja de ácido gálico (0,2 mg/g) se extrajo mediante NDES #3. La mayor extracción

el rendimiento de ácido elágico se obtuvo con NDES #9 (0.26 mg/g) seguido de NDES #6 (0.17 mg/g), que fueron significativamente más altos que el 75 por ciento de etanol. De manera similar, las ECM #3 extrajeron la cantidad más baja de ácido elágico con 0.05 mg/g. Además, NDES #6, #7 y #3 extrajeron cantidades significativamente más altas de ácido ferúlico que el 75 por ciento de etanol. El rendimiento de extracción de ácido ferúlico más bajo fue 0,5 mg/g por NDES #5. Además, no se detectó ácido ferúlico en el extracto NDES #9. Esto probablemente se debió a que la solubilidad del ácido ferúlico fue menor en la NDES #9 que en otras NDEs. El extracto de miricetina más alto se obtuvo con 75 por ciento de etanol y NDES #7 a 0.18 mg/g, que fueron superiores a todas las NDE. El mayor rendimiento de extracción de quercetina fue por NDES #6 (0.14 mg/g) y NDES #3 (0.13 mg/g) y ambos NDES fueron mejores que el 75 por ciento de etanol. De manera similar, el pH de las NDES no influyó en el rendimiento de la extracción, como lo indica la baja correlación (R-cuadrado) entre el pH de las NDE y los rendimientos de ácidos fenólicos, flavonoles y flavanoles-3- enumerados en la Tabla 3. 3.3 . Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para asociar el rendimiento de extracción de varios compuestos fenólicos en la piel y las semillas de la uva con NDE y etanol al 75 por ciento (Fig. 1). El PCA se realizó en una matriz de correlación para detectar una posible selectividad de algunas ECM hacia la extracción de compuestos o grupos fenólicos específicos. Alrededor del 85 por ciento de la varianza de los datos de la piel fue explicada por los componentes principales 1 y 2. El diagrama de carga (Fig. 1B) muestra una alta correlación entre los ácidos fenólicos (ácido elágico, ácido gálico, ácido ferúlico) y flavonoles (miricetina, quercetina, y kaempferol). Para extraer estos grupos, los mejores disolventes son NDES n.º 1, n.º 8, n.º 7 y etanol al 75 por ciento, como se muestra en el gráfico de puntuación (Fig. 1A). Por su parte, la catequina y la epicatequina aparecieron segregadas del resto de grupos fenólicos. Como se muestra en la Fig. 1A, NDES #3 fue selectivo para extraer catequina y epicatequina de la piel de la uva. Esta fue una observación interesante porque NDES#3 estuvo entre las NDES menos efectivas para extraer proantocianidinas, que son oligómeros y polímeros de catequina y epicatequina [14]. Esto sugirió que NDES #3 puede ser selectivo para las proantocianidinas de tamaños moleculares más pequeños. La agrupación de compuestos fenólicos en el gráfico de carga de la piel (Fig. 1B) fue diferente de la semilla (Fig. 1D) independientemente de los bajos rendimientos de estos compuestos en las semillas de uva. Los componentes principales primero y segundo explicaron alrededor del 73 por ciento de la varianza de los datos de semillas. La quercetina, la miricetina y el ácido ferúlico se extrajeron de manera más eficiente con NDES n.º 6, n.º 7 y etanol al 75 por ciento, como se muestra en el gráfico de puntuación (Fig. 1C). El ácido elágico y el ácido gálico se extrajeron de forma más eficaz mediante NDES #9. Una vez más, la NDES #3 extrajo la catequina con la mayor eficiencia, similar a la observada con la piel de las uvas. La epicatequina fue extraída con mayor eficiencia por NDES #5, #4 y NDES #8.

