La melatonina previene la infiltración de linfocitos T en los riñones de ratas hipertensas, inducida por una dieta alta en sal, al prevenir la expresión de quimiocinas del ligando CXCR3
Mar 14, 2022
Para más información:ali.ma@wecistanche.com
ariel ataúd1, Rawan Jashab2, Yehonatán Sharabi1,2,3, Ehud Grossmann1,2,3y Avshalom Leibowitz1,2,3,*
1Medicina D, Centro Médico Chaim Sheba, Tel-Hashomer 5262000, Israel; arielbier@gmail.com (AB);Yehonatan.Sharabi@sheba.health.gov.il (YS); Ehud.Grossman@sheba.health.gov.il (EG)2 Hypertension Unit, the Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel;rawankhasbab@gmail.com3Facultad de Medicina Sackler, Universidad de Tel-Aviv, Tel-Aviv 6997801, Israel*
Resumen: En un estudio previo demostramos quemelatoninaprevieneriñóndaño en un modelo de hipertensión inducida por sal al disminuir el estrés oxidativo. Presumimos que este efecto involucra las propiedades inmunomoduladoras de la melatonina. Las ratas sensibles a la sal del estudio in vivo-Dahl (DSS) fueron alimentadas con comida normal, una dieta alta en sal (HSD) o un HSD ymelatonina(30 mg/kg/día) en su agua durante ocho semanas.Riñonesse recolectaron para el aislamiento y caracterización inmediatos de linfocitos por citometría de flujo (CD3 más CD4 más y CD3 más CD8 más) y para quimioatrayente de linfocitos (principalmente CXCLquimiocinas) estudios de expresión génica. Se cultivaron células mesangiales (RMC) en ratas de estudio in vitro en un medio con alto contenido de sal sin y conmelatonina. Un HSD se asoció con una infiltración renal significativa de linfocitos T CD4+ y CD8+ en comparación con el control. La melatonina redujo significativamente la infiltración de linfocitos renales. Un HSD aumentó significativamente la expresión de ARNm de CXCLquimiocinasAgregar melatonina al HSD eliminó este efecto. El tratamiento de las células RMC con sal aumentó la expresión de CXCL10 y CXCL11 pero no de CXCL9. agregandomelatoninaa los medios de cultivo impidieron este aumento. El tratamiento de ratas alimentadas con HSD con melatonina disminuyó la expresión de ARNm quimioatrayente de linfocitos renales y se asocia con una reducción significativa de la infiltración de linfocitos T renales. La sal puede tener un efecto directo sobre las células renales productoras de quimiocinas, que se ve mitigado por el tratamiento con melatonina.
Palabras clave:melatonina; sal; linfocitos T; hipertensión;riñón; CXCL 9; CXCL 10; CXCL 11
1. Introducción
La hipertensión arterial (HTA) es un importante factor de riesgo cardiovascular modificable. Debido al envejecimiento de la población, la prevalencia de HTA aumenta constantemente, alcanzando hasta el 30 por ciento en edades avanzadas [1]. A pesar de las diversas opciones terapéuticas médicas, el control mundial de la HTA es deficiente. Las consecuencias de la HTA no controlada son devastadoras y generan un enorme impacto negativo en la salud pública [2].
Varios factores conductuales, ambientales y genéticos están involucrados en la patogenia de la HTA. El alto contenido de sal en las dietas occidentales ha sido implicado como uno de los principales contribuyentes a la HTA y se asocia con una mayor morbilidad y mortalidad. Las guías e iniciativas públicas recomiendan reducir el consumo de sal en la población general. Sin embargo, no todas las personas pueden beneficiarse de esta restricción, ya que la fisiopatología que conecta la sensibilidad a la sal con la HTA no se comprende completamente y necesita una mejor comprensión del mecanismo [3]. Por lo tanto, las nuevas estrategias son cruciales para una mejor comprensión y control de la HTA, lo que hace que los nuevos paradigmas de investigación sean una necesidad inmediata.
Se ha encontrado que la inflamación y el estrés oxidativo están involucrados en la patogénesis de la HTA esencial. Mientras se investigan los factores desencadenantes que inician y continúan estos procesos, muchos modelos experimentales de HTA sugieren la participación de la respuesta inmune adaptativa [4].
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Las pistas que conectan la inmunidad adaptativa con la HTA ya existen desde la década de 1960. Sin embargo, solo recientemente, con una mejor comprensión del sistema inmunológico, se pudo lograr un progreso en esta dirección. Un estudio pionero de Guzik et al. demostraron que la angiotensina (Ang) II o la sal de desoxicorticosterona (DOC) HTN se embotó en ratones rag1-/-, que son deficientes en linfocitos T y B, y la transferencia adoptiva de células T, pero no células B, podría restaurar la respuesta de BP [5]. Desde este artículo, se encontró que varios componentes de la inmunidad adoptiva son relevantes para la patogenia de la HTA en la mayoría de los modelos animales comunes. El papel de las células T en el modelo de HTA inducida por sal también ha sido ampliamente estudiado. Los estudios in vitro muestran que la sal puede impulsar la diferenciación de células T vírgenes en células TH17 [6]. Numerosos trabajos in vivo en modelos de HTN inducida por dieta alta en sal (HSD), como en ratas Dhal sensibles a la sal (DSS), muestran una infiltración extensa de células T renales [7-9].
