Abstracto

ObjetivoInvestigar el mecanismo de los glucósidos de feniletanol (CPhG) de Cistanche sobre la función inmune innata, el crecimiento tumoral y la apoptosis de células tumorales en ratones desnudos con osteosarcoma resistente a los medicamentos.MétodosSe estableció una línea celular de osteosarcoma humano MG-63 resistente a los medicamentos mediante el método de concentración en gradiente y se construyó un modelo de ratón desnudo de osteosarcoma resistente a los medicamentos (36 ratones en total, 6 por grupo). El grupo modelo recibió solución salina normal mediante alimentación forzada; el grupo de metotrexato (MTX) recibió una inyección intraperitoneal de MTX (20 mg/kg) cada tres días; el grupo de combinación recibió una inyección intraperitoneal de MTX cada tres días combinada con alimentación forzada diaria de CPhG en dosis media (250 mg/kg); los grupos de CPhG en dosis alta, media y baja recibieron alimentación forzada diaria de CPhG en dosis alta (500 mg/kg), media (250 mg/kg) y baja (125 mg/kg), respectivamente. Se observaron cambios en el tamaño de los tumores en ratones desnudos, se trazaron curvas del volumen medio del tumor a lo largo del tiempo y se calculó la tasa de inhibición del tumor; Los niveles séricos de IL-2 y TNF- en ratones desnudos se detectaron mediante ELISA; la apoptosis de las células tumorales se midió mediante citometría de flujo; Se utilizó Western blot para detectar la expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis Bcl-2, Bax y la expresión de p-AKT, p-mTOR, p-PI3K en tejidos tumorales.ResultadosEn comparación con el grupo modelo, el volumen y el peso del tumor en todos los grupos de tratamiento se redujeron significativamente (P <0,001); en comparación con el grupo modelo y el grupo de MTX, los niveles séricos de IL-2 y TNF- en ratones desnudos de todos los grupos de CPhG y el grupo de combinación aumentaron significativamente (P <0,01); en comparación con el grupo modelo, la expresión de Bax en todos los grupos de tratamiento estuvo significativamente regulada positivamente (P <0,001), y la expresión de Bcl-2 en los grupos de CPhG de dosis alta y media y el grupo de combinación estuvo significativamente regulada negativamente (P <0,001); en comparación con el grupo modelo y el grupo de MTX, la tasa de apoptosis tumoral en ratones desnudos de todos los grupos de CPhG y el grupo de combinación aumentó significativamente, mientras que los niveles de p-AKT, p-mTOR y p-PI3K disminuyeron significativamente (P <0,05).ConclusiónLos CPhG pueden mejorar significativamente la función inmune en ratones desnudos que padecen osteosarcoma resistente a los medicamentos y promover la apoptosis de las células tumorales mediante la regulación de la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR y la expresión de las proteínas apoptóticas Bax y Bcl-2, inhibiendo así eficazmente el crecimiento tumoral.

Palabras claveosteosarcoma;Cistanche feniletanol glucósidos; MG-63; células tumorales; apoptosis; mecanismo de acción; Vía de señalización PI3K/AKT/mTOR

 

BENEFICIOS DE CISTANCHE TUBULOSA

 

 

 

 

 

 

Osteosarcoma (OS)Es un tumor óseo primario altamente maligno, con la mayor incidencia entre los tumores óseos malignos primarios en adolescentes, acompañado de tasas de discapacidad y mortalidad extremadamente altas. En la actualidad, las dosis altas de metotrexato (MTX) solo o combinado con otros agentes quimioterapéuticos después de la cirugía pueden mejorar eficazmente la tasa de supervivencia de los pacientes con OS [1]. Sin embargo, algunos pacientes con OS son insensibles a la quimioterapia debido a la resistencia a los medicamentos, lo que lleva a la progresión del tumor. Además, los subconjuntos de linfocitos T en pacientes con tumores a menudo se encuentran en un estado de desequilibrio inmunológico, y la quimioterapia puede agravar aún más los trastornos inmunológicos y la inmunosupresión a corto plazo [2]. Los estudios han demostrado que mejorar las respuestas inmunes humanas puede mejorar el pronóstico de los pacientes con OS desde la perspectiva de las características biológicas del OS [3]. La resistencia a la quimioterapia es uno de los problemas más comunes e intratables que conducen al fracaso del tratamiento en pacientes con OS, y la inmunosupresión es también uno de los factores clave que causan la rápida progresión del tumor [4].