3.4. Optimización de la extracción de ácidos fenólicos y flavonoles de hollejos de uva moscatel y modelos de predicción ANN Cloruro de colina: ácido levulínico: etilenglicol 1:1:2 (NDES #1) mostró el mayor rendimiento de extracción de ácido elágico y, por lo tanto, fue elegido para una mayor optimización y predicción. Se evaluaron los impactos de cuatro factores, incluido el contenido de agua, el tiempo de ultrasonidos, la relación sólido-disolvente y la temperatura de extracción, para la extracción de ácidos fenólicos y flavonoles. Además, se aplicaron cuatro niveles para cada factor de extracción en un total de 40 ejecuciones aleatorias. El rendimiento de extracción experimental de ácido elágico, ácido gálico, ácido ferúlico, miricetina y quercetina, junto con la suma de estos cinco, se muestra en la Tabla 4. En general, el rango de diferencia de rendimiento de extracción entre el más bajo y el más alto fue relativamente grande. para ácidos fenólicos. Por ejemplo, el rendimiento más bajo para el ácido elágico fue de 9.03 mg/g (ejecución n.º 17) y el más alto fue de 25,3 mg/g (ejecución n.º 15), lo que resultó en una diferencia de 16,2 mg/g (ejecutar #17). Además, la suma más baja de rendimiento fue 20,7 mg/g, y la más alta fue 71,5 mg/g. Esto ilustra los impactos significativos de los diferentes niveles de cada factor de extracción en el rendimiento de extracción. La prueba #15 extrajo la mayor cantidad de ácido elágico. La condición de extracción de la corrida n.º 15 fue de 45 mL/10{{130}} mL de contenido de agua, 25 min de ultrasonidos, 1:10 (g: mL) de relación de sólido a solvente , y temperatura de extracción de 60 ◦C. La Figura S3 muestra el cromatograma de HPLC de ácidos fenólicos optimizados extraídos de la piel de la uva por NDES #1 (ejecución #15 en la Tabla 4). El ácido gálico más alto (18,7 mg/g) se logró utilizando las condiciones de extracción en el ensayo n.º 24 y el más bajo fue 6,63 mg/g utilizando el ensayo n.º 40. Para el ácido ferúlico, la operación #22 extrajo la mayor cantidad a 19,2 mg/g, mientras que no se detectó ácido ferúlico en las operaciones #14, #17, #29 y #34. La ejecución n.° 22 se extrajo con un contenido de agua de 60 ml/100 ml, 5 min de ultrasonicación, 1:5 para una relación sólido a solvente y una temperatura de extracción de 60 ◦C. La ejecución n.º 2 extrajo la mayor cantidad de miricetina (10,1 mg/g) y quercetina (1,87 mg/g). Las condiciones de extracción de la corrida #2 fueron 60 mL/100 mL de contenido de agua, 35 min de ultrasonicación, 1:20 de relación sólido a solvente y temperatura de extracción de 60 ◦C. El mi rendimiento cierto más bajo (3,79 mg/g) se extrajo mediante el ensayo n.º 40. Los gráficos de contorno en la Fig. 2 demuestran el efecto de los parámetros de extracción (X1, X2, X3 y X4) en el rendimiento previsto de ácido elágico extraído por NDES #1 de la piel de la uva. Los rendimientos previstos de ácido elágico en la Tabla 4 se utilizaron para construir estos gráficos de recuento. Cada panel ilustra el impacto de 2 parámetros de extracción. Las líneas de contorno están etiquetadas con el rendimiento de ácido elágico (mg/g). El contenido de agua óptimo previsto fue de aproximadamente 35 a 45 ml/100 ml de NDES, como se muestra en las figuras 2B y 2C. Un tiempo de ultrasonicación más largo aumentó el rendimiento de ácido elágico (Fig. 2D y 2E), lo que indica un papel fundamental de la sonicación en la extracción de NDES. Durante la extracción, mezclar pieles o semillas de uva con NDES introdujo partículas y gas, lo que agregó sitios de cavitación acústica para ultrasonidos para generar numerosas burbujas pequeñas en el NDES. La implosión de estas burbujas condujo a temperaturas extremas, diferenciales de presión, fuerzas de cizallamiento elevadas, macroturbulencias y micromezclas, lo que agitó de manera efectiva a NDES para acelerar la difusión y transferencia de masa. Cuando las burbujas de cavitación