Entre los muchos procesos fisiológicos,melatoninala participación en la regulación de la presión arterial es algo intuitiva. El patrón circadiano de la presión arterial alentó una extensa investigación sobre la melatonina y la HTA. Muchos trabajos en el pasado, en humanos y en modelos experimentales, relacionaron los niveles bajos de melatonina con la HTA [10]. Hay algunos datos clínicos que sugieren que la suplementación con melatonina puede tratar la HTA, principalmente en pacientes con HTA nocturna [11]. Sin embargo, la inconsistencia de estos datos plantea dudas sobre si las propiedades de la melatonina no circadianas también están involucradas en la regulación de la presión arterial.
Las propiedades antiinflamatorias y antioxidantes de la melatonina han sugerido que la melatonina interactúa con el sistema inmunológico. Los datos emergentes han implicado el papel de la señalización de la melatonina en el desarrollo, la activación, la diferenciación y la memoria de las células T. Hay evidencia de quemelatoninalos receptores nucleares y de membrana están presentes en las células T [12,13].melatoninaafecta la producción de muchas citocinas involucradas en la respuesta inmune, como el interferón (IFN), que es un regulador fundamental de la respuesta Th1 [14].
El estrés oxidativo y la respuesta de las células T, según algunos investigadores, trabajan en conjunto para promover el desarrollo de la HTA y el daño por hipertensión de órganos [15]. En nuestro trabajo anterior demostramos quemelatoninadisminuye el estrés oxidativo local (renal) y previene la fibrosis renal inducida por la sal y la proteinuria en un modelo de rata HTN sensible a la sal (el modelo DSS) [16]. Dado que el estrés oxidativo tiene un papel fundamental en la respuesta inmunitaria adaptativa asociada a la HTA, planteamos la hipótesis de que las propiedades inmunomoduladoras de la melatonina son responsables de su función protectora en la HTA inducida por HSD.
El objetivo de este estudio es evaluar simelatoninadisminuye la respuesta de células T inducida por sal y dilucidar los mecanismos responsables de este efecto.
2. Materiales y métodos
2.1. Animales y protocolo de estudio
El protocolo de estudio fue aprobado por el comité institucional de ética animal del centro médico Sheba en Israel. Su estado de salud fue monitoreado midiendo el peso corporal y una observación general diaria de movimiento y condiciones de salud de cada animal. alojadas en una instalación para animales en jaulas normales (dos ratas por jaula) a 22 ◦C con un ciclo de 14 horas de luz/10 horas de oscuridad. Las ratas se mantuvieron con una dieta normal de sal y se les dio agua del grifo para beber ad libitum durante un período de aclimatación de cinco días. A continuación, las ratas se dividieron en tres grupos (n=8), según la dieta, durante un período de 8 semanas. Según el comité de ética, los animales que mostraran signos de enfermedad y sufrimiento debían ser sacrificados.
El grupo de control recibió una dieta estándar de comida para ratas (2018 SC; Teklad Envigo, Madison, WI, EE. UU.) y agua del grifo; el grupo de dieta alta en sal (HSD) recibió una dieta de sal enriquecida combinada (4 por ciento) (TD.120485; Teklad Envigo, Madison, WI, EE. UU.) y agua del grifo, y elmelatoninaEl grupo fue alimentado con la misma dieta enriquecida con sal (4 por ciento) con melatonina (M5250; Sigma, Rehovot, Israel) (30 mg/kg/día) en su agua potable. El peso corporal y el consumo de agua se midieron periódicamente. La cantidad correcta de melatonina se disolvió en las necesidades de agua de cada jaula para administrar la dosis correcta para cada animal. El día cero se define como el día de inicio del consumo de HSD y melatonina. Al final del estudio, las ratas fueron sacrificadas mediante anestesia profunda con isoflurano al 3 por ciento (la profundidad de la anestesia se confirmó apretando la pata trasera) y lasriñonesfueron cosechados. Ambos riñones fueron removidos y hemisectados. Los riñones se tomaron para el análisis de citometría de flujo a excepción de varias porciones que se extrajeron rápidamente y se congelaron rápidamente en N2 líquido y se almacenaron a -80 ◦C. Se usaron tejidos congelados para la extracción de ARN.
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2.2. PCR de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real
Los niveles de expresión de ARNm de los genes se determinaron en elriñóntejido mediante transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real-PCR (qRT-PCR). El ARN total se extrajo del tejido renal con un kit de ARN NucleoSpin (MACHERY-NAGEL, Düren, Alemania). La transcripción inversa se realizó con un kit de transcripción inversa de cDNA de alta capacidad de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Las reacciones de qRT-PCR se realizaron utilizando Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) y el sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500. Las condiciones de ciclado fueron: un primer paso simple de 95 ◦C por 0.20 min y luego 40 ciclos de etapa de fusión por 3 s a 95 ◦C y una etapa extendida de 30 s a 60 ◦C. Al final de los 40 ciclos, se realizó una etapa de curva de fusión. El ARNm de la subunidad P0 (Rplp0) del tallo lateral de la proteína ribosómica se utilizó como control interno. Los cebadores se enumeran en la Tabla 1.
Tabla 1. Lista de cebadores de ratas utilizados en este estudio.