La vía de señalización de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)/proteína quinasa B (AKT)/diana de rapamicina en mamíferos (mTOR) se considera una de las vías oncogénicas más importantes en los cánceres humanos. Esta vía a menudo está sobreactivada en la OS, lo que puede impulsar la proliferación, invasión, metástasis y angiogénesis de las células de la OS, inhibir la apoptosis y conducir aún más a la resistencia de la OS a los fármacos quimioterapéuticos [5]. Los estudios han confirmado que los glucósidos de feniletanol (CPhG) de Cistanche, el componente principal deCistanche deserticola, puede mejorar la función inmune e inhibir el crecimiento tumoral en ratones con hepatoma [6].in vitroLos estudios han demostrado que las CPhG pueden inhibir significativamente la proliferación de células de hepatoma HepG2 e inducir su apoptosis [7]. La inducción de la apoptosis celular es el principal mecanismo de los fármacos antitumorales actuales y también un punto de investigación en el tratamiento de la OS en los últimos años. Los ratones desnudos comparten muchas similitudes con los humanos en anatomía, fisiología y biología, y tienen una alta aceptabilidad para tumores trasplantados, lo que permite el xenotrasplante de ciertas células tumorales heterólogas, por lo que se utilizan ampliamente para establecer modelos tumorales [8-9]. Este estudio pretende construir un modelo de ratón desnudo de osteosarcoma resistente a los medicamentos, observar los efectos de las CPhG sobre la función inmune y la vía PI3K/AKT/mTOR en este modelo, así como su efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral y el mecanismo farmacológico, para proporcionar referencias para ampliar las ideas de tratamiento clínico y la investigación básica de la OS.

 

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1 Materiales y métodos

1.1 Animales de experimentación

Se compraron treinta y seis ratones desnudos de grado SPF (de 6 a 8 semanas de edad, con un peso de 19 a 25 g) de Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd., con el certificado de animal número 202367524. Este experimento fue aprobado por el Comité de Ética de Animales de Laboratorio de la Universidad Northwest Minzu (Xbmu-3m-202306).

1.2 Línea celular

Se compraron MG-63 células del banco de células de la Academia China de Ciencias en Shanghai.

1.3 Fármacos y Reactivos

Suero bovino fetal, medio DMEM con alto contenido de glucosa, tripsina-EDTA al 0,25 %, MTX (Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd., números de lote PWL001, MA0212, MA0233-1, MB1156-1, respectivamente); CPhG (Shaanxi Senyuan Biotechnology Co., Ltd., número de lote SY20231212605); anticuerpo anti-p-mTOR, anticuerpo anti-p-PI3K, anticuerpo anti-p-AKT, anticuerpo anti-Bcl-2, anticuerpo anti-Bax (Hangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd., números de lote HA600094, HA721673, ET1607-73, ET1702-53, ET1603-34, respectivamente); Kits de ELISA para TNF- y IL-2 (Hangzhou Lianke Biotechnology Co., Ltd., números de lote EK282, EK202, respectivamente).

1.4 Instrumentos

centrífuga refrigerada de alta velocidad de escritorio CT14RD (Shanghai Tianmei Biochemical Instrument Co., Ltd.); SW-CJ-1FD banco limpio (Suzhou Purification Co., Ltd.); CO-5AC incubadora de células (Sanyo, Japón); Microscopio invertido de fluorescencia AE31 (Xiamen Motic Industrial Group Co., Ltd.); RT-6100 lector de microplacas (Shenzhen Rayto Life Sciences Co., Ltd.); Sistema de electroforesis en gel PowerPoc, analizador de imágenes en gel ChemiDoc™ (Bio-Rad, EE. UU.).