implosionaron en la superficie de las semillas de uva o las partículas de la piel, los microchorros resultantes y las colisiones entre partículas provocaron el desprendimiento de la superficie, la erosión, la descomposición de las partículas, la sonoporación y la ruptura celular [20]. Todos estos efectos mecánicos de la cavitación inducida por ultrasonido intensificaron la penetración de las ECM en el interior de la célula, de modo que los compuestos fenólicos intercelulares de la matriz alimentaria se transfirieron a los disolventes. La proporción óptima de sólido a solvente fue de 1:10, como se indica en las figuras 2B, 2D y 2F. Por último, temperaturas de extracción más altas de hasta 60 ◦C parecen tener un efecto positivo en la extractabilidad del ácido elágico como se muestra en las Fig. 2C, 2E y 2F. Esto sugiere una relación directa entre la temperatura de extracción y el rendimiento de ácido elágico extraído de la piel de la uva. Los rendimientos de extracción de ácido elágico (Tabla 4) se analizaron para el modelado de predicción utilizando redes neuronales artificiales. Los datos experimentales se dividieron aleatoriamente en un conjunto de entrenamiento y un conjunto de validación. La razón para incluir un conjunto de validación por parte del software estadístico es suprimir el sobreajuste. Para predecir el rendimiento de ácido elágico (Y), se evaluaron los mismos cuatro factores de extracción independientes (X1, X2, X3 y X4), 1 o 2 capas ocultas con un número diferente de neuronas y tres funciones de activación. Las funciones de activación aplicadas fueron tangente hiperbólica, lineal y gaussiana. A continuación, los conjuntos de datos se entrenaron hasta que se alcanzó un valor alto de R-cuadrado tanto para el entrenamiento como para la validación. Se generaron los datos de predicción y un modelo. La mejor estructura ANN se eligió analizando las cuatro entradas (X1, X2, X3 y X4) con una capa oculta utilizando la función gaussiana con diez neuronas (Figura S5). El R-cuadrado de los conjuntos de entrenamiento y validación fue 0,99, mientras que el RASE y AAE del modelo fueron 0,062 y 0,044, respectivamente. El R-cuadrado de la validación ANN de ácido elágico en este estudio (0,99) fue mayor que la validación ANN de procianidinas (0,95) y antocianinas (0,91) en un estudio anterior [14]. Sin embargo, este aumento en R2 puede atribuirse al mejor ajuste del modelo generado de los datos en este estudio, lo que podría deberse a los errores experimentales más pequeños. Los modelos ANN predictivos para la extracción de ácido elágico usando NDES #1 se mostraron como la ecuación 3–13:

Cistanche para mejorar la inmunidad

Conclusión

Los hallazgos actuales presentaron evidencia adicional sobre la efectividad de las capacidades de NDES para extraer polifenoles de los subproductos de la industria alimentaria. Los resultados respaldaron la hipótesis de una extracción superior asistida por ultrasonido de NDES sobre el 75 por ciento de etanol. NDES extrajo con eficacia tres ácidos fenólicos, dos flavonoles y tres flavanoles-3-oles de pieles y semillas de uva. NDES #1 fue la NDES más efectiva para extraer ácido elágico, mientras que NDES #3 fue notablemente selectiva para extraer catequina y epicatequina. Un inconveniente notable de NDES es su alta viscosidad, que presenta desafíos durante el manejo y la recuperación. En el presente estudio, las redes neuronales artificiales, independientemente de sus limitaciones de resultados, demostraron un enfoque práctico para el modelado predictivo. Las ECM son medios robustos para recuperar fitoquímicos de los sistemas alimentarios. Algunas ECM también presentan un solvente menos tóxico para estudiar estos fitoquímicos en células vivas [21,22]. Por fin, los solventes eutécticos profundos naturales son medios de extracción alternativos efectivos a los solventes orgánicos.

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