2.3. Aislamiento de células T de los riñones
Después de retirar la cápsula renal, los dosriñonesse picaron y probaron con el émbolo de una jeringa de 2 ml a través de un filtro de células de 100 µm en RPMI 1640 que contenía 2 mML de glutamina, 10 % de FBS, 10 ug/ml de DNasa 1 (Stem Cells technologies, Cambridge, MA , EE. UU.) y 0,1 por ciento de colagenasa tipo IV (CLS 4, Worthington Decatur, AL, EE. UU.). La solución se incubó durante 25 min a 37 ◦C. A continuación, se añadió solución de lavado (DPBS/FBS al 2 por ciento/EDTA 2 mM) al homogeneizado de riñón hasta alcanzar los 45 ml y se filtró a través de un filtro celular de 70 µm. La solución se centrifugó a 400 × g/7 min. y el precipitado se suspendió en una solución de lavado de 5 ml y se filtró a través de un filtro celular de 40 µm y se volvió a centrifugar a 400 × g/7 min. El sedimento se resuspendió en 3 ml de FBS (EDTA 10 mM) y se dispuso en capas sobre Histopaque-1083 (Sigma, Rehovot, Israel), y se centrifugó a 20 ◦C a 400 × g/30 min sin freno. Se eliminó la capa de células mononucleares que descansaba sobre el Histopaque, se lavó dos veces con solución de lavado y se suspendió en 5 ml de solución de lavado para el análisis de citometría de flujo.
2.4. Citometría de flujo
De cada grupo,riñonesSe analizaron de 5 a 7 ratas. Para cada muestra se tomaron 1 × 106 células. Las células mononucleares aisladas se incubaron con marcadores extracelulares: anti-CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-0030-82, RRID:AB_465493) y su control de isotipo (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-4742-41, RRID :AB_10753770), anti-CD4 (Thermo FisherScientific Cat# 17-0040-80, RRID:AB_1210581) y su control de isotipo (Thermo Fisher Scientific Cat# 17-4724-81, RRID: AB_470188), anti-CD8 (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0084-82, RRID:AB_10548361) y su control de isotipo (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-4714-80,RRID: AB_657914). Todas las células se analizaron mediante citometría de flujo (BD FACSCalibur Flow Cytometry System, RRID: SCR_000401) utilizando el software FlowJo (FlowJo, RRID: SCR-008520).
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2.5. Cultivo de células
La línea celular de rata mesangial, RMC (ATCC Cat# CRL{{0}}, RRID: CVCL_0506), se obtuvo de ATCC®. La célula se cultivó en medio Eagle modificado de Dulbecco (01-055-1A, industrias biológicas, Beit HaEmek, Israel) con L-glutamina 4 mM ajustada para contener 1,5 g/L de bicarbonato de sodio y 4,5 g/L de glucosa y suplementada con 0,4 mg/mLLG418 y suero bovino fetal al 15 por ciento. La melatonina se obtuvo de Sigma (M5250 Rehovot, Israel). A 250 mMmelatoninase hizo stock en etanol. Las células se cultivaron en condiciones normales o con alto contenido de sal (añadiendo NaCl 80 mM al medio) sin o con melatonina (0,5 mM). El tratamiento con melatonina se programó 45 min antes de agregar NaCl al medio. Todos los experimentos se realizaron en placas de 6 pocillos con 3 × 105 células por pocillo y se realizaron en 6 ensayos independientes.
2.6. Análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron con IBMSPSS Statistics, RRID: SCR_019096. El análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y el método posthoc de Tukey examinaron las diferencias entre los grupos. Los datos de qPCR en tiempo real se analizaron mediante DataAssist, RRID: SCR_014969.
3. Resultados
3.1. La melatonina protege a las ratas que consumen un HSD
La edad de las ratas durante este estudio fue de 4 a 13 semanas. A esta edad, el bienestar de las ratas está indicado por el aumento de peso que mostró el grupo de control [17]. Sin embargo, el grupo HSD alcanzó una meseta en el día 30 y la adición demelatoninaal HSD mejoró este fenómeno (Figura 1A). El grupo HSD exhibió una alta tasa de mortalidad, donde el 50 por ciento de las ratas murió o tuvo una condición clínica que requirió eutanasia de acuerdo con las reglas del comité de ética animal, durante el período experimental. Los suplementos de melatonina previnieron significativamente la mortalidad de las ratas, donde solo una de cada ocho ratas murió el día 58, al final del período experimental (Figura 1B).
Figura 1.melatoninapresión arterial mejorada y supervivencia en HSD. Las ratas DSS se trataron durante 9 semanas con HSD con y sin melatonina. Una dieta rica en sal redujo el peso corporal a partir del día 36 y la melatonina moderó este efecto (A). HSD aumentó la tasa de mortalidad desde el día 40. El tratamiento de ratas alimentadas con HSD con melatonina mejora su supervivencia. (B). (n=8) *-p Menor o igual a 0.05 sal y sal más melatonina versus control. #-p Menor o igual a 0,05 de sal versus control y sal más melatonina. HSD: dieta rica en sal.
3.2. La melatonina previene la infiltración de células T renales inducida por HSD
Aislamos células de lariñóny los conectó al marcador de células T, CD3. Las células CD3 plus se sincronizaron con CD4 y CD8. Tanto CD3 más CD4 más como CD3 más CD8 más fueron significativamente más altos en el HSD (5.18 ± 1.62 y 4.6 ± 0.75 por ciento, respectivamente) en comparación con el control (0.16 ± {{18} }.{{20}}2 y 0,95 ± 0,15 por ciento, respectivamente) ymelatoninala suplementación con HSD redujo tanto las células CD3 más CD4 más como las CD3 más CD8 más a los niveles de control (0.68 ± 0.21 y 1.37 ± 0.45, respectivamente) (Figura 2A–D).
Figura 2. La melatonina previene la infiltración de células T alriñón. Las células T se aislaron de riñones de ratas y se seleccionaron para CD3. Las células CD3-positivas se seleccionaron para CD4 y CD8. La melatonina (C) redujo tanto CD3 más CD4 más como CD3 más CD8 más en comparación con HSD sin melatonina (B) sin diferencia con el grupo de control (A). El análisis para todas las ratas se muestra en (D) (n=7–8). HSD: dieta rica en sal. *-p Menor o igual que 0.05 versus control. #-p Menor o igual a 0,05 versus sal más melatonina.