 

1.5 Métodos experimentales

1.5.1 Establecimiento de una línea celular de osteosarcoma humano MG-63 resistente a medicamentos (MG-63/MTX)

Las células MG-63 se cultivaron hasta la fase de crecimiento logarítmico con una confluencia celular del 80 %. Se añadió medio de cultivo celular preparado previamente que contenía MTX 100 ng/ml y el medio se cambió después de 48 h. Cuando las células alcanzaron nuevamente el 80% de confluencia, se añadió la misma concentración de medio que contenía MTX. Los pasos anteriores se repitieron para permitir que las células de osteosarcoma MG-63 crecieran de manera estable en un medio que contenía 100 ng/ml de MTX. Luego, la concentración de MTX en el medio se aumentó gradualmente mediante el mismo método, usando 200 ng/ml, 500 ng/ml, 1000 ng/ml, 2000 ng/ml, 5000 ng/ml y 10000 ng/ml en secuencia. Después de 5 meses de cultivo, se seleccionó para experimentos posteriores la línea celular de osteosarcoma resistente a medicamentos (MG-63/MTX) que crecía de manera estable en 10000 ng/ml de MTX.

 

 

1.5.2 Establecimiento de un modelo de ratón desnudo con osteosarcoma resistente a los medicamentos

El modelo animal de osteosarcoma se estableció haciendo referencia a la literatura [10]. Se prepararon células MG-63/MTX en una suspensión celular de 4 x 10⁶/100 μl y se inyectaron 100 μl por vía subcutánea en la axila de ratones desnudos para observar la formación de tumores.

1.5.3 Agrupación e intervención de animales

Los ratones desnudos portadores de tumores se dividieron aleatoriamente en un grupo modelo, un grupo de MTX, un grupo de MTX combinado con CPhG (MTX-CPhG), un grupo de CPhG en dosis altas (CPhGs-H), un grupo de CPhG en dosis media (CPhGs-M) y un grupo de CPhG en dosis bajas (CPhGs-L), con 6 ratones en cada grupo. La alimentación forzada se inició el día 6 después del modelado. Los ratones del grupo modelo recibieron 10 μL/g de solución salina normal al día mediante alimentación forzada; el grupo de MTX recibió una inyección intraperitoneal de 20 mg/kg de MTX cada tres días; el grupo de MTX-CPhG recibió una alimentación forzada diaria de 250 mg/kg de CPhG combinada con una inyección intraperitoneal de 20 mg/kg de MTX cada tres días; el grupo CPhGs-H recibió una alimentación forzada diaria de 500 mg/kg de CPhG; el grupo CPhGs-M recibió una alimentación forzada diaria de 250 mg/kg de CPhG; el grupo CPhGs-L recibió una alimentación forzada diaria de 125 mg/kg de CPhG. Todos los ratones desnudos fueron tratados de forma continua durante 15 días.

1.5.4 Medición del volumen y peso del tumor en ratones desnudos con osteosarcoma resistente a los medicamentos

Se observó y registró el volumen tumoral de ratones desnudos en cada grupo, y se trazaron curvas de crecimiento tumoral. Veinticuatro horas después de la última administración, los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical, se diseccionaron y pesaron los tumores y se calculó la tasa de inhibición tumoral. Las fórmulas son las siguientes: Volumen del tumor=1/2 (diámetro largo del tumor × diámetro corto del tumor²) Tasa de inhibición del tumor=[(peso medio del tumor del grupo modelo − peso medio del tumor del grupo de tratamiento)/peso medio del tumor del grupo modelo] × 100 %

1.5.5 Detección de niveles séricos de IL-2 y TNF- mediante ELISA

Se extrajo suero de ratones desnudos de cada grupo y se detectaron mediante ELISA los niveles séricos de IL-2 y TNF- de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

1.5.6 Detección de apoptosis de células tumorales mediante citometría de flujo

Los tejidos tumorales de cada grupo se trituraron, se molieron, se filtraron, se centrifugaron y se lisaron glóbulos rojos para preparar suspensiones unicelulares en tubos de centrífuga. La concentración celular se ajustó a 1 x 10⁶/ml, las células se resuspendieron en 100 µl de tampón de unión, se les añadieron 5 µl de AV-FITC y PI, se incubaron en la oscuridad durante 15 minutos, se centrifugaron, se resuspendieron y se les añadieron 400 µl de tampón de unión. Después de mezclar, las muestras se detectaron mediante citometría de flujo.

1.5.7 Detección de p-AKT, p-mTOR, p-PI3K y proteínas apoptóticas Bcl-2, Bax mediante Western blot

Los tejidos tumorales de cada grupo se trituraron y se colocaron en un homogeneizador, se lisaron con tampón de lisis de proteínas y se homogeneizaron. Después de la lisis, el sobrenadante se recogió mediante centrifugación a 12.000 r/min. Se preparó gel electroforético para la separación de proteínas, seguido de transferencia y bloqueo de membrana. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios a 4 grados durante la noche, se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar con tampón TBST en un agitador, se añadió solución luminiscente ECL para su desarrollo. Después de la fijación, se realizó un análisis de imágenes en gel y los valores grises de las bandas de proteínas se analizaron utilizando el software Image J.

1.6 Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 7 y SPSS 25.0. Los datos de medición se expresaron como media ± desviación estándar (x ± s). Se utilizó ANOVA unidireccional para la comparación entre grupos con distribución normal y varianza homogénea, y se utilizó una prueba no paramétrica para datos de distribución no normal. Se utilizó la prueba t pareada para analizar la tasa de inhibición tumoral. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

 

 

Figura 1. Comparación morfológica de células MG-63 y MG-63/MTX (×200)

2 resultados

2.1 Línea celular de osteosarcoma MG-63 resistente a medicamentos (MG-63/MTX)

Las células MG-63 originales crecieron adherentemente con tamaño mediano, en su mayoría con forma de huso, ocasionalmente irregulares, con núcleos grandes y nucléolos claros (Figura 1-A). Las células MG-63/MTX eran alargadas, fusiformes o irregulares, con pseudópodos evidentes (Figura 1-B).

2.2 Comparación del crecimiento tumoral en ratones de cada grupo

Desde el día 6 de la alimentación forzada, el volumen del tumor en los grupos de tratamiento fue significativamente menor que el del grupo modelo. El día 21 de la alimentación forzada, se compararon los tumores de 3 ratones desnudos en cada grupo (Figura 2-A). El volumen del tumor en todos los grupos de tratamiento fue menor que en el grupo modelo (P <0,001). El volumen del tumor en los grupos CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L y MTX-CPhGs fue menor que el del grupo MTX (P <0,001). Entre los grupos de CPhG, el volumen del tumor disminuyó gradualmente al aumentar la concentración del fármaco y la diferencia con el grupo modelo se volvió más significativa (Figura 2-B). Los resultados indicaron que las CPhG podrían inhibir significativamente el crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores resistentes a los medicamentos, y el efecto inhibidor se correlacionó positivamente con la concentración de CPhG.

En comparación con el grupo modelo, el peso medio del tumor en los grupos MTX, CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L y MTX-CPhGs disminuyó significativamente (P <0,001). En comparación con el grupo de MTX, la tasa de inhibición tumoral en los grupos CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L y MTX-CPhGs aumentó significativamente, y en los grupos CPhGs-H, CPhGs-M y CPhGs-L, la tasa de inhibición tumoral aumentó de una manera dependiente de la dosis al aumentar la concentración del fármaco (Tabla 1).