3.3. La melatonina reduce ciertas quimiocinas renales que estaban reguladas al alza en HSD
El reclutamiento de células T en los tejidos inflamatorios está regulado por la expresión de quimiocinas locales. Por lo tanto, medimos la expresión de dos familias de quimiocinas en la sangre de la rata.riñones: la familia de ligandos de quimiocinas (motivo CXC) (CXCL) y la familia de ligandos de quimiocinas (motivo C-C) (CCL).
Para la familia CXCL, CXCL 9, 10 y 11, que atraen células T a su tejido diana usando el receptor CXCR3 en las células T, se regularon significativamente en ratas HSD. La suplementación demelatoninaa HSD redujeron su expresión a niveles de control. Se detectó el mismo patrón para CXCL 1 y 16. Sin embargo, para CXCL12, no se detectó regulación positiva en HSD (Figura 3A).
Para la familia CCL, CCL 2, 4, 12, 17, 19 y CX3CL1 no mostraron una regulación positiva en HSD. CCL3 se reguló positivamente en HSD, pero no se detectaron cambios significativos con la adición de melatonina a la dieta. Para CCL7, una regulación al alza significativa en el HSD y una regulación a la baja significativa con la adición demelatoninaal HSD fue detectado (Figura 3B).
Figura 3. Regulación positiva deriñónquimiocinasen HSD con y sin melatonina. La expresión de la familia de ligandos de quimiocinas (motivo CXC) (CXCL) (A), la familia de ligandos de quimiocinas (motivo CC) y CX3CL1 (B) se determinó en las ratas. (n=7–8) *-p Menor o igual que 0.05 versus control. #-p Menor o igual a 0,05 versus sal más melatonizante. HSD: dieta rica en sal.
3.4. El efecto directo de la melatonina en la línea celular mesangial RMC
Luego nos enfocamos en CXCL9, 10 y 11 que atraen células T al unirse al receptor CXCR3. Determinamos la expresión de estosquimiocinasen células RMC que son una línea de células mesangiales de rata.
Tratamos las células con NaCl 80 mM sin y con 0,5 mMmelatonina. Esta concentración de NaCl aumentó significativamente la expresión de CXCR10 en 2,4 ± 0.26-veces en comparación con el control, y la adición de 0,5 mM de melatonina disminuyó significativamente esta expresión a 1,4 ± 0.{{10}} veces en comparación con el control (Figura 4A). Para CXCL11, NaCl 80 mM aumentó significativamente la expresión en 3 ± 0.48-veces en comparación con el control, y la adición de melatonina 0,5 mM disminuyó significativamente esta expresión a 1,8 ± 0.{{22 }} veces en comparación con el control (Figura 4B). CXCL9 no se detectó en células RMC.
Figura 4. Expresión de CXCL10 y CXCL11 regulada al alza por la sal en una línea celular mesangial en la que el tratamiento con melatonina reguló a la baja su expresión. Se trataron RMC (línea celular mesangial de rata) con sal 80 mM con y sin melatonina 0,5 mM. CXCL10 (A) y CXCL11 (B) aumentaron mediante tratamiento con sal y la adición demelatoninareducir esta regulación al alza. Los gráficos presentan 6 ensayos independientes. *-p Menor o igual a 0.001 versus control #-p Menor o igual a 0.005 versus sal 80 mM y melatonina 0,5 mM. $-p menor o igual a 0,05 versus sal 80 mM y melatonina 0,5 mM.
4. Discusión
El efecto beneficioso demelatoninasobre la HTA se demostró en estudios previos y se sugirió como un posible curso de acción para la HTA resistente al tratamiento [18]. En nuestro primer estudio, nos enfocamos en el estrés oxidativo y revelamos que la melatonina reduce el estrés oxidativo inducido por HSD. En el presente estudio, nos centramos en el efecto inmunitario adaptativo y demostramos que la melatonina mejora la supervivencia de las ratas alimentadas con HSD. Este efecto está asociado con una reducción de las células T que se infiltran en el riñón y la regulación a la baja deriñónexpresión de quimiocinas.
Los datos históricos demuestran que las ratas DSS que consumen un HSD desarrollan HTN grave y exhiben tasas de mortalidad más altas [19]. El propio Dahl informó, mientras establecía el modelo, que cuando las ratas DSS se colocaron en un HSD (8 por ciento de NaCl) al destete (21 a 23 días de edad), desarrollaron HTA rápidamente y todas murieron a las 16 semanas de alimentación con sal [20]. Posteriormente, tras algunas modificaciones de la cepa, Rapp et al. informaron que todas las ratas estaban muertas dentro de las ocho semanas posteriores al HSD (8 por ciento de NaCl) [21]. Las ratas de nuestro estudio tenían una alta tasa de mortalidad pero no llegaban al 100 por ciento, probablemente debido al menor porcentaje (4 por ciento) de sal en su dieta. No obstante, es obvio quemelatoninala suplementación previno significativamente la mortalidad de ratas.