2.3 Efectos de las CPhG sobre los niveles séricos de IL-2 y TNF- en ratones desnudos portadores de tumores resistentes a los medicamentos

En comparación con el grupo modelo, el nivel sérico de TNF- en el grupo de MTX aumentó significativamente (P <0,05), y los niveles séricos de TNF- y IL-2 en el grupo MTX-CPhG aumentaron significativamente (P <0,01). Además, los niveles séricos de TNF- en los grupos CPhGs-H, CPhGs-M y CPhGs-L fueron significativamente más altos que los del grupo modelo (P <0,001), el nivel sérico de IL-2 en el grupo CPhGs-M aumentó (P <0,01) y los niveles séricos de IL-2 en los grupos CPhGs-H y CPhGs-L aumentaron de manera más significativa (P <0,001). En comparación con el grupo de MTX, los niveles séricos de TNF- y IL-2 en los grupos CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L y MTX-CPhGs aumentaron significativamente (P <0,001) (Tabla 2). Esto sugiere que las CPhG pueden mejorar la función inmune innata en ratones con tumores OS resistentes a los medicamentos mediante la regulación de la expresión de TNF- y IL-2.

 

Figura 2. Comparación de volúmenes tumorales en ratones desnudos con tumores en cada grupo después de la intervención (x ± s, n=3, mm3)

Nota: Grupo modelo; grupo MTX; grupo CPhGs-L; grupo de glucósidos totales de feniletanol de Cistanche deserticola en dosis bajas; grupo CPhGs-M; grupo de glucósidos totales de feniletanol de Cistanche deserticola en dosis media; grupo CPhGs-H; grupo de glucósidos totales de feniletanol de Cistanche deserticola en dosis altas; grupo MTX-CPhG; comparado con el grupo modelo, ***P<0.001; compared with the MTX group, ###P<0.001

Tabla 1. Efecto de los glucósidos feniletanoides de Cistanche sobre el peso del tumor en ratones desnudos portadores de tumores (n=3)

Grupo	Peso medio del tumor (g)	Tasa de inhibición (%)
Modelo	0.79 ± 0.04	-
MTX	0.49 ± 0.03	35.73 ± 4.61
CPhG–L	0.33 ± 0.01	58.55 ± 4.02
CPhG–M	0.31 ± 0.02	60.50 ± 0.98
CPhG–H	0.28 ± 0.01	64.58 ± 1.77
MTX-CPhG	0.18 ± 0.01	75.77 ± 1.78

*Nota: El grupo "Modelo" no tiene una tasa de inhibición reportada en la tabla fuente (que se muestra como guión largo). Si lo desea, también puedo agregar los marcadores de significado (por ejemplo, *, ##, etc.) como notas a pie de página exactamente como en la figura.

2.4 Efectos de las CPhG sobre la apoptosis de células tumorales en ratones desnudos portadores de tumores resistentes a los medicamentos

En comparación con el grupo modelo, la tasa de apoptosis tumoral en los grupos MTX y CPhGs-L aumentó significativamente (P <0,05), y la de los grupos CPhGs-H, CPhGs-M y MTX-CPhGs aumentó de manera más significativa (P <0,001). En comparación con el grupo de MTX, la tasa de apoptosis tumoral en los grupos CPhGs-H, CPhGs-M y MTX-CPhGs aumentó (P <0,001) (Figura 3, Tabla 3). Los resultados anteriores muestran que las CPhG pueden promover la apoptosis de células tumorales en ratones desnudos portadores de tumores resistentes a los medicamentos.

2.5 Efectos de las CPhG sobre la expresión de p-AKT, p-mTOR y p-PI3K en tejidos tumorales de ratones desnudos portadores de tumores resistentes a fármacos

En comparación con el grupo modelo, la expresión de p-AKT en tejidos tumorales de ratones desnudos resistentes a los medicamentos en el grupo MTX disminuyó significativamente (P <0,001). Los niveles de expresión de p-AKT, p-mTOR y p-PI3K en tejidos tumorales de ratones desnudos en los grupos MTX-CPhG, CPhGs-H y CPhGs-M disminuyeron significativamente (P <0,001), la expresión de p-AKT en el grupo CPhGs-L disminuyó (P <0,01) y la expresión de p-mTOR y p-PI3K disminuyó de manera más significativa (P <0,001). En comparación con el grupo MTX, los niveles de expresión de p-AKT, p-mTOR y p-PI3K en tejidos tumorales de ratones desnudos en los grupos MTX-CPhGs y CPhGs-H también disminuyeron significativamente (P <0,001), la expresión de p-AKT en el grupo CPhGs-M disminuyó ligeramente (P <0,05), la expresión de p-mTOR y p-PI3K disminuyó más significativamente (P <0,001), La expresión de p-AKT en el grupo CPhGs-L disminuyó (P <0,01) y la expresión de p-mTOR y p-PI3K disminuyó de manera más significativa (P <0,001) (Figura 4-A a 4-D).

 

Tabla 2. Niveles de expresión de TNF- y IL-2 en suero en cada grupo (n=3)

Grupo	TNF- (pg/mL)	IL-2 (pg/mL)
Modelo	79.90 ± 3.60	28.36 ± 2.35
MTX	93.71 ± 2.86*	28.87 ± 1.60
MTX-CPhG	118.00 ± 3.78***###	40.92 ± 1.54***###
CPhG–H	122.76 ± 2.97***###	45.03 ± 4.95***###
CPhG–M	117.52 ± 3.60***###	41.44 ± 3.87***###
CPhG–L	124.19 ± 8.37***###	44.77 ± 2.31***###

 

Notas (como se muestra en la figura):Modelo=grupo de modelos; MTX=grupo metotrexato; CPhGs–L/M/H=grupo de glucósidos feniletanoide Cistanche en dosis baja/media/alta; Grupo de combinación MTX-CPhGs =. Importancia vs. Modelo: * P<0.05P<0.05P<0.05, ** P<0.01P<0.01P<0.01, *** P<0.001P<0.001P<0.001. Significance vs. MTX: ### P<0.001P<0.001P<0.001.

2.6 Efectos de las CPhG sobre la expresión de Bcl-2 y Bax en tejidos tumorales de ratones desnudos portadores de tumores resistentes a los medicamentos

En comparación con el grupo modelo, la expresión de Bax en tejidos tumorales de ratones desnudos resistentes a los medicamentos en todos los grupos de tratamiento aumentó significativamente (P <0,001), la expresión de Bcl-2 en el grupo de MTX aumentó (P <0,05) y la expresión de Bcl-2 en los grupos MTX-CPhG, CPhGs-H y CPhGs-M disminuyó significativamente (P <0,001). En comparación con el grupo de MTX, la expresión de Bcl-2 en tejidos tumorales de los grupos CPhGs-H, CPhGs-M, CPhGs-L y MTX-CPhGs disminuyó significativamente (P <0,001), y la expresión de Bax en los grupos CPhGs-H y CPhGs-M aumentó significativamente (P <0,001) (Figura 4-A, 4-E, 4-F). Además, indica que las CPhG pueden promover la apoptosis de células tumorales en ratones desnudos portadores de tumores resistentes a los medicamentos mediante la regulación de la expresión de Bcl-2 y Bax.

 

 

3 Discusión

La resistencia a la quimioterapia y la inmunosupresión en pacientes con OS son obstáculos en el tratamiento clínico de la OS. En la actualidad, el principal mecanismo de los fármacos antitumorales es promover la apoptosis de las células tumorales, lo que refleja directamente la eficacia de la quimioterapia; por otro lado, la inmunidad corporal es una fuerte garantía para que los pacientes toleren los fármacos quimioterapéuticos. Por lo tanto, es crucial estudiar cómo promover eficazmente la apoptosis de las células OS resistentes a los medicamentos y reducir el deterioro inmunológico inducido por la quimioterapia.

Figura 3. Tasa de apoptosis de células de tejido tumoral en cada grupo de ratones (n=3, %)

Nota: A. Grupo modelo; B. grupo metotrexato (MTX); C. Metotrexato combinado con el grupo de glucósidos totales de feniletanol de Cistanche deserticola (MTX-CPhG); D. Grupo de glucósidos totales de feniletanol (CPhGs-H) de Cistanche deserticola en dosis altas; E. Grupo de glucósidos totales de feniletanol (CPhGs-M) de Cistanche deserticola en dosis media; F. Grupo de glucósidos totales de feniletanol (CPhGs-L) de Cistanche deserticola en dosis bajas.