El aumento de peso es un marcador del bienestar de las ratas a la edad de 4 a 13 semanas. DSS ratsoriginate de Sprague Dawley, que es una cepa bien caracterizada. A la edad de las ratas que usamos en nuestros experimentos, se supone que las ratas aumentan de peso constantemente [22]. En muchos estudios con animales, la reducción de peso se considera como uno de los "puntos finales" de los experimentos [23]. A partir de varios estudios, está claro que un HSD en ratas DSS da como resultado tasas de aumento de peso más bajas en comparación con los controles [24,25]. De acuerdo con estos estudios, también observamos diferencias de peso entre los grupos. Aquí, las ratas no aumentaron de peso después de cuatro semanas de HSD. La melatonina también detuvo este efecto de la HSD, ya que las ratas que fueron tratadas con melatonina continuaron aumentando de peso, aunque menos que los controles.
la habilidad demelatoninapara reducir la presión arterial en modelos animales se descubrió a finales de los setenta del siglo XX [26–28]. Desde entonces, se informó en varios otros modelos, como que una dieta alta en fructosa induce síndrome metabólico en ratas espontáneamente hipertensas [29,30]. Nuestros estudios en este campo son los primeros en demostrar que la melatonina juega un papel en la HTA inducida por la sal al prevenir el daño orgánico y reducir la mortalidad.
En este estudio, hemos demostrado que un HSD induce la infiltración de linfocitos T en elriñón, un proceso que ha sido descrito en ratas DSS principalmente por el grupo de Mattson [31-33]. El papel fundamental de este proceso de infiltración en el modelo DSS ha sido demostrado por un estudio reciente que observó que las ratas DSS deficientes en células T están protegidas contra La HTA inducida por una HSD y una transferencia de esplenocitos exacerba la HTA sensible a la sal [34].
La melatonina puede afectar a las células T en varios aspectos (para una revisión, consulte [35]). Este estudio ha demostrado por primera vez quemelatoninareduce la atracción de las células T CD4 plus y CD8 plus alriñónen HSD. Este efecto de la melatonina puede ser el mecanismo que subraya su efecto beneficioso en este modelo.
La capacidad de la melatonina para reducir la infiltración de células T se ha descrito en el modelo experimental de ratones con encefalomielitis autoinmune (EAE). En EAE, se demostró que la melatonina reduce la infiltración de células T CD4 plus y células Th17 en el SNC [36,37].
La atracción de células T a un tejido específico está regulada principalmente por altas concentraciones locales dequimiocinasque son citocinas quimiotácticas que controlan los patrones migratorios y el posicionamiento de las células inmunitarias. Dos grandes familias de quimiocinas que inducen la infiltración de células T son las familias de quimiocinas del ligando motivo CXC (CXCL) y el ligando motivo CC (CCL) [38].
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En nuestro estudio, no encontramos un patrón constante en la respuesta de la familia CCL a un HSD y amelatonina. de los nuevequimiocinasen esta familia, solo se observó que CCL7 y CLL21 aumentaron su expresión debido a HSD, y la suplementación con melatonina la redujo. Un HSD aumentó la expresión de CCL3, pero no se detectó ninguna reducción en las ratas tratadas con melatonina. Un estudio reciente en el mismo modelo ha demostrado que un HSD regula positivamente CCL2 en elriñónutilizando el método RNA-Seq [39]. Sin embargo, este estudio probó los niveles los días 3 y 21 después de comenzar la dieta. En nuestro estudio, probamos los niveles después de ocho semanas. Es posible que la expresión de quimioquinas cambie durante el período HSD.
Por el contrario, los niveles de la mayoría de la familia CXCL, incluidos CXCL 1, 9, 10, 11 y 16, aumentaron en las ratas tratadas con HSD ymelatoninala suplementación eliminó este incremento. Solo CXCL12 no mostró aumento en respuesta a HSD.
CXCL9, CXCL10 y CXCL11, denominados "ligandos del receptor 3 de quimiocinas CXC inducibles por interferón", son inducidos por IFN- y son los ligandos del receptor 3 de quimiocinas CXC (CXCR3). Estudios in vivo han demostrado su importancia en la activación y reclutamiento de linfocitos T al órgano diana [40-42]. Youn et al. mostró, en pacientes hipertensos humanos, tanto la infiltración renal de células T como los niveles circulantes elevados de los tres CXCR3quimiocinas, lo que sugiere que CXCR3 y sus ligandos son relevantes para las células T implicadas en la HTA humana [43]. Otro estudio ha demostrado que CXCL10 está elevado en pacientes hipertensos, y sus niveles se correlacionan con sus valores de presión arterial [44].
Debido a estos estudios, nos enfocamos en CXCL9, CXCL10 y CXCL11. Cultivamos la línea celular de rata mesangial y las tratamos con NaCl 80 mM y melatonina 0,5 mM. Descubrimos que CXCL 10 y 11 están regulados al alza en las células y la melatonina anula esta elevación. Nuestros resultados indican que el efecto de la sal en la elevación de CXCL 10 y 11, y el efecto opuesto demelatonina, fueron ambos detectados directamente en células mesangiales. Por el contrario, CXCL9 no se detectó en estas células.
Nuestro estudio tiene limitaciones. En nuestros resultados de FACS, muchos de los CD3 plus fueron doblemente negativos tanto para CD4 como para CD8. Los mismos resultados se observaron en el estudio de Mattson de 2010 [31]. Sin embargo, en estudios más recientes del grupo de Mattson, las células CD3 más CD4-CD8-fueron muy pocas [32,33,45,46]. La disminución significativa de las células CD3 doble negativas podría ser el resultado de agregar el marcador CD45 y analizar solo las células que eran CD45 positivas, que es lo que se llevó a cabo en los estudios posteriores de Mattson. Es posible que la gran población de CD3 más CD4-CD8- sea un artefacto. Sin embargo, no se conoce ningún artefacto para la población de células CD3 más CD4 más y CD3 más CD8 más.
5. Conclusiones
En conclusión, una dieta alta en sal está asociada con la infiltración de células T en elriñonesde ratas DSS. La sal también aumentó la expresión de quimioatrayentes específicos de células T en el riñón. Tratamiento conmelatonina(30 mg/kg/día) abolió estos efectos (melatoninareduce la infiltración inducida por HSD de células T en los riñones junto con una reducción en la expresión de quimioquinas del ligando CXCL3).
Nuestro estudio in vitro demuestra que la sal y la melatonina pueden regular la expresión de quimioatrayentes al afectar directamenteriñóncélulas.
Contribuciones de los autores: Conceptualización, AL; análisis formal, AB y RK; investigación, RK; metodología, AB y AL; redacción—borrador original, AB y AL; redacción—revisión y edición, YS y EG Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.
Financiamiento: Esta investigación no recibió financiamiento externo.
Declaración de la Junta de Revisión Institucional: El protocolo de estudio fue aprobado por el comité institucional de ética animal en el centro médico Sheba, protocolo No. 1219/19/ANIM y Ministerio de Salud, protocolo No. 16418.
Declaración de consentimiento informado: No aplicable.
Declaración de disponibilidad de datos: Los datos presentados en este estudio están disponibles previa solicitud al autor correspondiente.
Agradecimientos: Los autores agradecen a Zehava Shabtai por su excelente apoyo técnico ya Michael Kanovsky por sus servicios editoriales.
Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés.
Referencias
1. Olsen, MH; Angell, SY; Asma, S.; Boutouyrie, P.; Hamburguesa, D.; Chirinos, JA; Damasceno, A.; Delles, C.; Giménez-Roqueplo, AP; Hering, D.; et al. Un llamado a la acción y una estrategia de curso de vida para abordar la carga global de presión arterial elevada en las generaciones actuales y futuras: La Comisión Lancet sobre hipertensión. Lancet 2016, 388, 2665–2712. [Referencia cruzada]
2. O'Brien, E. La Comisión Lancet sobre hipertensión: Abordar la carga global de la presión arterial elevada en las generaciones actuales y futuras. J. Clin. Hipertensión 2017, 19, 564–568. [Referencia cruzada]
3. O'Donnell, M.; Mente, A.; Yusuf, S. Ingesta de sodio y salud cardiovascular. Circ. Res. 2015, 116, 1046–1057. [Referencia cruzada]
4. Schiffrin, EL Mecanismos de remodelación de pequeñas arterias, terapia antihipertensiva y el sistema inmunológico en hipertensión.Clin. investigando Medicina. 2015, 38, E394–E402. [Referencia cruzada]
5. Guzik, TJ; Hoch, NE; Marrón, KA; McCann, LA; Rahman, A.; Dikalov, S.; Goronzy, J.; Weyand, C.; Harrison, DG Papel de las células T en la génesis de la hipertensión y la disfunción vascular inducidas por angiotensina II. Exp. J. Medicina. 2007, 204, 2449–2460. [Referencia cruzada][PubMed]
6. Kleinewietfeld, M.; Manzel, A.; Titze, J.; Kvakan, H.; Yosef, N.; enlazador, RA; Müller, DN; Hafler, DA El cloruro de sodio impulsa la enfermedad autoinmune mediante la inducción de células patógenas TH17. Naturaleza 2013, 496, 518–522. [Referencia cruzada]
7. Mattson, DL; Lund, H.; Guo, C.; Rudemiller, N.; Geurts, AM; Jacob, H. La mutación genética del gen 1 activador de la recombinación en ratas sensibles a la sal Dahl atenúa la hipertensión y el daño renal. Soy. J. Physiol. Reg. Entero. compensación Fisiol. 2013, 304, 407–414. [Referencia cruzada]
8. Mattson, DL Infiltración de células inmunitarias en elriñónen la hipertensión sensible a la sal y la lesión renal. Soy. J. Physiol. Ren. Physiol.2014, 307. [CrossRef] [PubMed]
9. Lu, X.; Crowley, SD Inflamación en hipertensión sensible a la sal y daño renal. actual Hipertens Rep. 2018, 20. [CrossRef][PubMed]
10. Panadero, J.; Kempinski, K. Papel demelatoninaen la regulación de la presión arterial: un agente antihipertensivo adjunto. clin. Exp. Pharm.Physiol. 2018, 45, 755–766. [Referencia cruzada] [PubMed]
11. Grossman, E.; Laudon, M.; Zisapel, N. Efecto de la melatonina sobre la presión arterial nocturna: metanálisis de ensayos controlados aleatorios. vasco Gestión de Riesgos Sanitarios 2011, 7, 577–584. [Referencia cruzada] [PubMed]