Tabla 3. Tasa de apoptosis de células de tejido tumoral en cada grupo (n=3)

Grupo	Tasa de apoptosis (%)
Modelo	14.47 ± 1.10
MTX	19.77 ± 1.32*
MTX-CPhG	29.21 ± 0.77***###
CPhG–H	31.66 ± 1.93***###
CPhG–M	30.13 ± 2.16***###
CPhG–L	22.49 ± 3.02**

Notas (como se muestra en la figura):Modelo=grupo de modelos; MTX=grupo metotrexato; CPhGs–L/M/H=grupo de glucósidos feniletanoide Cistanche en dosis baja/media/alta; Grupo de combinación MTX-CPhGs =. Importancia vs. Modelo: * P<0.05P<0.05P<0.05, ** P<0.01P<0.01P<0.01, *** P<0.001P<0.001P<0.001. Significance vs. MTX: ### P<0.001P<0.001P<0.001.

 

 

Cistanche deserticolaTiene efectos farmacológicos de calentar el riñón y reponer la esencia, humedecer los intestinos, antioxidante y mejorar la inmunidad. Zhang et al. [11] informó en 1988 que el extracto acuoso deCistanche deserticolapodría mejorar la función inmune y estimular el desarrollo de órganos inmunes como el timo en ratones. Posterioren vivoLos estudios encontraron además quecistancheLos polisacáridos tenían efectos contra el cáncer de pulmón y contra el sarcoma [12]. Los estudios han demostrado que los CPhG, el componente principal deCistanche deserticola, tiene efectos farmacológicos como antioxidante, antienvejecimiento, neuroprotección, mejora inmune, protección hepática y tratamiento de trastornos espermatogénicos [13], y también ejerce efectos antitumorales y de mejora inmune en varios tumores malignos, incluidos cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de mama y cáncer de ovario [14]. Nuestro estudio anterior encontró queCistanche deserticolapodría promover la apoptosis de células OS resistentes a los medicamentosin vitroreduciendo la expresión de MRP1 y proteínas P53 mutantes [15]. Este estudio encontró que el volumen y el peso del tumor en los grupos de tratamiento eran más pequeños que los del grupo modelo, y el volumen del tumor en diferentes grupos de concentración de CPhG y en el grupo de MTX-CPhG también era más pequeño que el del grupo de MTX, con una mayor tasa de inhibición del tumor. Esto indica que las CPhG pueden inhibir significativamente el crecimiento tumoral en ratones con tumores OS resistentes a los medicamentos, y el efecto inhibidor se correlaciona positivamente con la concentración de CPhG, lo que es básicamente consistente con el estudio de Hou et al. [16] sobre el efecto inhibidor de las CPhG en tumores trasplantados subcutáneos en ratones portadores de hepatoma H22.

La función inmune está estrechamente relacionada con la aparición y el desarrollo de tumores. IL-2 es un tipo de factor de crecimiento celular en el sistema inmunológico, que puede mejorar la función inmune del cuerpo al promover la proliferación y diferenciación de células T y producir células inmunes con actividad antitumoral [17]. El TNF- ejerce efectos antitumorales al unirse a receptores para inducir la apoptosis de las células tumorales, mejorar la función inmune del huésped, actuar sobre las células endoteliales vasculares del tumor, aumentar la permeabilidad vascular, inducir la muerte programada y, posteriormente, causar hemorragia y necrosis tumoral [18]. El análisis de la expresión de IL-2 y TNF- en suero en ratones de cada grupo mostró que los niveles de expresión de TNF- y IL-2 en suero en ratones modelo con tumores de diferentes grupos de concentración de CPhG y del grupo de MTX-CPhG aumentaron significativamente. Esto sugiere que las CPhG pueden mejorar la función inmune en ratones con tumores OS resistentes a los medicamentos al regular la expresión de TNF- y IL-2, inhibir la proliferación de células de osteosarcoma resistentes a los medicamentos y, por lo tanto, ejercer efectos antitumorales.