12. Pozo, D.; Delgado, M.; Fernández-Santos, JM; Calvo, JR; Gomáriz, RP; Martín-Lacave, I.; Ortiz, GG; Guerrero, JM Expressionof the Mel1a-melatonin receptor mRNA in T and B subsets of linfocitos from rat thymus and bazo. Faseb J. Off. publ. Fed.Am. Soc. Exp. Biol. 1997, 11, 466–473. [Referencia cruzada]
13. Guerrero, JM; Pozo, D.; García-Mauriño, S.; Osuna, C.; Molinero, P.; Calvo, JR Implicación de los receptores nucleares en la producción mejorada de IL-2 por melatonina en células Jurkat. Ana. Academia de Nueva York. ciencia 2000, 917, 397–403. [Referencia cruzada] [PubMed]
14. Farez, MF; Mascanfroni, ID; Méndez-Huergo, SP; Yesté, A.; Murugaiyan, G.; Garó, LP; Balbuena Aguirre, ME; Patel, B.;Ysrraelit, MC; Zhu, C.; et al.melatoninaContribuye a la estacionalidad de las recaídas de esclerosis múltiple. Celda 2015, 162, 1338–1352.[CrossRef] [PubMed]
15. Kirabo, A.; Fontana, V.; de Faria, APC; Lopereña, R.; Galindo, CL; Wu, J.; Bikineyeva, AT; Dikalov, S.; Xiao, L.; Chen, W.; et al. Las proteínas modificadas con isocétales DC activan las células T y promueven la hipertensión. J. Clin. investigando 2014, 124, 4642–4656. [Referencia cruzada][PubMed]
16. Leibowitz, A.; Volkov, A.; Voloshin, K.; Shemesh, C.; Barshack, I.; Grossman, E. La melatonina previeneriñónlesión en un modelo de hipertensión inducida por una dieta alta en sal al disminuir el estrés oxidativo. Res. J. Pineal. 2016, 60, 48–54. [Referencia cruzada] [PubMed]
17. Hawkins, P.; Morton, DB; Burman, O.; Dennison, N.; Honess, P.; Jennings, M.; Carril, S.; Middleton, V.; Roughan, JV; Wells, S.; et al. Una guía para definir e implementar protocolos para la evaluación del bienestar de los animales de laboratorio: Undécimo informe del Grupo de Trabajo Conjunto sobre Refinamiento de la BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW. Laboratorio. Animación 2011, 45, 1–13. [Referencia cruzada]
18. Simko, F.; Reiter, RJ; Paulis, L.melatoninacomo alternativa racional en el tratamiento conservador de la hipertensión arterial resistente. Hipertens Res. 2019, 42, 1828–1831. [Referencia cruzada] [PubMed]
19. Rapp, JP Dahl Ratas susceptibles a la sal y resistentes a la sal. Hipertensión 1982, 4, 753–763. [Referencia cruzada]
20. Dahl, LK; Knudsen, KD; Heine, MA; Leitl, GJ Efectos de la ingestión crónica de exceso de sal. Modificación de la hipertensión experimental en la rata por variaciones en la dieta. Circ. Res. 1968, 22, 11–18. [Referencia cruzada] [PubMed]
21. Rap, JP; Dene, H. Desarrollo y características de cepas consanguíneas de ratas Dahl sensibles a la sal y resistentes a la sal. Hypertens 1985, 7, 340–349. [Referencia cruzada]
22. Brower, M.; Gracia, M.; Kotz, CM; Koya, V. Análisis comparativo de las características de crecimiento de ratas Sprague Dawley obtenidas de diferentes fuentes. Laboratorio. Anim Res. 2015, 31, 166–173. [Referencia cruzada]
23. Talbot, SR; Biernat, S.; Bleich, A.; van Dijk, RM; Ernst, L.; Hager, C.; Hilgers, SOA; Koegel, B.; Koska, I.; Kuhla, A.; et al. Definiendo la reducción del peso corporal como un criterio de valoración humano: una evaluación crítica. Laboratorio. Anim 2020, 54, 99–110. [Referencia cruzada] [PubMed]
24. Geschka, S.; Kretschmer, A.; Sharkovska, Y.; Evgenov, OV; Lawrence, B.; Hucke, A.; Hocher, B.; Stasch, J.-P. La estimulación con guanilatociclasa soluble previene la remodelación del tejido fibrótico y mejora la supervivencia en ratas Dahl sensibles a la sal. PLoS UNO 2011, 6,e21853. [Referencia cruzada] [PubMed]
25. Wang, Y.; Mu, JJ; Liu, FQ; Ren, KY; Xiao, HY; Yang, Z.; Yuan, ZY La transición de epitelio a mesenquima inducida por sal en ratas sensibles a Dahlsalt depende de la presión arterial elevada. Brasil. J.Med. Biol. Res. Rev. Brás. Pesquisa Med. E Biol. 2014, 47, 223–230. [Referencia cruzada]
26. Holmes, SO; Sugden, D. Actas: El efecto de la melatonina sobre la hipertensión inducida por pinealectomía en ratas. Hermano J. Pharm. 1976, 56, 360P–361P.
27. Zanoboni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W. Hipertensión experimental en ratas pinealectomizadas. Ciencias de la vida 1967, 6, 2327–2331. [Referencia cruzada]
28. Zanoboni, A.; Forni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W.; Zanussi, C. Efecto de la pinealectomía sobre la presión arterial y la ingesta de alimentos y agua en la rata. J. Endocrinol. investigando 1978, 1, 125–130. [Referencia cruzada] [PubMed]
29. Pechanová, O.; Zicha, J.; Paulis, L.; Zenebe, W.; Dobesová, Z.; Kojsová, S.; Jendeková, L.; Sládková, M.; Dovinová, I.; Simko, F.; et al. El efecto de la N-acetilcisteína y la melatonina en ratas adultas espontáneamente hipertensas con hipertensión establecida. EUR. J.Pharmcol. 2007, 561, 129–136. [Referencia cruzada] [PubMed]
30. Leibowitz, A.; Péleg, E.; Sharabi, Y.; Shabtai, Z.; Shamiss, A.; Grossman, E. El papel demelatoninaen la patogénesis de la hipertensión en ratas con síndrome metabólico. Soy. J. Hypertens 2008, 21. [CrossRef] [PubMed]
31. De Miguel, C.; Das, S.; Lund, H.; Mattson, DL Los linfocitos T median la hipertensión yriñóndaños en ratas sensibles a la sal de Dahl. Soy. J. Physiol. Reg. Entero. compensación Fisiol. 2010, 298, R1136–R1142. [Referencia cruzada] [PubMed]
32. Evans, LC; Petrova, G.; Kurth, T.; Yang, C.; Bukowy, JD; Mattson, DL; Cowley, AW El aumento de la presión de perfusión impulsa la infiltración renal de células T en la rata sensible a la sal de Dahl. Hipertensión 2017, 70, 543–551. [Referencia cruzada]
33. Abais-Battad, JM; Alsheij, AJ; Pan, X.; Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Roberts, ML; Kriegel, AJ; Cowley, AWJ; Kidambi, S.; et al. Efectos dietéticos sobre la hipertensión sensible a la sal de Dahl, el daño renal y el transcriptoma de linfocitos T. Hypertens 2019, 74, 854–863. [Referencia cruzada] [PubMed]
34. Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Zmaj, J.; Mattson, DL La transferencia de esplenocitos exacerba la hipertensión sensible a la sal en ratas. Exp. Fisiol. 2020, 105, 864–875. [Referencia cruzada] [PubMed]
35. Ren, W.; Liu, G.; Chen, S.; Yin, J.; Wang, J.; Bronceado, B.; Wu, G.; Bazer, FW; Peng, Y.; Iluminado.; et al. Señalización de melatonina en células T: funciones y aplicaciones. Res. J. Pineal. 2017, 62. [Referencia cruzada]
36. Álvarez-Sánchez, N.; Cruz-Chamorro, I.; López-González, A.; Utrilla, JC; Fernández-Santos, JM; Martínez-López, A.; Lardone, PJ; Guerrero, JM; Carrillo-Vico, A. La melatonina controla la encefalomielitis autoinmune experimental al alterar el equilibrio regulador/efector T. Comportamiento cerebral. inmune 2015, 50, 101–114. [Referencia cruzada]
37. Chen, S.-J.; Huang, S.-H.; Chen, J.-W.; Wang, K.-C.; Yang, Y.-R.; Liu, P.-F.; Lin, G.-J.; Sytwu, H.-K.melatoninamejora la expresión de interleucina 10 y suprime la quimiotaxis para inhibir la inflamación in situ y reducir la gravedad de la autoinmuneencefalomielitis experimental. En t. inmunofarmaco. 2016, 31, 169–177. [Referencia cruzada] [PubMed]
38. Griffith, JW; Sokol, CL; Lustre, ADquimiocinasy receptores de quimiocinas: posicionamiento de las células para la defensa y la inmunidad del huésped.Annu. Rev. Inmunol. 2014, 32, 659–702. [Referencia cruzada] [PubMed]
39. Alsheij, AJ; Dasinger, JH; Abais-Battad, JM; Fehrenbach, DJ; Yang, C.; Cowley, AWJ; Mattson, DL CCL2 media la infiltración leucocitaria renal temprana durante la hipertensión sensible a la sal. Soy. J. Physiol. Ren. Fisiol. 2020, 318, F982–F993. [Referencia cruzada][PubMed]
40. Liu, L.; Callahan, MK; Huang, D.; Ransohoff, RM Receptor de quimioquinas CXCR3: Un enigma inesperado. actual Parte superior. desarrollo Biol.2005, 68, 149–181. [Referencia cruzada] [PubMed]
41. Novio, JR; Lustre, ligandos AD CXCR3: funciones redundantes, colaborativas y antagónicas. inmunol. Biol celular. 2011, 89,207–215. [Referencia cruzada] [PubMed]
42. Van Raemdonck, K.; Van den Steen, PE; Liekens, S.; Van Damme, J.; Struyf, S. CXCR3 ligandos en enfermedad y terapia. CytokineGrowth Factor Rev. 2015, 26, 311–327. [Referencia cruzada] [PubMed]
43. Youn, J.-C.; Yu, HT; Lim, BJ; Koh, MJ; Lee, J.; Chang, D.-Y.; Choi, YS; Lee, S.-H.; Kang, S.-M.; Jang, Y.; et al. CD8 inmunosenescente más células T y receptor de quimiocinas CXC tipo 3quimiocinasaumentan en la hipertensión humana. Hipertensión 2013, 62, 126–133.[CrossRef] [PubMed]
44. Stumpf, C.; Auer, C.; Yilmaz, A.; Lewczuk, P.; Klinghammer, L.; Schneider, M.; Daniel, GT; Schmieder, RE; Garlichs, CDLos niveles séricos de la proteína inducible por interferón-gamma Th1 quimioatrayente (IP) 10 están elevados en pacientes con hipertensión esencial. Hipertensos Res. 2011, 34, 484–488. [Referencia cruzada] [PubMed]
45. Rudemiller, NP; Lund, H.; Priestley, JRC; Endres, BT; Prokop, JW; Jacob, HJ; Geurts, AM; Cohen, EP; Mattson, DL La mutación de SH2B3 (LNK), un candidato de estudio de asociación de todo el genoma para la hipertensión, atenúa la hipertensión sensible a la sal de Dahl a través de la modulación inflamatoria. Hipertensión 2015, 65, 1111–1117. [Referencia cruzada] [PubMed]
46. Wade, B.; Petrova, G.; Mattson, DL Papel de los factores inmunitarios en la hipertensión inducida por angiotensina II y el daño renal en ratas sensibles a Dahlsalt. Soy. J. Physiol. Reg. Entero. compensación Fisiol. 2018, 314, R323–R333. [Referencia cruzada] [PubMed]