 

Figura 4. Diagrama de resultados de electroforesis de las proteínas p-mTOR, p-PI3K, p-AKT, Bcl-2 y Bax en tejido tumoral de ratones desnudos (x ± s, n=3, mm3)

Nota: Modelo, grupo de modelos; MTX, grupo metotrexato; MTX-CPhG, metotrexato combinado con el grupo de glucósidos totales de feniletanol de Cistanche deserticola; CPhGs-L, grupo de glucósidos totales de feniletanol de Cistanche deserticola en dosis bajas; CPhGs-M, grupo de glucósidos totales de feniletanol de Cistanche deserticola en dosis media; CPhGs-H, grupo de glucósidos totales de feniletanol de Cistanche deserticola en dosis altas; A. Resultados de Western Blot de las proteínas p-mTOR, p-PI3K, p-AKT, Bcl-2 y Bax; B. p-mTOR; C.p-PI3K; D. p-AKT; E. Bcl-2; F. Bax; En comparación con el grupo modelo, * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001; En comparación con el grupo de MTX, # P < 0,05, ## P < 0,01, ### P < 0,001.

 

La fosforilación de AKT en la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR puede regular directa o indirectamente una serie de factores relacionados con la apoptosis, como la familia Bcl-2, el inhibidor de la proteína de la apoptosis ligado al cromosoma X (XIAP), el doble minuto 2 de ratón (MDM-2) y la proteína X asociada a Bcl-2 (Bax) [19]. La vía de señalización PI3K/AKT/mTOR anormalmente activada puede regular positivamente la expresión de los transportadores de membrana ABCB1 y ABCC1, reduciendo así la eficacia de la quimioterapia y mediando la resistencia del sistema operativo a los fármacos quimioterapéuticos [20]. Una variedad de monómeros de la medicina tradicional china pueden promover la apoptosis de las células OS al inhibir la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR, como la procianidina B2, la quercetina, la luteolina yLactarius deliciosopolisacáridos [21]. Este estudio encontró que bajo la acción única de MTX, la expresión de la proteína p-AKT disminuyó significativamente, mientras que la expresión de las proteínas p-mTOR y p-PI3K no mostró diferencias significativas, lo que indica que el MTX tiene poco efecto en la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR en tejidos tumorales de ratones desnudos portadores de tumores resistentes a los medicamentos. Sin embargo, la expresión de las proteínas p-AKT, p-mTOR y p-PI3K en tejidos tumorales de ratones desnudos portadores de tumores OS resistentes a los medicamentos en diferentes grupos de concentración de CPhG y grupo de MTX-CPhG fue menor que la del grupo modelo, y también significativamente menor que la del grupo MTX, lo que revela que los CPhG tienen un efecto inhibidor significativo sobre la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR en células OS resistentes a los medicamentos. La detección por citometría de flujo de la apoptosis de las células tumorales mostró que la tasa de apoptosis tumoral en cada grupo aumentó significativamente después de la intervención farmacológica. La detección de la expresión de las proteínas Bax y Bcl-2 mostró que la expresión de Bax en tejidos tumorales de ratones desnudos portadores de tumores OS resistentes a los medicamentos en diferentes grupos de concentración de CPhG y en el grupo MTX-CPhG aumentó significativamente, mientras que la expresión de Bcl-2 en tejidos tumorales de ratones modelo en los grupos MTX-CPhG, CPhG-H y CPhG-M disminuyó significativamente. Esto sugiere que una cierta concentración de CPhG puede promover la apoptosis de células OS resistentes a los medicamentos.en vivoal inhibir la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR, regular negativamente la expresión de Bcl-2 y regular positivamente la expresión de Bax.

En conclusión, las CPhG pueden promover la apoptosis de células OS resistentes a los medicamentos e inhibir el crecimiento tumoral.en vivo, y su mecanismo puede lograrse inhibiendo la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR y regulando la expresión de Bcl-2 y Bax. Mientras tanto, las CPhG pueden mejorar la función inmune en ratones con tumores OS resistentes a los medicamentos al regular positivamente los niveles de expresión de TNF- y IL-2, ejerciendo así efectos antitumorales sinérgicos. Sin embargo, su potencial de aplicación clínica aún necesita más exploración e investigación.

 

Referencias

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